專利名稱：有機(jī)溶劑應(yīng)答的表達(dá)載體及其在生物催化中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種生物技術(shù)領(lǐng)域的有機(jī)溶劑表達(dá)載體及其應(yīng)用，具體為一種用有機(jī)溶劑應(yīng)答啟動(dòng)子Potp構(gòu)建的有機(jī)溶劑應(yīng)答的表達(dá)載體及其在生物催化中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
生物催化在合成精細(xì)化學(xué)品和生物修復(fù)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用潛力。作為一鐘節(jié)能、環(huán)境友好、安全和有效的方法，全細(xì)胞催化正在吸引越來(lái)越多的關(guān)注。在生物催化中常常要接觸到有機(jī)溶劑。比如在生物催化過(guò)程中為了增加反應(yīng)物的溶解性或者避免產(chǎn)物的分解等原因常常要引入含有有機(jī)溶劑的雙液相反應(yīng)；在許多需要進(jìn)行生物修復(fù)的污染區(qū)域也充斥著各種各樣的達(dá)到飽和濃度的有機(jī)溶劑，比如苯、甲苯、二甲苯等。對(duì)于普通微生物而言，有機(jī)溶劑是有毒的，因?yàn)橛袡C(jī)溶劑能夠破壞生物大分子的結(jié)構(gòu)，并且能夠在細(xì)胞膜上積累從而打亂磷脂雙層的有序結(jié)構(gòu)，進(jìn)而破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能的完整性。有機(jī)溶劑的毒性是生物催化在環(huán)境和精細(xì)化學(xué)品生產(chǎn)領(lǐng)域應(yīng)用的一大障礙。自1989年第一株耐有機(jī)溶劑微生物被分離以來(lái)，人們已經(jīng)從各種生態(tài)環(huán)境中分離到大量耐有機(jī)溶劑微生物，其中以惡臭假單胞菌為多。這些微生物是極端微生物的一種， 它們通過(guò)細(xì)胞膜的堅(jiān)固化，表達(dá)有機(jī)溶劑外排泵等方法來(lái)對(duì)抗有機(jī)溶劑的毒害。耐有機(jī)溶劑微生物在生物催化的諸多領(lǐng)域都具有重要的應(yīng)用潛力，比如生物修復(fù)，精細(xì)化學(xué)品合成等。惡臭假單胞菌具有著諸多讓人驚奇的特點(diǎn)，比如惡臭假單胞菌具有強(qiáng)大的代謝能力， 幾乎可以降解任意形式的芳香族和脂肪族化合物，包括一些劇毒的化合物。惡臭假單胞菌還是土壤微生物中的主要類群，是一種比較安全的菌株，因而，在重組DNA技術(shù)和環(huán)境應(yīng)用中有著較大的發(fā)展?jié)摿?。尤其值得關(guān)注的是，惡臭假單胞菌的某些菌株具有耐受有機(jī)溶劑的能力，這使得它們?cè)诠I(yè)催化和環(huán)境領(lǐng)域成為非常有用的菌株。這其中惡臭假單胞菌 (Pseudomonas putida) S12 是一個(gè)杰出的代表(Rui jssenaars H, 2007, J. Biotechnol. 131 S205-S206)，這株菌正在被開(kāi)發(fā)成為用糖類化合物生產(chǎn)芳香化合物的平臺(tái)菌株。然而，這些耐有機(jī)溶劑微生物往往不具備人們想要的催化活性，因此要利用有機(jī)溶劑耐受菌進(jìn)行催化或者環(huán)境修復(fù)就需要使用基因工程的手段對(duì)這些微生物進(jìn)行改造，以賦予其獨(dú)特的催化能力，擴(kuò)展微生物的應(yīng)用范圍，使其能夠用適合于各種工業(yè)和環(huán)境需求。異源表達(dá)系統(tǒng)是改造微生物，擴(kuò)展微生物菌株應(yīng)用范圍的有力工具，已經(jīng)在生物催化中被廣泛的應(yīng)用，比如精細(xì)化學(xué)品生產(chǎn)、生物修復(fù)和生物脫硫。合適的異源表達(dá)系統(tǒng)不僅可以使微生物的菌株改造或者構(gòu)建變得容易，而且可以賦予基因工程菌優(yōu)良的特性，使得利用生物催化劑進(jìn)行的大規(guī)模生產(chǎn)更經(jīng)濟(jì)可行。目前，僅有少量的基因操作工具可以在有機(jī)溶劑耐受的惡臭假單胞菌中使用，而且現(xiàn)存的操作工具大都是基于大腸桿菌乳糖操縱子的，誘導(dǎo)時(shí)需要使用價(jià)格昂貴的IPTG作為誘導(dǎo)物，這限制了它們?cè)诠I(yè)和環(huán)境領(lǐng)域的應(yīng)用。啟動(dòng)子Ps,p是有機(jī)溶劑耐受菌株惡臭假單胞菌(P. putida) S12的有機(jī)溶劑外排泵基因的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子可以在多種廉價(jià)有機(jī)溶劑誘導(dǎo)下啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄，比如可以在芳香烴、烷烴和醇類的誘導(dǎo)下啟動(dòng)下游基因的轉(zhuǎn)錄。