專利名稱：一種蘋果汁中脂環(huán)酸芽孢桿菌pcr快速特異性檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及食品工業(yè)的一種檢測方法，特別涉及一種蘋果汁中脂環(huán)酸芽孢桿菌 PCR快速特異性檢測方法。
背景技術(shù)：
脂環(huán)酸芽孢桿菌于1967年由日本學(xué)者首次報(bào)道，該屬細(xì)菌嗜熱耐酸，生存能力獨(dú) 特，可經(jīng)受酸性條件下的巴氏殺菌過程而存活，污染果汁及果汁飲料后，發(fā)生平蓋酸敗，污 染初期果汁在外觀上并無明顯變化，一旦條件適宜，該屬細(xì)菌迅速生長繁殖，產(chǎn)生愈創(chuàng)木酚 和鹵酚等不良風(fēng)味物質(zhì)，導(dǎo)致果汁產(chǎn)品香氣損失、口感變差、濁度升高、形成沉淀，在保質(zhì)期 內(nèi)就發(fā)生果汁品質(zhì)劣變，給果汁業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，是果汁生產(chǎn)廠家比較棘手的常 見污染菌。由于該屬細(xì)菌嚴(yán)格嗜酸，在pH7. 0條件下不能生長，因此，常規(guī)細(xì)菌總數(shù)檢驗(yàn)法導(dǎo) 致該菌漏檢。Mickey等通過脂環(huán)酸芽孢桿菌的形態(tài)特征(G+、產(chǎn)芽孢、白色、圓形菌落)、生 長溫度范圍等生理生化指標(biāo)，對(duì)1575個(gè)柑橘進(jìn)行脂環(huán)酸芽孢桿菌檢測，結(jié)果在591個(gè)柑橘 中檢測出該菌。目前，對(duì)該菌的檢驗(yàn)仍以這種傳統(tǒng)檢測法為主。由于傳統(tǒng)檢測法存在指標(biāo) 多、程序繁瑣、耗時(shí)、檢測結(jié)果滯后等缺點(diǎn)，不能及時(shí)向生產(chǎn)線反饋信息以采取相應(yīng)的防范、 控制措施。因此，果汁業(yè)急需為其提供一種從原料到產(chǎn)品全程跟蹤的快速、特異性的檢測方 法，以及時(shí)指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)踐。近年來，PCR檢測方法由于其特異性高，檢測時(shí)間相對(duì)縮短等特點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于果 汁中脂環(huán)酸芽孢桿菌的鑒定和檢測。Cormor等應(yīng)用Reatime PCR方法，能夠較快速、特異地 檢測出脂環(huán)酸芽孢桿菌及一些與它親緣關(guān)系較近的嗜酸菌，并且從理論上計(jì)算，可以檢測 出細(xì)胞數(shù)<100的脂環(huán)酸芽孢桿菌。國內(nèi)也有學(xué)者建立耐熱菌的PCR及QC-PCR快速檢測方法，整個(gè)檢測時(shí)間為4h 5h，比傳統(tǒng)時(shí)間的4d 5d大大縮短，但由于這些方法均不能突破常規(guī)的DNA提取，需要提 供一定量的菌體，因此不能逾越該菌的分離及富集培養(yǎng)，所需檢測時(shí)間仍較長，而且所用儀 器設(shè)備及試劑昂貴，與應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐仍有一定差距。因此，探索真正的快速，特異，定量的 PCR檢測方法仍然任重而道遠(yuǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷或不足，本發(fā)明的目的在于，提供一種蘋果汁中脂 環(huán)酸芽孢桿菌PCR快速特異性檢測方法，用于蘋果汁生產(chǎn)的在線檢測。為了實(shí)現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采取如下的技術(shù)解決方案
一種蘋果汁中脂環(huán)酸芽孢桿菌PCR快速特異性檢測方法，其特征在于，具體按下列步 驟進(jìn)行
1)取Iml果汁菌懸液，經(jīng)lOOOOr/min離心2min，棄上清，加50ul雙蒸餾水重懸；
2)重懸后的菌體經(jīng)微波1000W處理60s，5000r/min離心lmin，取上清，得到模板DNA；3)設(shè)計(jì)一對(duì)SHC引物JLX-F和JLX-R，其中 引物 JLX-F 5' -CGGCACCTGGTCCATTTATC-3' 引物 JLX-R 5' -TCGAGCCCTTCAAACCCTTT-3'；
4)將模板DNA、引物JLX-F和引物JLX-R構(gòu)成25ul體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
5)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測在648bp處獲得目的條帶，即得到檢測結(jié)果。本發(fā)明利用微波技術(shù)裂解微生物細(xì)胞壁，變性蛋白，并通過離心去除蛋白干擾，突 破了常規(guī)的微生物DNA提取，僅花費(fèi)aiiin即可直接從蘋果汁樣品中獲得符合PCR擴(kuò)增要求 的模板，使整個(gè)檢測過程由過去的至少4 減少為池內(nèi)即可完成，檢測限為<100CFU/ml，特 異，快速，成本低廉，可以用于蘋果汁生產(chǎn)的在線檢測。


