專利名稱：抑制腫瘤生長及血管生成的寡聚核酸組合物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抑制腫瘤生長及血管生成的的寡聚核酸組合物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
微小核酸(miRNA)是一類非編碼小核酸，在體內(nèi)廣泛表達，調(diào)節(jié)機體重要的生理 與病理過程。微小核酸與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在 腫瘤組織和與正常組織間的表達明顯不同。miRNA既可以作為原癌基因促進腫瘤的發(fā)生發(fā) 展，又能作為抑癌基因抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展，根據(jù)miRNA調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生發(fā)展的不同機理，將 它們組成不同的配方或?qū)⑺鼈兣c其它抗腫瘤的小干擾RNA(SiRNA)組成不同的配方，將比 單一的miRNA更能有效地治療腫瘤性疾病。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種寡聚核酸。本發(fā)明提供的寡聚核酸是一種雙鏈RNA，其中所述雙鏈RNA的第一條鏈的核苷 酸序列如序列表中序列1所示；第二條鏈的核苷酸序列與所述第一條鏈的反向互補鏈具有 63. 6%以上的同源性。序列1從左至右方向為5’ -3，。上述第二條鏈的核苷酸序列可以如序列表中序列2或3所示。序列2和3從左至 右方向為3’ -5’。上述寡聚核酸經(jīng)過如1)或2、修飾得到的寡聚核酸1)對所述寡聚核酸的連接核苷酸的磷酸二酯鍵進行修飾，優(yōu)選將所述磷酸二酯鍵 的氧用硫取代；2)對所述寡聚核酸的核糖的2’_0H的修飾，優(yōu)選將所述2’_0H用甲氧基或氟取代 或者對所述2’ -OH進行脫氧修飾。表達出上述的寡聚核酸的DNA也屬于本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。本發(fā)明的另一目的在于提供一種抑制腫瘤生長的藥物組合物。本發(fā)明提供的抑制腫瘤生長的藥物組合物的活性成分是寡聚核酸組合物，可以是 如下a)或b)或c)a)由VEGF-siRNA或其修飾體與上述的寡聚核酸組成；b)由PTN-siRNA或其修飾體與上述的寡聚核酸組成；c)由VEGF-siRNA或其修飾體、PTN-siRNA或其修飾體與上述的寡聚核酸組成；所述VEGF-siRNA是雙鏈核苷酸，所述VEGF-siRNA的第一條鏈的核苷酸序列如序 列表中序列4所示，所述VEGF-siRNA的第二條鏈的核苷酸序列如序列表中序列5所示；序 列4從左至右方向為5’ _3’，序列5從左至右方向為3’ -5’。所述PTN-siRNA是雙鏈核苷酸，所述PTN-siRNA的第一條鏈的核苷酸序列如序列 表中序列6所示，所述PTN-siRNA的第二條鏈的核苷酸序列如序列表中序列7所示；序列6 從左至右方向為5’ -3’，序列7從左至右方向為3’ -5’。
所述VEGF-SiRNA的修飾體是經(jīng)過如下1)或幻修飾得到的物質(zhì)1)對所述VEGF-siRNA的連接核苷酸的磷酸二酯鍵進行修飾，優(yōu)選將所述磷酸二 酯鍵的氧用硫取代；2)對所述VEGF-siRNA的核糖的2’ -OH的修飾，優(yōu)選將所述2’ -OH用甲氧基或氟 取代或者對所述2’ -OH進行脫氧修飾；所述PTN-siRNA的修飾體是經(jīng)過如下1)或幻修飾得到的物質(zhì)1)對所述PTN-siRNA的連接核苷酸的磷酸二酯鍵進行修飾，優(yōu)選將所述磷酸二酯 鍵的氧用硫取代；2)對所述PTN-siRNA的核糖的2’_0H的修飾，優(yōu)選將所述2’_0H用甲氧基或氟取 代或者對所述2’ -OH進行脫氧修飾。