而且，該啟動(dòng)子對(duì)于普通的環(huán)境壓力比如 PH、溫度、鹽濃度或者有機(jī)酸沒(méi)有應(yīng)答，這一特點(diǎn)將使得其下游基因更容易被人控制。尤其值得注意的是，這些有機(jī)溶劑同時(shí)也是工業(yè)生物催化中常用的溶劑，并且在污染環(huán)境中也時(shí)常存在。這一啟動(dòng)子用作表達(dá)載體的基因表達(dá)調(diào)控元件，將具有很大的優(yōu)勢(shì)，不僅可以用廉價(jià)的有機(jī)溶劑替代昂貴的IPTG，降低生物催化的誘導(dǎo)成本，還可以方便的直接利用微生物工業(yè)和環(huán)境中存在的有機(jī)溶劑對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行誘導(dǎo)，節(jié)約操作步驟，降低成本。因此， 該啟動(dòng)子在生物催化尤其是雙液相反應(yīng)和環(huán)境生物修復(fù)領(lǐng)域降具有很大的應(yīng)用潛力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提出了一種有機(jī)溶劑應(yīng)答的表達(dá)載體及其在生物催化中的應(yīng)用，本發(fā)明用有機(jī)溶劑應(yīng)答啟動(dòng)子Potp構(gòu)建，表現(xiàn)了較好的經(jīng)濟(jì)性和有效性，遠(yuǎn)好于用普通IPTG誘導(dǎo)載體構(gòu)建的基因工程菌。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明涉及一種有機(jī)溶劑應(yīng)答的表達(dá)載體，具體為有機(jī)溶劑應(yīng)答的寬宿主組成型表達(dá)載體。所述的寬宿主組成型表達(dá)載體包括載體ρ匪S和載體pMMRS，由DNA元件、復(fù)制子 RSF1010、篩選標(biāo)記基因bla、多克隆位點(diǎn)、基因間序列和有機(jī)溶劑應(yīng)答啟動(dòng)子Ps,p組成，其特征在于，所述載體PMMS的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，所述載體pMMRS的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。所述載體的宿主為假單胞菌(含施氏假單胞菌、惡臭假單胞菌或熒光假單胞菌) 和大腸桿菌。所述的DNA元件，其中啟動(dòng)子Ps,p和調(diào)控基因srpRS源自惡臭假單胞菌 (P. puti da) S12，其他元件來(lái)自于載體pMMB66EH。所述載體pMMS，即大腸桿菌 DH5 α/pMMS (Escherichia coli DH5 α /pMMS)已被保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC M 2010319，保藏時(shí)間為2010年11月四曰。所述載體pMMRS，即大腸桿菌 DH5 α/pMMRS (Escherichia coli DH5 α /pMMRS)已被保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC M 2010320，保藏時(shí)間為2010年11月 29日。所述的惡臭假單胞菌，即惡臭假單胞菌DS23 (Psudomonas puti da DS23)，該菌株已被保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC M 2010321，保藏時(shí)間為2010年11
月四日。所述的惡臭假單胞菌，即惡臭假單胞菌DT23 (Psudomonas puti da DT23)，該菌株已被保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC M 2010322，保藏時(shí)間為2010年11
月四日。中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心地址為武漢市武漢大學(xué)，武昌珞珈山，郵編430072。本發(fā)明還對(duì)上述的有機(jī)溶劑應(yīng)答的表達(dá)載體在生物催化中的應(yīng)用進(jìn)行了研究，所述的載體PMMS和pMMRS，使用有機(jī)溶劑類化合物作為誘導(dǎo)劑，能對(duì)有機(jī)溶劑作出應(yīng)答，可用于構(gòu)建生物催化用工程菌，并適用于包括化合物合成、生物修復(fù)、生物轉(zhuǎn)化的生物催化。
