專(zhuān)利名稱(chēng)：玉米干旱誘導(dǎo)型基因啟動(dòng)子及活性分析的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及玉米干旱誘導(dǎo)型基因(ZmCIPKie)啟動(dòng)子
克隆。
背景技術(shù)：
干旱生態(tài)危機(jī)已嚴(yán)重影響到人類(lèi)的可持續(xù)發(fā)展，因此在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，急須耐旱、水分脅迫環(huán)境下生長(zhǎng)良好的糧食作物和植被。隨著現(xiàn)代基因工程技術(shù)的迅速發(fā)展，植物耐旱已從傳統(tǒng)的植物生理研究轉(zhuǎn)向分子方面的研究。作物分子育種技術(shù)使得以基因水平替代原先的染色體組水平來(lái)精細(xì)地調(diào)節(jié)育種的作用成為可能。高等植物基因的表達(dá)調(diào)控已成為分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，啟動(dòng)子是基因表達(dá)調(diào)控的重要元件。深入研究啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)和功能，建立可用于植物轉(zhuǎn)基因表達(dá)的時(shí)、空、量三維調(diào)控系統(tǒng)，可為功能基因組學(xué)研究及通過(guò)基因工程技術(shù)精確地調(diào)節(jié)植物代謝提供全新的思路。選擇適宜的啟動(dòng)子來(lái)驅(qū)動(dòng)目的基因在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)，已成為植物基因工程研究的熱點(diǎn)問(wèn)題之一。針對(duì)不同的目的基因，人們選用不同的啟動(dòng)子，從而使靶基因在特定組織或條件下選擇性表達(dá)，以利于轉(zhuǎn)基因植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育(趙恢武等，2000 ；劉強(qiáng)等， 2000)。對(duì)植物在干旱逆境下大量表達(dá)的耐旱基因啟動(dòng)子研究表明，不同耐旱基因的啟動(dòng)子往往含有相同的順式作用元件，并受相同的反式作用因子的調(diào)控。這為我們提供了另外一條研究植物耐旱機(jī)制的途徑。國(guó)內(nèi)外科學(xué)家利用一些耐旱相關(guān)的特異性啟動(dòng)子(如RD29A)、特異性蛋白(如脫水素)、耐旱相關(guān)的特異性酶(如TPS)基因進(jìn)行植物遺傳轉(zhuǎn)化并獲得了成功，得到一些耐旱品質(zhì)明顯提高的轉(zhuǎn)基因植株。清華大學(xué)的劉強(qiáng)等(2002)將來(lái)自擬南芥的干旱誘導(dǎo)型基因RD29A的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子轉(zhuǎn)入擬南芥后發(fā)現(xiàn)擬南芥的干旱耐受性能有很大提高。高世慶(2006)通過(guò)基因槍介導(dǎo)轉(zhuǎn)化小麥幼胚愈傷組織，經(jīng)過(guò)分子生物學(xué)檢測(cè)及在PEG脅迫下的 ⑶S組織化學(xué)染色證實(shí)了 RD29A啟動(dòng)子在小麥愈傷組織中能夠誘導(dǎo)⑶S基因的表達(dá)。也有科研工作者直接利用干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子啟動(dòng)某些耐旱有關(guān)的蛋白表達(dá)進(jìn)行植物耐旱機(jī)理的研究。如利用特異性的啟動(dòng)子啟動(dòng)與耐旱有關(guān)的基因(如脫水素基因等)或特異性的滲透調(diào)節(jié)物合成酶基因在煙草、擬南芥等模式植物體內(nèi)表達(dá)獲得耐旱植株；通常情況下在雙子葉植物中常用的組成型啟動(dòng)子CaM35S啟動(dòng)海藻糖-6-磷酸磷酸酶(TPP)在煙草和擬南芥中均獲得耐旱植株，而用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子RD29啟動(dòng)TSP (海藻糖-6-磷酸合酶)在煙草中表達(dá)，獲得了較為明顯的耐旱煙草植株。單子葉植物的Ubiquitin-promoter有兩部分組成eX0n和intron，其中intron具有增強(qiáng)子的功能。目的基因在其啟動(dòng)下能夠大量穩(wěn)定的在單子葉植物體內(nèi)表達(dá)。浙江大學(xué)郝中娜等(2005)對(duì)水稻0sWRKY19及0sWRKY89基因的啟動(dòng)子進(jìn)行功能研究，表明這兩個(gè)基因的啟動(dòng)子是組織特異性表達(dá)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。Brown 等(2010)首次發(fā)現(xiàn)冬小麥bltlOl基因啟動(dòng)子內(nèi)存在高度保守的TCA-Iike元件與誘導(dǎo)目的基因在低溫脅迫下高效表達(dá)密切相關(guān)。Takumi (2003)等分離了小麥低溫應(yīng)答基因家族基因Wcorl5上游的啟動(dòng)子序列證實(shí)該啟動(dòng)子受低溫和光誘導(dǎo)。 利用干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)抗旱基因的高效表達(dá)，從而改良作物的耐旱性成為目前研究的熱點(diǎn)。然而，目前能應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因研究的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子仍然很少。因此，對(duì)于新的抗旱相關(guān)啟動(dòng)子的克隆、順式作用元件具體序列的確定、各元件之間的相互作用，以及與這些元件互作的轉(zhuǎn)錄因子的研究仍然是今后啟動(dòng)子研究的重點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