其中，活性成分a)中，權(quán)利要求1-3中任一所述的寡聚核酸與所述VEGF-siRNA或 其修飾體的質(zhì)量比是(0.5-2) (0.5-2)，優(yōu)選是1 1;活性成分b)中，權(quán)利要求1-3中任一所述的寡聚核酸與所述PTN-siRNA或其修飾 體的質(zhì)量比是(0.5-2) (0.5-2)，優(yōu)選是1 1;活性成分c)中，權(quán)利要求1-3中任一所述的寡聚核酸與所述VEGF-s iRNA或其修 飾體、PTN-siRNA或其修飾體的質(zhì)量比是(0. 5-2) (0.5-2) (0.5-2)，優(yōu)選是1 1 1。上述藥物組合物包含上述寡聚核酸分子中的至少一種以及至少一種藥學(xué)上可接 受的載體。本文所用的“藥學(xué)上可接受的載體”應(yīng)當(dāng)與本發(fā)明藥物組合物中的雙鏈RNA分 子相容。在一個優(yōu)選實施例中，所述“藥學(xué)上可接受的載體”是指體內(nèi)轉(zhuǎn)染試劑，如聚乙烯 亞胺(PEI)，jetPEI (線性聚乙烯亞胺)，脂質(zhì)體，轉(zhuǎn)鐵蛋白，葉酸等。上述的寡聚核酸在制備抑制腫瘤生長的試劑或在制備抑制腫瘤細(xì)胞周期蛋白Dl 表達的試劑中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。進一步講，上述試劑可以是上述抑制腫瘤生長的藥物組合物。具體地講，上述腫瘤是腸癌、鼻咽癌、宮頸癌、肝癌、乳腺癌或肺癌。所述寡聚核酸為化學(xué)合成，可以進行2'氟代O' _F)、2'甲氧基O' -(Me)At 代(PS)和2'脫氧⑶-deoxy)化學(xué)修飾。用化學(xué)合成并修飾的上述寡聚核酸分子轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞株CNE、腸癌細(xì)胞株 HCT116、乳腺癌細(xì)胞株MCF7、宮頸癌細(xì)胞株Hela、肝癌細(xì)胞株H印G2等腫瘤細(xì)胞的實驗結(jié)果 表明所述寡聚核酸miR-210能有效抑制上述腫瘤細(xì)胞的增殖。siPTN也能抑制上述腫瘤細(xì) 胞的增殖。siVEGF和siPTN均能抑制腫瘤血管生成。所述寡聚核酸miR-210抑制CCNDl的表達；siVEGF抑制VEGF的表達，而siPTN抑 制PTN的表達。通過上述三種不同的寡聚核酸分子的組合，實現(xiàn)抑制腫瘤的生長和血管生 成的效果。將腫瘤細(xì)胞接種于裸鼠，形成腫瘤后用所述寡聚核酸治療的實驗證明所述寡聚核 酸組合能在體內(nèi)有效抑制腫瘤的生長。作為新型小核酸類的抗腫瘤藥物，化學(xué)合成并修飾的所述寡聚核酸不易被降解， 有較長的效應(yīng)半衰期，能用于體外實驗，更能用于體內(nèi)治療。


圖IA為MTT法檢測2’ -0Me-miR-210抑制鼻咽癌CNE細(xì)胞增殖的柱形圖，圖IB 為MTT法檢測2’ -OMe-siPTN抑制Hela細(xì)胞增殖的柱形圖。圖2為RT-PCR檢測2’ -0Me_miR-210#抑制腫瘤細(xì)胞CCNDl的表達。圖3為RT-PCR檢測2 ‘ -OMe-siVEGF抑制腫瘤細(xì)胞VEGF的表達。圖4為RT-PCR檢測2 ‘ -OMe-siPTN抑制腫瘤細(xì)胞的PTN表達，泳道1_4分 別為未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，轉(zhuǎn)染隨機序列的陰性對照(NC)，轉(zhuǎn)染2' -0Me-siPTN24小時，轉(zhuǎn)染 2' -OMe-siPTN 48 小時。圖5為2' -OMe寡聚核酸組合治療鼻咽癌移植瘤5次以后的瘤體積折線圖。圖6為2' -OMe寡聚核酸組合加治療鼻咽癌移植瘤6次以后的瘤重柱形圖。圖7為2' -OMe寡聚核酸組合治療鼻咽癌移植瘤6次以后腫瘤效果圖。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，但本發(fā)明并不限于以下實施例。下述實施例中，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。實施例1、寡聚核酸的制備本發(fā)明中所述寡聚核酸序列正義鏈為5’ -CUGUGCGUGUGACAGCGG CUGA-3' (SEQID No. 1)；反義鏈為 3' -UUGACACGCACACUGUCGCCGA-5‘序列 (SEQ ID No. 2)或 3，-CACACGCCACCCGUCCCCGACG-5，(SEQ ID No. 3)。 