在生物催化中的應(yīng)用，載體ρ匪S和pMMRS用于構(gòu)建工程菌，所構(gòu)建的工程菌用于生物催化。本發(fā)明以啟動(dòng)子Ps,p為基礎(chǔ)，利用實(shí)驗(yàn)室已有的一個(gè)寬宿主范圍載體PMMB66EH， 構(gòu)建了可以在大腸桿菌和假單胞菌中自主復(fù)制，并可以被多種有機(jī)溶劑類化合物誘導(dǎo)的載體pMMS和pMMRS，并使用報(bào)告基因(氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因，cat)研究了所構(gòu)建載體的可用性，研究了構(gòu)建載體在生物催化尤其是雙液相生物催化中的應(yīng)用。本發(fā)明所構(gòu)建的載體pMMS和pMMRS可以在各類假單胞菌菌株中啟動(dòng)基因的表達(dá)， 其中pMMRS在所有的菌株中都表現(xiàn)為誘導(dǎo)型表達(dá)載體，ρ匪S在惡臭假單胞菌(P.putida) S12中為誘導(dǎo)型，在其他菌株中表現(xiàn)為組成型表達(dá)載體。本發(fā)明同時(shí)用二苯并噻吩的生物脫硫反應(yīng)為應(yīng)用實(shí)例，考察了所構(gòu)建表達(dá)載體在生物催化尤其是雙液相生物催化中的優(yōu)勢(shì)。首先用本發(fā)明的載體構(gòu)建了工程菌DS23，用普通載體(IPTG誘導(dǎo)的)構(gòu)建了重組菌構(gòu)建了工程菌DT23。然后用這兩株菌進(jìn)行了一系列的雙液相反應(yīng)。發(fā)現(xiàn)DS23可以被多種有機(jī)溶劑誘導(dǎo)表達(dá)脫硫的活力，在雙液相反應(yīng)體系中 DS23比用IPTG誘導(dǎo)的DT23活力更好，表現(xiàn)了較好的經(jīng)濟(jì)性和有效性。而且，在高濃度有機(jī)溶劑(50%的正己烷)存在條件下，DS23可在Mh內(nèi)，使得ImM的二苯并噻吩被降解67%， 初始他的平均反應(yīng)速率為2. 41mmolg (干細(xì)胞重Γ 這遠(yuǎn)好于用普通IPTG誘導(dǎo)載體構(gòu)建的基因工程菌。


圖1載體ρ匪S的構(gòu)建圖2PCR檢測(cè)載體ρ匪S-cat，Ml, M2 分子量標(biāo)記物；Cl 對(duì)照；Sl 樣品圖3載體pMMRS的構(gòu)建圖4PCR檢測(cè)載體pMMRS-cat的構(gòu)建，M3，M4 DNA分子量標(biāo)記物；S3 以載體 pMMRS-cat為模板，Placl. f (MluI)和Placl. r (MluI)為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果；S4 以載體pMMRS-cat為模板，Placl. f (MluI)和srpR. r (ApaI)為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果；分子量單位為bp圖5載體pMMS-ABCD的構(gòu)建圖6PCR驗(yàn)證ρ匪S-AB⑶的構(gòu)建，Ml, M2 分子量標(biāo)記物；泳道1_5 以重組載體為模板，溫度遞升PCR得到的dszAB⑶基因；Lane C 以ρ匪S載體為模板的對(duì)照PCR圖7不同有機(jī)溶劑做誘導(dǎo)物和反應(yīng)介質(zhì)時(shí)菌株的脫硫情況圖8DT23和DS23脫硫活力的比較圖9高濃度50% (體積比)的有機(jī)溶劑存在時(shí)DS23的脫硫效果，(▼)二苯并噻吩濃度；(▲ ) 2-羥基聯(lián)苯(二苯并噻吩降解產(chǎn)物)濃度
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體的實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。下面實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法，具體參見(jiàn)《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照試劑和試劑盒制造廠商所建議的條件。本發(fā)明所有用到的DNA元件和微生物菌株均來(lái)自于已經(jīng)公開(kāi)發(fā)表文獻(xiàn)資料，其序列信息和DNA本身均可以被公眾獲得， 詳見(jiàn)表1和表2 ；其他各種材料均系本發(fā)明構(gòu)建，可以用本發(fā)明所述的方法進(jìn)行再構(gòu)造；其中載體pMMABCD系本課題組之前的文獻(xiàn)和專利中構(gòu)建(Tao et al. 2006, Appl. Environ. Microbiol. 72 :4604-4609)，本發(fā)明使用它作為研究構(gòu)建載體的可用性的參照。本實(shí)施例涉及的菌株列表表 1
菌株簡(jiǎn)述來(lái)源P. putida S12用作宿主CKieboom and de Bont 2001，Microbiology 147:43-51)P. putida Idaho用作宿主CCruden et al. 1992, Microbiol. 58:2723-2729)P. putida KT244(用作宿主(Williams and Murray 1974，J. Bacteriol. 120:416-423)P. fluorescens ACB用作宿主CKamerbeek et al. 2003, Appl. Environ. Microbiol. 69:419-426)本實(shí)施例涉及的載體列表表 2