1. 一種獲得的玉米干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列，其特征在于所述啟動(dòng)子序列包含相對(duì)于SEQID NO 1的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的-Ibp至-1773bp區(qū)的DNA核苷酸序列。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的獲得的玉米干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列，其特征在于所述啟動(dòng)子序列源自玉米CBL相互作用的蛋白激酶基因(ZmCIPKie)。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的獲得的玉米干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列，其特征在于一種克隆得到的玉米CBL相互作用的蛋白激酶基因(ZmCIPKie)的5’非翻譯區(qū)，5’非翻譯區(qū)包含相對(duì)于SEQ ID NO 1的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的+Ibp至+230bp區(qū)的DNA核苷酸序列。4. 一種用于玉米轉(zhuǎn)化的干旱誘導(dǎo)型的植物表達(dá)載體，其特征在于所述植物表達(dá)載體包含權(quán)利要求1的玉米干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列和權(quán)利要求3的玉米CBL相互作用的蛋白激酶基因(ZmCIPK16)5非翻譯區(qū)。 5. 一種用植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于所述轉(zhuǎn)基因植物包含權(quán)利要求1的玉米干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列和權(quán)利要求3的玉米CBL相互作用的蛋白激酶基因 (ZmCIPK16)5’ 非翻譯區(qū)。6. SEQ ID NO :2和3的PCR引物，其特征在于所述引物適于擴(kuò)增包含SEQ ID NO 1的序列DNA片段。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列，該啟動(dòng)子序列能夠誘導(dǎo)目標(biāo)基因高水平表達(dá)，而且該啟動(dòng)子來(lái)源于玉米calcineurin B-Iike (CBL)相互作用的蛋白激酶基因(ZmCIPK16)。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種用于植物轉(zhuǎn)化的干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子載體，該載體指導(dǎo)高水平表達(dá)目標(biāo)基因ZmCIPKie的干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列和5’非翻譯區(qū)。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種所述載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物。該轉(zhuǎn)基因植物能反映啟動(dòng)子誘導(dǎo)活性的高低。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明克隆了玉米CBL相互作用的蛋白激酶基因(ZmCIPKie)的干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子區(qū)，并構(gòu)建了用于植物轉(zhuǎn)化的載體，所述載體包含帶有ZmCIPKie基因的 5非翻譯區(qū)的上述啟動(dòng)子。隨后利用所述載體在玉米胚中誘導(dǎo)表達(dá)，并觀(guān)察到該啟動(dòng)子與干旱誘導(dǎo)性相關(guān)的高水平活性。本發(fā)明提供一種獲得的玉米干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列，其特征在于所述啟動(dòng)子序列包含相對(duì)于SEQ ID NO 1的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的-Ibp至-1773bp區(qū)(見(jiàn)序列表)的DNA核苷酸序列，干旱可以在植物中誘導(dǎo)本發(fā)明所述的啟動(dòng)子的高水平活性。獲得的玉米干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列源自玉米CBL相互作用的蛋白激酶基因 (ZmCIPK16)。一種克隆得到的玉米CBL相互作用的蛋白激酶基因(ZmCIPKie)的5’非翻譯區(qū)，5，非翻譯區(qū)包含相對(duì)于SEQ ID NO 1的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的+Ibp至+230bp區(qū)(見(jiàn)序列表) 的DNA核苷酸序列，本發(fā)明所述的非翻譯區(qū)能通過(guò)增強(qiáng)導(dǎo)入植物中的目標(biāo)外源基因的翻譯效力，而誘導(dǎo)目標(biāo)基因的高水平表達(dá)。