專利名稱：一種大豆中分離的種子特異性啟動子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是指大豆硬脂酸-ACP脫飽和酶基因啟動子的序 列克隆及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
大豆是重要的糧食作物和油料作物，在世界范圍內(nèi)約有7000多萬公頃的種植面 積。大豆籽粒中含有豐富的蛋白質(zhì)、脂類和多種營養(yǎng)元素，磷、鐵、鈣礦質(zhì)比其他作物高幾 十倍，并含有多種維生素，特別是大豆中含有人體不能合成的8種必需氨基酸，是其他谷類 作物不能比擬的。大豆不僅是人類蛋白和脂類的主要來源，醫(yī)療保健作用非常重要。轉(zhuǎn)基因大豆盡管有很多爭議，但與傳統(tǒng)大豆相比有很多應(yīng)用方面的優(yōu)勢。在轉(zhuǎn)基 因大豆中增加或降低某些物質(zhì)含量，實(shí)現(xiàn)外源目的基因在轉(zhuǎn)基因大豆中正常、有效表達(dá)，而 轉(zhuǎn)基因表達(dá)的調(diào)控主要是通過合適的啟動子來實(shí)現(xiàn)的，因此，選擇合適的植物啟動子并改 進(jìn)其活性是調(diào)節(jié)外源基因表達(dá)首先要考慮的問題。目前已經(jīng)分離得到了許多植物的啟動 子，不同的植物啟動子能使基因具有不同的表達(dá)特性。植物基因工程中常用的啟動子按其 功能及作用方式可分為三類組成型啟動子、組織特異性啟動子和誘導(dǎo)型啟動子。組成型啟 動子能夠調(diào)控下游基因在植物的在不同組織、器官及不同發(fā)育階段都表達(dá)，受外界環(huán)境因 素的影響不大，RNA和蛋白表達(dá)量比較恒定；誘導(dǎo)型啟動子是在某些特定的物理或化學(xué)的 刺激下，啟動子可以大幅度地提高基因的轉(zhuǎn)錄水平；組織特異性啟動子又稱器官特異性啟 動子，調(diào)控基因的表達(dá)往往只限于某些特定的器官或組織，表現(xiàn)發(fā)育調(diào)控的特性。目前在植 物表達(dá)載體中廣泛應(yīng)用的是組成型啟動子，在該類啟動子的調(diào)控下，外源基因在轉(zhuǎn)基因植 物的所有部位和發(fā)育階段都會表達(dá)，造成植物營養(yǎng)不必要的浪費(fèi)，往往還會引起受體植物 的形態(tài)發(fā)生變化，有時還會影響到植物的正常生長發(fā)育。種子特異性啟動子只有在植物種 子成熟中、后期大量表達(dá)其下游基因，能夠調(diào)控外源基因在種子中特異性表達(dá)，使所表達(dá)的 外源蛋白都集中在種子中，最大限度的減少對農(nóng)作物其他代謝途徑的影響，種子中含有豐 富的碳水化合物，特別是淀粉、蛋白質(zhì)及脂肪，因此，種子特異性啟動子的研究和應(yīng)用在定 向改良農(nóng)作物品質(zhì)性狀方面具有重要的理論和事件意義。目前，國內(nèi)外的種子特異性啟動子的研究進(jìn)展非?？?，已克隆獲得的種子特異性 啟動子主要來自于糧食作物及油料作物種子中的蛋白、氨基酸、淀粉、脂類等合成代謝途徑 中相關(guān)的酶基因的啟動子，如玉米醇溶貯藏蛋白基因啟動子[趙倩等.(1999)玉米19KD醇 溶貯藏蛋白基因啟動子特異性表達(dá)控制區(qū)段的分析.植物學(xué)報，419(1)，5廣54]；
油菜 napin 蛋白啟動子[Zhang YJ, LiL, Song Y R.，Identification of seed-specific promoter nap300 and itscomparison with 7S promoter [J]. Progress in Natural Science, 2002, 12 (10) : 737- 741.]；
大麥 A -淀粉酶啟動子[Okack, Y.，Kihara, Μ.，Kuroda, H.，Yoshigi, N.，Ito, K.， Cloning and Sequencing of the Promoter Region of the Seed Specific beta—Amylase Gene from Barley [J], , Plant Physiol, 2000，156:762-767]；油菜 2S 清蛋白啟動子[Chatthal M, Forward BS,Yevtushenko D,Stefanov 1,Osuska L, Osuaky Μ, Misra S, 2S storage protein gene of douglas-fir:characterization and activity of promoter in transgenic tobacco seeds [J]. Plant Physiol Biochem, 2004, 42:417-423]；掠 7S 球蛋白啟動子[M0RCILL0 F , HARTMANN C, DUVAL YT, et al. Regulation of 7S globulin gene expression in zygotic and somatic embryos of oil palm[J]. Physiologia Plantarum, 2001, 112(2) :233 - 243.]