本發(fā) 明中 VEGF-siRNA 正義鏈為 5，-GGAGUACCCUGAUGAGAUCTT-3，(SEQ ID No. 4)； 反義鏈為 3' -TTCCUCAUGGGACUACUCUAG-5' (SEQ ID No.5) ；PTN-siRNA 正 義鏈為 5' -GCCCAAACCUCAAGCAGAATT-3' (SEQ ID No. 6)；反義鏈為 3，-TTCGGGUUUGGA⑶UC⑶CUU-5，(SEQ ID No. 7)；本發(fā)明中所述隨機序列作為陰性對照 (NC)，NC 的正義鏈序列為5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’ (SEQ ID No. 8)，反義鏈序列為 3，-TTAAGAGGCUUGCACAGUGCA-5，(SEQ ID No. 9)。所述寡聚核酸和 NC 序列中的 A、G、C、U 表 示腺嘌呤核糖核苷酸、鳥嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸和尿嘧啶核糖核苷酸，T表示 胸腺嘧啶脫氧核苷酸。所述寡聚核酸和NC委托上海吉瑪(GenePharma)制藥技術(shù)有限公司合成并進 行如下任意一種化學(xué)修飾2'甲氧基O' -OMe),2'氟代O' -F)、硫代和2'-脫氧 (2’ -deoxy)，然后經(jīng)凍干處理得到寡聚核酸粉末，用于實施例2_4中的實驗。實施例1中的5種寡聚核酸，分別是序列1和序列2配對成的寡聚核酸(命 名為miR-210)、序列1和序列3配對成的寡聚核酸(命名為miR-210**)、序列4和序列 5配對成的寡聚核酸(命名為VEGF-siRNA)、序列6和序列7配對成的寡聚核酸(命名為 PTN-siRNA)、序列8和序列9配對成的寡聚核酸陰性對照(命名為NC)。其中miR-210經(jīng)2'甲氧基修飾后命名為2' -0Me-miR-210 ；miR-210**經(jīng)上 述2'甲氧基修飾后命名為2' -0Me-miR-210# ;VEGF-siRNA經(jīng)2'甲氧基修飾后命名為 2' -OMe-siVEGF、PTN-siRNA 經(jīng) 2'甲氧基修飾后命名為 2' -OMe-siPTN。NC 經(jīng) 2‘甲氧 基修飾后命名為2' -0Me-NC。上述合成方法源自一篇1995年公開的文獻Wincott F, DiRenzo A, ShafferC, GrimmS, Tracz D, Workman C, Sweedler D, Gonzalez C, Scaringe S and Usman N. Synthesis, deprotection, analysis and purification of RNA and ribozymes. Nucleic Acids Res. 1995，23 :2677_84。整個化學(xué)合成可大致分成四個的過程(1)寡聚核 糖核酸的合成；( 脫保護；C3)純化分離；(4)脫鹽退火無菌消毒。(1)寡聚核糖核苷酸的合成在自動DNA/RNA 合成儀(例如，Applied Biosystems EXPEDITE8909)上設(shè)定 合成1毫摩爾的RNA，同時設(shè)定每個循環(huán)的偶聯(lián)時間為10-15分鐘，起始物為固相連接的 5’-0_對二甲氧基-胸苷支持物，第一個循環(huán)在固相支持物上連接一個堿基，然后在第η次
2)循環(huán)中，在第η-1次循環(huán)所連接的堿基上連接一個堿基，重復(fù)此循環(huán)直至完成 全部核酸序列的合成。(2)脫保護將連接有RNA的固相支持物加入到試管中，并在此試管中加入1毫升的乙醇/乙 胺(體積比為1 3)，然后密封，置于55-70°C溫箱中，孵育2-30小時，取出連接有siRNA 的固相支持物并用雙蒸水淋洗2次(每次1毫升)，收集洗脫液，并在室溫下干燥30分鐘。 然后，加入1毫升四丁基氟化銨的四氫呋喃溶液(IM)，室溫放置4-12小時，再加入2毫升乙 醇，收集沉淀即得到小RNA的粗產(chǎn)物。