圖1是微波不同處理時(shí)間提取DNA的PCR擴(kuò)增效果電泳圖； 圖2是SHC引物特異性檢測電泳圖3是擴(kuò)增電泳圖。以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明使用微波直接從果汁樣品中提取DNA，根據(jù)GenBank中提供的 Alicyclobacillus acidoterrestris DSM 3922τ 的鯊烯環(huán)化酶(She)基因序列設(shè)計(jì)一對(duì) 特異性引物，分別對(duì)引物特異性、微波提取DNA的擴(kuò)增效果及檢測靈敏度進(jìn)行了研究，經(jīng)驗(yàn) 證，其檢測時(shí)間縮短，檢測成本降低，能夠?qū)崿F(xiàn)蘋果汁生產(chǎn)的在線檢測。具體按下列步驟進(jìn)行
1)取Iml果汁菌懸液，經(jīng)lOOOOr/min離心2min，棄上清，加50ul雙蒸餾水重懸；
2)重懸后的菌體經(jīng)微波1000W處理60s，5000r/min離心lmin，取上清，得到模板DNA；
3)設(shè)計(jì)一對(duì)SHC引物JLX-F和JLX-R，其中 引物 JLX-F 5' -CGGCACCTGGTCCATTTATC-3' 引物 JLX-R 5' -TCGAGCCCTTCAAACCCTTT-3'；
4)將模板DNA、引物JLX-F和引物JLX-R構(gòu)成25ul體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
5)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測在648bp處獲得目的條帶，即得到檢測結(jié)果。上述PCR擴(kuò)增的每個(gè)體系含2 μ 1模板DNA，2 μ IDNTP, 2. 5 μ 1 10倍buffer， 10 μ mol · Γ1的引物JLX-F和引物JLX-R各1. 5 μ 1，以及0. 2 μ 1的rTaq DNA聚合酶 5U· μ Γ1, PCR擴(kuò)增條件為94°C預(yù)熱％iin，然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，94°C解鏈45s，55°C退火 45s，72°C延伸lmin，循環(huán)結(jié)束后，最后72°C延伸lOmin。以下是具體的相關(guān)實(shí)驗(yàn)
(一)微波提取DNA的模板質(zhì)量及擴(kuò)增效果 1、微波處理時(shí)間對(duì)DNA質(zhì)量及擴(kuò)增效果的影響 表1微波處理時(shí)間對(duì)DNA質(zhì)量的影響
權(quán)利要求
1.一種蘋果汁中脂環(huán)酸芽孢桿菌PCR快速特異性檢測方法，其特征在于，具體按下列 步驟進(jìn)行1)取Iml果汁菌懸液，經(jīng)lOOOOr/min離心2min，棄上清，加50ul雙蒸餾水重懸；2)重懸后的菌體經(jīng)微波1000W處理60s，5000r/min離心lmin，取上清，得到模板DNA；3)設(shè)計(jì)一對(duì)SHC引物JLX-F和JLX-R，其中 引物 JLX-F 5' -CGGCACCTGGTCCATTTATC-3' 引物 JLX-R 5' -TCGAGCCCTTCAAACCCTTT-3'；4)將模板DNA、引物JLX-F和引物JLX-R構(gòu)成25ul體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增；5)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測在648bp處獲得目的條帶，即得檢測結(jié)果。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的PCR擴(kuò)增體系含2μ1模板DNA， 2 μ 1DNTP，2. 5μ 1 10 倍 buffer，10 μ mo 1 · Γ1 的引物 JLX-F 和引物 JLX-R 各 1. 5 μ 1，以及 0. 2 μ 1的rTaq DNA聚合酶5U · μ Γ1, PCR擴(kuò)增條件為94°C預(yù)熱％iin，然后進(jìn)行30個(gè)循 環(huán)，94°C解鏈45s，55°C退火45s，72°C延伸lmin，循環(huán)結(jié)束后，最后72°C延伸lOmin。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蘋果汁中脂環(huán)酸芽孢桿菌PCR快速特異性檢測方法，該方法使用微波直接從果汁樣品中提取DNA，根據(jù)GenBank中提供的AlicyclobacillusacidoterrestrisDSM3922T的鯊烯環(huán)化酶(Shc)基因序列設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，將模板DNA、引物JLX-F和引物JLX-R構(gòu)成25ul體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測在648bp處獲得目的條帶，即得檢測結(jié)果。并分別對(duì)引物特異性、微波提取DNA的擴(kuò)增效果及檢測靈敏度進(jìn)行了研究，驗(yàn)證，其檢測時(shí)間縮短，檢測成本降低，能夠?qū)崿F(xiàn)從蘋果汁生產(chǎn)的在線檢測。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK102134608SQ201110004200
公開日2011年7月27日 申請日期2011年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月11日
發(fā)明者樊明濤, 焦凌霞 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)