等等。一些種子特異性啟動子在應(yīng)用中顯現(xiàn)出了 極顯著的效果，如玉米胚乳特異啟動子驅(qū)動小麥基因在玉米中表達(dá)，降低了籽粒的硬度，有 利于玉米的濕磨及家畜飼喂；水稻中O/WS基因啟動子驅(qū)動TtVMV基因在種子中特異表達(dá)， 降低了水稻籽粒中植酸含量.,rmpin基因啟動子參與的自我剪切載體在油菜種子中特異表 達(dá)，應(yīng)用于建立無標(biāo)記的安全轉(zhuǎn)基因植物等。大豆中研究較深入的種子特異性啟動子主要與種子中富含的蛋白質(zhì)有關(guān)，如伴大 豆球蛋白、球蛋白、凝集素基因和油質(zhì)蛋白的啟動子，并在轉(zhuǎn)基因中得到應(yīng)用；已克隆的大 豆種子特異性啟動子脂肪氧化酶-3基因的啟動子，還有一些基因已通過實(shí)驗(yàn)鑒定確定是 在大豆中種子特異表達(dá)基因，如油酸去飽和酶基因、天冬氨酸蛋白酶基因、硬脂酰去飽和酶 基因、Em基因、及P39的蛋白基因等，與其他糧食作物相比數(shù)量較少。因此，獲得一種新的 大豆種子特異性啟動子，對大豆新品種的研究開發(fā)及植物基因工程發(fā)展具有推動作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種大豆中分離的種子特異性啟動子序列及其應(yīng)用，以解決目前缺少 大豆種子特異性啟動子的問題。并對啟動子進(jìn)行分析和驗(yàn)證，并做五個缺失載體驗(yàn)證了各 個片段的作用功效。本發(fā)明一種大豆中分離的種子特異性啟動子的核苷酸序列如SEQ No. 1所述。本發(fā)明所述的大豆中分離的種子特異性啟動子的制備方法，包括下列步驟
a.硬脂酸-ACP脫飽和酶基因上游遠(yuǎn)端序列的克隆 利用TAIL-PCR方法，設(shè)計3個嵌套引物
Bl :5’ -TGGAACTGTGGAGAGGTTGGAG -3’ B2 5' -GGTGTGACTAGTGATTAGCCCTTG -3’ B3 :5’ - GTGGAAATTTGGCCCGATACCT -3’
與隨機(jī)兼并引物 AD5 :5，_ AG(A/T) GNAG (A/T) ANCA (A/T) AGG -3，，進(jìn)行三次 PCR 反 應(yīng)，獲得ATG上游遠(yuǎn)端序列；
b.對硬脂酸-ACP脫飽和酶基因ATG上游序列進(jìn)行分析，利用 Zl: 5， - GGGGAATTC AAAGAAAAAAAAATCCGTCC—3，禾口
Z2: 5，- GAACCATGGTGAGTGGGCCTTCCGGGCTTTG-3‘這對引物擴(kuò)增 208Ibp 的 SACPD-Cp 片段；
c.將SACPD-Cp擴(kuò)增片段與克隆載體PMD18-T進(jìn)行連接，鑒定后測序，驗(yàn)證序列正確。d、設(shè)計各缺失片段分別為AC1、AC2、AC3、AC4和AC5，分別與克隆載體pMD18_T進(jìn) 行連接，鑒定后測序，驗(yàn)證序列正確。本發(fā)明所述的大豆種子特異性啟動子作為大豆種子特異性啟動子的應(yīng)用。硬脂酰-ACP脫飽和酶是一種可溶性酶，存在于質(zhì)體基質(zhì)中，催化硬脂酰-ACP脫飽和而在脂肪酸鏈的C9- ClO間引入一個雙鍵形成油酰-ACP的反應(yīng)。飽和脂肪酸和 不飽和脂肪酸的比例與生物膜系統(tǒng)的流動性、選擇透性以及植物的多種生理功能有密切的 關(guān)系，因此，SAD受到人們的廣泛重視。2003年，Nicholas J.等在所有寒冷致死突變株中 的突變表達(dá)中鑒定出634個具有寒冷效應(yīng)基因，這些基因包括與脂肪酸代謝、葉綠體功能、 糖類代謝及自由基解毒相關(guān)的基因。細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)中脂類含量的改變能夠提高植物的抗冷 性，其中抗冷突變體中積累的一個轉(zhuǎn)錄物編碼硬脂酰-ACP脫飽和酶基因，它催化C18不飽 和脂肪酸的生物合成。Prade印Kachroo等提出硬脂酰-ACP脫飽和酶的減少能夠誘導(dǎo)某 種防衛(wèi)反應(yīng)和抑制其他物質(zhì)，參與不同防衛(wèi)信號途徑的信號調(diào)控。