(3)純化分離將得到的RNA的粗產(chǎn)物溶解于2毫升濃度為1摩爾/毫升的乙酸銨水溶液中，然 后通過C18高壓液相色譜進行分離，得到純化的RNA產(chǎn)物。(4)脫鹽退火用濃度為75重量％的乙醇水溶液洗滌純化的RNA產(chǎn)物2_4次(每次2毫升)，以 除去鹽份，并室溫下干燥。然后將正義鏈和反義鏈的寡聚核糖核酸混合溶解在1-2毫升的 緩沖液中(IOmM Tris, pH = 7. 5-8. 0,50mM NaCl)，將此溶液加熱至95°C，然后緩緩將此溶 液冷卻至室溫，并維持室溫16-22小時，得到含有雙鏈微小RNA的溶液。實施例2、寡聚核酸miR-210和PTN_siRNA對腫瘤細(xì)胞增殖的影響實驗步驟為將實施例1得到的2 ‘ -0Me-miR-210 (圖中簡稱miR-210)和 2 ‘ -OMe-siPTN(圖中簡稱siPTN)和陰性對照2 ‘ -OMe-NC (圖中簡稱NC)粉末分別溶解 于無RNA酶的無菌水中，配成3種終濃度為20pmol/L的寡聚核酸溶液。收集對數(shù)期鼻咽癌 CNE細(xì)胞(購自上海細(xì)胞庫，供2' -0Me-miR-210和2' -OMe-NC轉(zhuǎn)染)或Hela細(xì)胞(購 自上海細(xì)胞庫，供2' -OMe-siPTN和2' -OMe-NC轉(zhuǎn)染)，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，分種于96孔 板，每孔150 μ 1共5000個細(xì)胞；置于37°C，含5% (X)2的孵箱中使細(xì)胞貼壁，培養(yǎng)6- 小 時。轉(zhuǎn)染時，分別將0.40μ1寡聚核酸溶液(上述2' -F寡聚核酸或2' -F寡聚核酸陰性 對照)和0. 20 μ 1的Iipofectamine 2000 (Invitrogen)分別稀釋于20 μ 1無血清培養(yǎng)培 養(yǎng)液(Opti-MEM)中，并在室溫下孵育5分鐘，然后將上述寡聚核酸溶液與lipofectamine 2000溶液混合，復(fù)合物于室溫靜置20分鐘后，把60ul的10 % FBS-DMEM加入40 μ 1的寡 聚核酸-脂質(zhì)體復(fù)合物中，再加到細(xì)胞培養(yǎng)板中(細(xì)胞生長融合率為50-70%)轉(zhuǎn)染6-8 小時。為使細(xì)胞同步，在轉(zhuǎn)染后將細(xì)胞血清饑餓12小時，之后用再換為2. 5% FBS-DMEM 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72小時；小心吸去上清120ul，使孔中生育培養(yǎng)液為80μ1，再加入 20μ lMTT(5mg/ml)，即0. 5 %的MTT繼續(xù)培養(yǎng)4小時；吸去上清加入100 μ 1的二甲基亞砜DMS0，在酶聯(lián)免疫檢測儀492nm處測量各孔的吸光值；同時設(shè)置調(diào)0孔(培養(yǎng)基，MTT, 二甲基亞砜)，每組設(shè)置3個復(fù)孔；結(jié)果如圖1所示，圖IA表明與轉(zhuǎn)染2' -OMe-NC比較， 轉(zhuǎn)染2' -0Me-miR-210(圖1A)或2' -0Me_siPTN(圖1B)的細(xì)胞OD值明顯降低，說明 2' -0Me-miR-210或2' -OMe-siPTN能明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。本實施例中，miR-210經(jīng)2'氟代O' -F)、硫代(PS)和2‘脫氧修飾后對腫瘤細(xì) 胞增殖的影響與經(jīng)2'甲氧基O' -OMe)修飾后的作用無顯著性差異。實施例3、寡聚核酸抑制其靶基因表達的RT-PCR檢測使用Irwi trogen的1 ipofectamine^OOO脂質(zhì)體進行轉(zhuǎn)染，所有操作均按 Invitrogen提供的操作規(guī)程。將CNE或Hela細(xì)胞接種到6孔板中(5X105個細(xì)胞/孔)，用 含10%胎牛血清的DMEM養(yǎng)液(購自GIBC0)培養(yǎng)16-24小時后，將細(xì)胞培養(yǎng)液換成含無抗生 素的 DMEM 培養(yǎng)液。