載敝稱簡(jiǎn)述來(lái)源pMMB66EHExpress vector, AmprCFiirste et al. 1986, Gene 48:119-131)pBAD322CExpress vector, CmrCCronan 2006, Plasmid 55:152-157)
pMMABCDpMMB66EH with ifeABCD，AmprCTao et al. 2006, Appl. Environ. Microbiol. 72:4604-4609)pMMB66EH-c atpMMB66EH with cat, Ampe本實(shí)施例構(gòu)建pMMS-catpMMB66EH-cat with Psrp replacing Ptoc, Ampr本實(shí)施例構(gòu)建pMMRS-catpMMRS-cat with srpR and srpS, Ampr本實(shí)施例構(gòu)建pMMSpMMS-cat without cat, Ampr本實(shí)施例構(gòu)建pMMRSpMMRS-cat without cat, Ampr本實(shí)施例構(gòu)建pMMS-ABCDpMMS with rfszABCD, Ampr本實(shí)施例構(gòu)建本實(shí)施例涉及的引物列表表權(quán)利要求
1.一種有機(jī)溶劑應(yīng)答的表達(dá)載體，其特征在于，該載體為寬宿主組成型表達(dá)載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其特征是，所述寬宿主組成型表達(dá)載體包括載體 pMMS和載體pMMRS，由DNA元件、復(fù)制子RSF1010、篩選標(biāo)記基因bla、多克隆位點(diǎn)、基因間序列和有機(jī)溶劑應(yīng)答啟動(dòng)子Potp組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的表達(dá)載體，其特征是，所述載體pMMS的核苷酸序列如SEQID No. 1所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的表達(dá)載體，其特征是，所述載體pMMRS的核苷酸序列如SEQID No. 2所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其特征是，所述載體的宿主為假單胞菌和大腸桿菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其特征是，所述的有機(jī)溶劑應(yīng)答啟動(dòng)子Psnj和調(diào)控基因srpRS源自惡臭假單胞菌S12，其他元件來(lái)自于載體pMMB66EH。
7.一種根據(jù)上述任一權(quán)利要求所述的表達(dá)載體在生物催化中的應(yīng)用，其特征在于，所述載體pMMS和所述載體pMMRS使用有機(jī)溶劑類化合物作為誘導(dǎo)劑對(duì)有機(jī)溶劑作出應(yīng)答，用于構(gòu)建生物催化用工程菌、化合物合成、生物修復(fù)、生物轉(zhuǎn)化的生物催化。
全文摘要
一種生物技術(shù)領(lǐng)域的有機(jī)溶劑應(yīng)答的表達(dá)載體及其在生物催化中的應(yīng)用，其中有機(jī)溶劑應(yīng)答的寬宿主組成型表達(dá)載體，包括載體pMMS和載體pMMRS，由DNA元件、復(fù)制子RSF1010、篩選標(biāo)記基因bla、多克隆位點(diǎn)、基因間序列和有機(jī)溶劑應(yīng)答啟動(dòng)子Psrp組成，其特征在于，所述載體pMMS的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述載體pMMRS的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。本發(fā)明在生物催化尤其是雙液相生物催化中的優(yōu)勢(shì)。表現(xiàn)了較好的經(jīng)濟(jì)性和有效性且在高濃度有機(jī)溶劑存在條件下，用有機(jī)溶劑誘導(dǎo)載體構(gòu)建的工程菌遠(yuǎn)好于用普通IPTG誘導(dǎo)載體構(gòu)建的基因工程菌。
文檔編號(hào)C12N15/78GK102154357SQ20111000401
公開(kāi)日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2011年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月11日
發(fā)明者劉艷華, 徐友強(qiáng), 李福利, 蘇斐, 許平, 陶飛, 馬翠卿 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)