在“A seed specific stearoyl-ACP desaturase gene of soybean，，文章中，將大豆的硬月旨酷一ACP脫飽禾口醇命名 為SACPD-C，表明SACPD-C是大豆中種子特異表達(dá)的基因，其啟動子種子特異性啟動子。所述硬脂酸-ACP脫飽和酶啟動子序列中含有多種與種子特異表達(dá)相關(guān)的順式作 用元件，參見圖4a、圖仙、圖如對種子特異性基因高水平表達(dá)十分重要的RY- r印eat，常 出現(xiàn)在參與三?；视秃铣珊椭参锓N子特異表達(dá)基因啟動子中的E-box，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位 點(diǎn)TACGTA，增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的順式元件CAAT，胚乳表達(dá)順式作用元件Skn-I motif,胚表達(dá)順式作 用元件SEFl、SEF4、種子特異元件AACA。此外，硬脂酸-ACP脫飽和酶啟動子序列中還含有與光應(yīng)答有關(guān)的順式作用元件 GT1 (GRffAAff) 7個；1個W-box (TGACY)是WRKY轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)；2個CNGTTR基序是 MYB轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)；12個AAAG核心序列是DOF轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)。本發(fā)明所述的硬脂酸-ACP脫飽和酶啟動子具有明顯啟動子特性，與現(xiàn)已知啟動 子無同源性，通過瞬時表達(dá)證明其能驅(qū)動基因在大豆種子中特異性表達(dá)，是一個全新的種 子特異性啟動子。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明中克隆了大豆的硬脂酸-ACP脫飽和酶啟動子，研 究該啟動子在大豆中的組織表達(dá)特性及表達(dá)效率，為其有效應(yīng)用提供依據(jù)；該啟動子的獲 得為大豆轉(zhuǎn)基因研究提供有利工具，特別為利用大豆種子作為生物反應(yīng)器的研究和開發(fā)創(chuàng) 造了條件。


圖1是TAILPCR結(jié)果與PMD18-T連接酶切鑒定圖
圖2是Zl和Z2為引物PCR擴(kuò)增硬脂酸-ACP脫飽和酶基因上游遠(yuǎn)端SACPD-Cp片段的 電泳圖3是硬脂酸-ACP脫飽和酶基因上游遠(yuǎn)端SACPD-Cp片段與T載體連接的重組質(zhì)粒酶 切鑒定；
圖如是SACPD-Cp啟動子序列的生物信息學(xué)分析第一部份圖； 圖4b是SACPD-Cp啟動子序列的生物信息學(xué)分析第二部份圖； 圖如是SACPD-Cp啟動子序列的生物信息學(xué)分析第三部份圖； 圖5是SACPD-Cp啟動子序列的缺少載體構(gòu)建設(shè)計圖； 圖6是SACPD-Cp各缺失片段的PCR擴(kuò)增電泳圖； 圖7是SACPD-Cp片段及其缺失片段與表達(dá)載體連接后的PCR鑒定圖； 圖8是SACPD-Cp片段及其缺失片段與表達(dá)載體連接后的酶切鑒定圖；圖9是各表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌的PCR鑒定圖10是⑶S組織化學(xué)染色觀察結(jié)果，a 根；b:莖；c:葉；d 種子；A 未侵 染的大豆；B: ^依基因由CaMV35S組成型啟動子驅(qū)動；C: ^依基因由SACPD-Cp啟動子 驅(qū)動；
圖11是玉米種子的⑶S染色結(jié)果，A:未侵染的玉米種子；B: ^依基因由CaMV35S組 成型啟動子驅(qū)動的玉米種子；C: ^依基因由SACPD-Cp啟動子驅(qū)動的玉米種子； 圖12是SACPD-Cp片段在大豆各個組織中的熒光檢測結(jié)果； 圖13是SACPD-Cp片段及其缺失片段在各個組織中的熒光定量檢測比較結(jié)果； 圖14是PCAMBIA1301質(zhì)粒圖譜。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 硬脂酸-ACP脫飽和酶基因上游遠(yuǎn)端片段的克隆及SACPD-Cp的序列分 析
1、引物的設(shè)計與合成
根據(jù)大豆基因組中硬脂酸-ACP脫飽和酶基因ATG上游的一段已知序列(GeneBank assession AKM5255)，設(shè)計合成3個嵌套引物Bl、B2、B3 ；參照論文《大豆種子特異性啟 動子的克隆及序列分析》(財音青格樂，李明春，蔡易·作物學(xué)報，2005,31 (1):11-17)和 ((Rapid isolation and functional analysis of promoter sequences of the nitrate resuctase gene from Chlorella ellipsoidea)) (Peng Wang , Yongru Sun, Xia Li. Journal of Applied Phycology, 2004, 16:11-16.)中所述的 TAIL-PCR 方法，合成隨機(jī)兼并引物 ADl AD6:
Bl :5’ -TGGAACTGTGGAGAGGTTGGAG -3’
B2 5' -GGTGTGACTAGTGATTAGCCCTTG -3’
B3 :5’ - GTGGAAATTTGGCCCGATACCT -3’
ADl :5，- NTCGA(G/C) T (A/T) T (G/C) G (A/T) GTT -3，
AD2 :5， - NGTCGA(G/C) (A/T) GANA(A/T) GAA -3，
AD3 :5， - (A/T) GTGNAG(A/T)ANCANAGA -3，
AD4 5' - AG (A/T) GNAG(A/T) ANCA(A/T) AGG -3，
AD5 :5， - TG(A/T)GNAG(A/T)ANCA(G/C)AGA-3，
AD6 :5， - (G/C)TTGNTA(G/C)TNCTNCTNTGC -3，
2、TAIL-PCR方法擴(kuò)增未知序列
A.采用CTAB法提取，從吉豆2號大豆品種葉片中提取基因組DNA，并進(jìn)行純化。B. TAIL-PCR 方法擴(kuò)增 a. 1st PCR 反應(yīng)
以大豆基因組DNA作為模板，當(dāng)以AD4 primer作為上游引物時擴(kuò)增出未知序列，Bl primer為下游引物，進(jìn)行1st PCR反應(yīng)。擴(kuò)增反應(yīng)體系
基因組DNA 0. 5 ul
dNTP MixturedOmM each) 1 ul10XLAPCR Buffe(Mg+pIus) LA Taq(5U/ul) AD5 Primer(IOOuM) Bl primer (IOuM) (MH2O
擴(kuò)增反應(yīng)條件
權(quán)利要求
1.一種大豆中分離的種子特異性啟動子，其特征在于其核苷酸序列如SEQ No. 1所述。
2.如權(quán)利要求1所述的大豆中分離的種子特異性啟動子的制備方法，包括下列步驟a.硬脂酸-ACP脫飽和酶基因上游遠(yuǎn)端序列的克隆 利用TAIL-PCR方法，設(shè)計3個嵌套引物Bl :5’ -TGGAACTGTGGAGAGGTTGGAG -3’ B2 5' -GGTGTGACTAGTGATTAGCCCTTG -3’ B3 :5’ - GTGGAAATTTGGCCCGATACCT -3’與隨機(jī)兼并引物 AD5 :5，_ AG(A/T) GNAG (A/T) ANCA (A/T) AGG -3，，進(jìn)行三次 PCR 反 應(yīng)，獲得ATG上游遠(yuǎn)端序列；b.對硬脂酸-ACP脫飽和酶基因ATG上游序列進(jìn)行分析，利用 Zl: 5， - GGGGAATTC AAAGAAAAAAAAATCCGTCC—3，禾口Z2: 5，- GAACCATGGTGAGTGGGCCTTCCGGGCTTTG-3‘這對引物擴(kuò)增 208Ibp 的 SACPD-Cp 片段；c.將SACPD-Cp擴(kuò)增片段與克隆載體PMD18-T進(jìn)行連接，鑒定后測序，驗(yàn)證序列正確；d.設(shè)計各缺失片段分別為AC1、AC2、AC3、AC4和AC5，分別與克隆載體pMD18_T進(jìn)行連 接，鑒定后測序，驗(yàn)證序列正確。
3.如權(quán)利要求1所述的大豆種子特異性啟動子作為大豆種子特異性啟動子的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種大豆中分離的種子特異性啟動子序列及其應(yīng)用，涉及生物技術(shù)領(lǐng)域。其核苷酸序列如SEQ No.1所述，該種子特異性啟動子序列作為大豆種子特異性啟動子的應(yīng)用。本發(fā)明克隆了大豆的硬脂酸-ACP脫飽和酶啟動子，研究該啟動子在大豆中的組織表達(dá)特性及表達(dá)效率，為其有效應(yīng)用提供依據(jù)；該啟動子的獲得為大豆轉(zhuǎn)基因研究提供有利工具，特別為利用大豆種子作為生物反應(yīng)器的研究和開發(fā)創(chuàng)造了條件。
文檔編號C12N15/113GK102140472SQ20111000383
公開日2011年8月3日 申請日期2011年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月10日
發(fā)明者張慶林, 張艷, 李曉薇, 李景文, 王慶鈺, 王英, 程浩, 翟瑩, 趙艷 申請人:吉林大學(xué)