將寡聚核酸粉末位‘-0Me-miR-210林、2' -0Me_siPTN、2' -OMe-siVEGF 和2 ‘ -OMe-NC)分別溶解于無RNA酶的無菌水中，配成終濃度為20pmol/L的寡聚核酸溶液。其中，2‘ -0Me-miR-210** 和 2 ‘ -OMe-NC 轉(zhuǎn)染 CNE 細(xì)胞；2 ‘ -OMe-siPTN 和 2' -OMe-NC 轉(zhuǎn)染 Hela 細(xì)胞；2' -OMe-siVEGF 和 2' -OMe-NC 轉(zhuǎn)染 CNE 細(xì)胞。轉(zhuǎn)染時，分別取10 μ 1的上述寡核苷酸溶液和5 μ 1的1 ipofectamine 2000分別 稀釋于250 μ 1無血清培養(yǎng)培養(yǎng)液(Opti-MEM)中，并在室溫下孵育5分鐘，然后將上述寡聚 核酸溶液與lipofectamine 2000溶液混合，復(fù)合物于室溫靜置20分鐘后，把500 μ 1的寡 聚核酸-脂質(zhì)體復(fù)合物與1. 5ml無血清DMEM培養(yǎng)液混合后，加到細(xì)胞培養(yǎng)板中，6小時后換 為10% FBS-DMEM培養(yǎng)基，分別于M、48收集細(xì)胞進行RT-PCR檢測。RT-PCR檢測的步驟為用Iml TRIzol (invitrogen)裂解轉(zhuǎn)染所述寡聚核酸或 寡聚核酸陰性對照的CNE或Hela細(xì)胞，并按TRIzol產(chǎn)品說明的操作規(guī)程提取總RNA。由 于RNA干擾的效果可能被潛在的少量的基因組DNA影響，實驗采用DNase I (RNase-free) (TaKaRa)來進一步消化降解總RNA中殘留的DNA。在用DNase I 37°C消化30分鐘后，按 照DNase I產(chǎn)品說明重新提純總RNA并對RNA進行定量和質(zhì)量鑒定。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)是使用 TaKaRa公司的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶體系，將Iug的總RNA與0. 5ug的Oligo dT混合，加熱5分 鐘，迅速冷卻至0°C。按產(chǎn)品說明加入緩沖液，42°C孵育1小時。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后的cDNA，作 為PCR反應(yīng)的模板檢測靶基因，轉(zhuǎn)染2 ‘ -0Me-miR-210**的樣本檢測CCNDl的表達，上游 引物為 5，-GCTGGAGCCCGTGAAAAAGA-3，，下游引物為 5，-CTCCGCCTCTGGCATTTTG-3，。轉(zhuǎn)染 2 ‘ -OMe-siVEGF 的樣本檢測 VEGF 表達上游引物為 5 ‘ -GAGGGCAGAATCATCACGAA-3 ‘；下游 引物為 5' -GGGAACGCTCCAGGACTTAT-3 ‘。轉(zhuǎn)染 2' -OMe-siPTN 的樣本檢測 PTN 表達，上游 引物為 5，-CACGGGAGGGCACTCGGACT-3，，下游引物為 5’ -GTCTTCTGGCATTCGGCATTG-3，。PCR 反應(yīng)體系為，94度5分鐘，94度1分鐘，M度30秒，72度20秒，共28個循環(huán)。將PCR產(chǎn)物 進行瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果如圖2-4所示，與轉(zhuǎn)染寡聚核酸的陰性對照組、2' -OMe-NC,圖中簡稱NC)比 較，轉(zhuǎn)染2' -0Me-miR-210**(圖中簡稱miR-210**)明顯抑制腫瘤細(xì)胞的CCNDl表達(圖 2)，轉(zhuǎn)染2' -OMe-siVEGF (圖中簡稱siVEGF)明顯抑制腫瘤細(xì)胞VEGF的表達(圖3)，而轉(zhuǎn) 染2' -OMe-siPTN明顯抑制腫瘤細(xì)胞的PTN表達(圖4)。圖2和圖3中，上圖為電泳圖， 下圖為凝膠圖像分析軟件將電泳帶轉(zhuǎn)化成相對表達量的直方圖。