為實(shí)現(xiàn)另一個(gè)目的，本發(fā)明提供一種用于玉米轉(zhuǎn)化的干旱誘導(dǎo)型的植物表達(dá)載體，所述植物表達(dá)載體包含玉米干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列和玉米CBL相互作用的蛋白激酶基因(ZmCIPK16)5’非翻譯區(qū)。上述用于玉米轉(zhuǎn)化的干旱誘導(dǎo)型載體是指能夠在轉(zhuǎn)基因植物中持久表達(dá)外源基因的二元載體。所述二元載體可以是任何包含T-DNA (轉(zhuǎn)移DNA)的RB (右邊界序列)和 LB (左邊界序列)，能夠在根癌農(nóng)桿菌(Agroba terium tumefaciens) Ti質(zhì)粒存在下轉(zhuǎn)化植物的二元載體。該載體可以是經(jīng)常用于相關(guān)領(lǐng)域的二元載體，例如PCAMBIA1301載體、 PBI121 載體。一種用植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物，包含玉米干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列和玉米 CBL相互作用的蛋白激酶基因(ZmCIPKie) 5’非翻譯區(qū)。本發(fā)明提供SEQ ID NO :2和3的PCR引物，適于擴(kuò)增包含SEQ ID NO 1的序列DNA
片段。關(guān)于本發(fā)明所述的用于植物的誘導(dǎo)型載體(pCAMBIA1301)，所述的玉米CBL相互作用的蛋白激酶基因(ZmCIPKie)的啟動(dòng)子和5’非翻譯區(qū)在植物表達(dá)載體中位于外源基因的前面。本發(fā)明提供通過(guò)插入本發(fā)明所述的玉米CBL相互作用的蛋白激酶基因(ZmCIPKie) 的啟動(dòng)子和5’非翻譯區(qū)至含有GUS報(bào)告基因的載體中而構(gòu)建的pCAMBIA1301。但是，所述 GUS報(bào)告基因是外源基因，并預(yù)期可以用任意其它有用的外源基因來(lái)代替。本發(fā)明提供一種應(yīng)用干旱誘導(dǎo)型二元載體的轉(zhuǎn)基因植物，以及一種應(yīng)用本發(fā)明所述進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)的玉米成熟胚。植物能通過(guò)使用例如根癌農(nóng)桿菌(An，G. 1987，Plant Physiology)或粒子轟擊方法(Lacorte等，1997，Plant Cell Reports)由上述植物干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子二元載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化。在本發(fā)明中，例如煙草可以用葉盤(pán)轉(zhuǎn)化法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。本發(fā)明提供來(lái)自玉米的CBL相互作用的蛋白激酶基因(ZmCIPKie)的干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和5’非翻譯區(qū)，根據(jù)本發(fā)明的啟動(dòng)子和5’非翻譯區(qū)使得能夠在植物中進(jìn)行干旱誘導(dǎo)型表達(dá)。本發(fā)明有益效果在于可用于啟動(dòng)抗旱基因的高效表達(dá)，應(yīng)用于耐旱的轉(zhuǎn)基因植物中，對(duì)于解決干旱地區(qū)糧食危機(jī)、生態(tài)惡化等問(wèn)題都有積極意義。


圖1為玉米(B73)基因組電泳 2 為 ZmCIPK16_pro PCR 電泳3為ZmCIPK16_pro回收電泳4為ZmCIPK16_pro連T載質(zhì)粒提取電泳5為ZmCIPK16_pro連T載酶切鑒定電泳 6 為 ZmCIPK16-pro 及 pCAMBIA-1301 酶切回收電泳 7 為 pCAMBIA 1301 :ZmCIPK16Pro 酶切鑒定電泳圖
圖8為植物表達(dá)載體構(gòu)建示意9為pCAMBIA 130 1 :ZmCIPK16Pro轉(zhuǎn)農(nóng)桿菌質(zhì)粒提取電泳10為pCAMBIA 1301 ZmCIPK16Pro轉(zhuǎn)農(nóng)桿菌酶切鑒定電泳11為ZmCIPK16啟動(dòng)子的⑶S檢測(cè)(背面)照片圖12為ZmCIPK16啟動(dòng)子的⑶S檢測(cè)(正面)照片圖13為煙草無(wú)菌苗照片圖14為煙草預(yù)培養(yǎng)照片圖15為煙草篩選照片圖16為煙草愈傷⑶S檢測(cè)照片圖 11、12 和 16 中:ZmCIPK16(a)未用 20% PEG 處理 ZmCIPK16 (b)用 20% 的 PEG 處理24h
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖介紹具體實(shí)施例的實(shí)施將能夠使本領(lǐng)域技術(shù)人員更清楚地理解如何實(shí)施本發(fā)明。盡管已經(jīng)結(jié)合本發(fā)明的優(yōu)選的具體實(shí)施方式
來(lái)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但是以下描述的目的是示例性的，而不是限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的其它方面對(duì)于本發(fā)明有關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。實(shí)施例1 玉米CBL相互作用的蛋白激酶基因(ZmCIPKie)的干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的克隆玉米CBL相互作用的蛋白激酶基因(ZmCIPKie)的啟動(dòng)子(啟動(dòng)子序列包含相對(duì)于SEQ IDNO 1的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的-Ibp至-1773bp區(qū)的DNA核苷酸序列)，在玉米ZmCIPK16 基因的5’區(qū)序列中得到鑒定。