本實施例中，miR-210**經(jīng)2'氟代O' _F)、硫代(PS)和2‘脫氧修飾后對腫瘤細(xì)胞表達CCNDl的半衰期測試結(jié)果的影響與經(jīng)2'甲氧基O' -OMe)修飾后的影響無顯著 性差異。實施例4、2' -OMe寡聚核酸對腫瘤生長的抑制作用用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)鼻咽癌CNE細(xì)胞株，取對數(shù)生長期 的細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度5X IO7個細(xì)胞/ml。在5周齡的雄性BALB/ C裸鼠的背側(cè)翼部皮下注射0. Iml腫瘤細(xì)胞懸液，使其形成移植瘤。將裸鼠分為 A 組，分別為 2 ‘ -OMe-NC (簡稱 NC 組)，2 ‘ -0Me-miR-210 (簡稱 miR-210 組)， 2' -0Me-miR-210 加 2' -OMe-siVEGFA (簡稱 miR-210+siVEGF 組)，2 ‘ -OMe-siVEGF (簡 稱 siVEGF 組)，2 ‘ -0Me-siVEGF+2 ‘ -0Me_siPTN(簡稱 siVEGF+siPTN 組)， 2' -0Me-miR-210+2' -OMe-siPTR(簡稱miR-210+siPTN組)，2‘ -0Me-miR-210+2‘ -OMe-siVEGF+2' -OMe-siPTN(簡稱miR-210+siVEGF+siPTN組)，5 氟-脲嘧啶(簡稱 5' FU組)。 接種腫瘤細(xì)胞以后的第一天和第三天，分別進行1次尾靜脈注射。到腫瘤體積達50mm3后 改為瘤內(nèi)注射。各組的尾靜脈注射用的寡聚核酸制劑的配制方法是單寡聚核酸組(NC組、 miR-210組和siVEGF組)是用不含RNA酶的無菌水165 μ 1分別溶解100 μ g每組相應(yīng)的寡 聚核酸；雙寡聚核酸組(miR-210+siVEGF組、siVEGF+siPTN組和miR-210+siPTN組)是用 兩份不含RNA酶的無菌水87. 5 μ 1分別溶解每組內(nèi)的兩種50 μ g寡聚核酸后混合(總?cè)莘e 165ul)；三寡聚核酸組(miR-210+siVEGF+siPTN組)是用三份不含RNA酶的無菌水55 μ 1 分別溶解三種33. 3333 μ g的寡聚核酸后混合(總?cè)莘e165ul)。然后各組再加轉(zhuǎn)染劑jetPEI 10 μ 1 (購自Polyplus公司)，室溫孵育15分鐘后， 與等體積10%葡萄糖溶液混合起來，總體積350ul，在室溫孵育15分鐘后進行尾靜脈注射。 一次注射的寡核苷酸用量為IOOyg/只。5氟-脲嘧啶用法是25ng/kg/次，腹腔注射。瘤內(nèi)注射用的寡聚核酸制劑的配制方法是用不含RNA酶的無菌水11. 3μ 1溶解 的2' -OMe-寡聚核酸。單寡聚核酸組取11. 3μ 1不含RNA酶的無菌水溶解20yg的
寡聚核酸，雙寡聚核酸組用兩份不含RNA酶的無菌水5. 65 μ 1分別溶解每組內(nèi)的兩種10 μ g 寡聚核酸后混合(總?cè)莘e11. 3ul)，三寡聚核酸組用三份不含RNA酶的無菌水3. 77 μ 1分 別溶解三種6. 667 μ g寡聚核酸后混合(總?cè)莘e11. 3 μ 1)。轉(zhuǎn)染試劑的用量為1. 2 μ 1，加 入等體積10%葡萄糖溶液混合起來，總體積25ul瘤內(nèi)注射。一次注射的寡核苷酸用量為 20yg/點。每隔2天注射一次，瘤內(nèi)注射共5次。5氟-脲嘧啶用法是25ng/kg/次，腹腔 注射。接種后3天每隔兩天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤最長徑(L)和橫徑(S)，計算腫瘤的近似體 積。計算公式為V(mm3) =0.5XLXS2。瘤內(nèi)注射5次后結(jié)束實驗，處死裸鼠，取出腫瘤稱 重。圖5所示為治療后不同寡聚核酸組合的治療組和對照組的腫瘤體積對比的折線 圖，治療組腫瘤體積的增加明顯比對照組小，對照組腫瘤體積呈明顯上升趨勢。寡聚核酸組 合miR-210+s iVEGF的抑瘤效果最好。