玉米CBL相互作用的蛋白激酶基因(ZmCIPK16)登錄在NCBI GenBank(登錄號(hào) EU907939. 1)，序列表顯示本發(fā)明上述基因的植物干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和5，非翻譯區(qū)的DNA 序列。在圖1中，蛋白合成的起始密碼子ATG帶有下劃線(xiàn)，而且轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的堿基A用+1 示出。并用啟動(dòng)子分析網(wǎng)站分析了啟動(dòng)子的核心元件。啟動(dòng)子分析網(wǎng)站http://www.dna. affrc. go. jp/PLACE/signalscan, html。以玉米基因組DNA (圖1)為模板，擴(kuò)增得到目的片段，經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳分析， 擴(kuò)增出長(zhǎng)度為2002bp的特異條帶(圖2)，并進(jìn)行回收(圖3)。電泳后回收目的片段，與 pMD 18-T載體連接得到重組質(zhì)粒pMD 18-T: ZmCIPK16Pro，提取質(zhì)粒并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(圖4)，酶切驗(yàn)證(圖5)，并測(cè)序。更具體地說(shuō)，通過(guò)PCR擴(kuò)增克隆的玉米CBL相互作用的蛋白激酶基因(ZmCIPK16) 的啟動(dòng)子和216bp的5’非翻譯區(qū)(見(jiàn)序列表)，上述PCR所用引物詳細(xì)顯示在表1中。對(duì)于PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序:95V 3min ；95°C 30S，58. 5°C 30S,72°C 2min，34個(gè)循環(huán)；72°C IOmin ；表1引物
權(quán)利要求
1.一種獲得的玉米干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列，其特征在于所述啟動(dòng)子序列包含相對(duì)于 SEQID NO 1的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的-Ibp至_177;3bp區(qū)的DNA核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的獲得的玉米干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列，其特征在于所述啟動(dòng)子序列源自玉米CBL相互作用的蛋白激酶基因(ZmCIPKie)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的獲得的玉米干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列，其特征在于一種克隆得到的玉米CBL相互作用的蛋白激酶基因(ZmCIPKie)的5’非翻譯區(qū)，5’非翻譯區(qū)包含相對(duì)于SEQ ID NO 1的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的+Ibp至+230bp區(qū)的DNA核苷酸序列。
4.一種用于玉米轉(zhuǎn)化的干旱誘導(dǎo)型的植物表達(dá)載體，其特征在于所述植物表達(dá)載體包含權(quán)利要求1的玉米干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列和權(quán)利要求3的玉米CBL相互作用的蛋白激酶基因(ZmCIPK16)5’非翻譯區(qū)。
5.一種用植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于所述轉(zhuǎn)基因植物包含權(quán)利要求1的玉米干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列和權(quán)利要求3的玉米CBL相互作用的蛋白激酶基因 (ZmCIPK16)5’ 非翻譯區(qū)。
6.SEQ ID NO :2和3的PCR引物，其特征在于所述引物適于擴(kuò)增包含SEQ ID NO 1的序列DNA片段。
全文摘要
玉米干旱誘導(dǎo)型基因啟動(dòng)子及活性分析屬生物工程技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明提供了一種獲得的玉米干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列，同時(shí)提供了用于玉米轉(zhuǎn)化的干旱誘導(dǎo)型的植物表達(dá)載體、用植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物和適于擴(kuò)增包含SEQ ID NO1序列DNA片段的PCR引物。本發(fā)明可用于啟動(dòng)抗旱基因的高效表達(dá)，應(yīng)用于耐旱的轉(zhuǎn)基因植物中，對(duì)于解決干旱地區(qū)糧食危機(jī)、生態(tài)惡化等問(wèn)題都有積極意義。
文檔編號(hào)C12N15/113GK102154289SQ20111000422
公開(kāi)日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2011年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月11日
發(fā)明者劉金亮, 張世宏, 李桂華, 潘洪玉, 胡瑞學(xué), 賈承國(guó) 申請(qǐng)人:吉林大學(xué)