圖6表明治療以后在鼻咽移植腫瘤裸鼠模型上，治療組裸鼠的瘤重明顯比對照NC 組小，寡聚核酸組合miR-210+siVEGF的抑瘤率達到62. 41%。圖7為腫瘤治療以后，處理組和對照組的腫瘤治療效果圖。本實施例中，miR-210經(jīng)2'氟代O' -F)、硫代(PS)和2‘脫氧修飾后對對腫瘤生長的抑制作用與經(jīng)2'甲氧基O' -OMe)修飾后的影響無顯著性差異。表1為實驗結(jié)束以后小鼠血清AST檢測數(shù)據(jù)。檢測裸鼠天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 (AST)按照天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑盒(購自中生北控生物股份有限公司)說明書操作。 將試劑盒中的IOml/瓶R2(液體)加入到Rl (粉末)瓶中，溶解后即為工作液，置于室溫靜 置。取新鮮裸鼠無溶血血清20ul/孔，加入到96孔板中，將配制好的工作液200ul/孔也加 入到96孔板中，混合均勻。同時設(shè)定4個空白對照孔。在反應(yīng)溫度保溫1分鐘，在340nm 波長下讀取初始吸光度，同時開始計時，在精確1，2，3分鐘時，分別讀取吸光度，確定每分 鐘平均吸光度變化，按照說明書提供的公式進行計算，得到AST的數(shù)值。結(jié)果顯示與不用藥 的PBS組比較治療組的ALT數(shù)值無顯著性升高，說明所述寡聚核酸治療無明顯的肝臟毒性。表1向清AST檢測數(shù)據(jù)表
權(quán)利要求
1. 一種抑制腫瘤生長的組合物，其活性成分是如下a)或b)或c):a)由VEGF-siRNA或其修飾體與權(quán)利要求3_5中任一所述的寡聚核酸組成；b)由PTN-siRNA或其修飾體與權(quán)利要求3-5中任一所述的寡聚核酸組成；c)由VEGF-siRNA或其修飾體、PTN-siRNA或其修飾體與權(quán)利要求7-9中任一所述的寡 聚核酸組成；所述VEGF-siRNA是雙鏈核苷酸，其第一條鏈的核苷酸序列如序列表中序列4所示，第 二條鏈的核苷酸序列如序列表中序列5所示；所述PTN-siRNA是雙鏈核苷酸，其第一條鏈的核苷酸序列如序列表中序列6所示，第二 條鏈的核苷酸序列如序列表中序列7所示；所述VEGF-siRNA的修飾體是經(jīng)過如下1)或2~)修飾得到的物質(zhì)1)對所述VEGF-siRNA的連接核苷酸的磷酸二酯鍵進行修飾，優(yōu)選將所述磷酸二酯鍵 的氧用硫取代；2)對所述VEGF-siRNA的核糖的2’-OH的修飾，優(yōu)選將所述2’ -OH用甲氧基或氟取代 或者對所述2’ -OH進行脫氧修飾；所述PTN-siRNA的修飾體是經(jīng)過如下1)或2~)修飾得到的物質(zhì)1)對所述PTN-siRNA的連接核苷酸的磷酸二酯鍵進行修飾，優(yōu)選將所述磷酸二酯鍵的 氧用硫取代；2)對所述PTN-siRNA的核糖的2’-0H的修飾，優(yōu)選將所述2’_0H用甲氧基或氟取代或 者對所述2’ -OH進行脫氧修飾。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于活性成分a)中，權(quán)利要求3-5中任一所述的寡聚核酸與所述VEGF-siRNA或其修飾體 的質(zhì)量比是(0. 5-2) (0. 5- ，優(yōu)選是1:1;活性成分b)中，權(quán)利要求3-5中任一所述的寡聚核酸與所述PTN-siRNA或其修飾體的 質(zhì)量比是(0. 5-2) (0. 5- ，優(yōu)選是1:1;活性成分c)中，權(quán)利要求3-5中任一所述的寡聚核酸與所述VEGF-siRNA或其修飾體、 PTN-siRNA或其修飾體的質(zhì)量比是(0. 5-2) (0.5-2) (0.5-2)，優(yōu)選是1 1 1。
3.一種寡聚核酸，是雙鏈RNA，其特征在于所述雙鏈RNA的第一條鏈的核苷酸序列如 序列表中序列1所示；第二條鏈的核苷酸序列與所述第一條鏈的反向互補鏈具有63. 6%以 上的同源性。
4.如權(quán)利要求3所述的寡聚核酸，其特征在于所述第二條鏈的核苷酸序列如序列表 中序列2或3所示。
5.如權(quán)利要求3或4所述的寡聚核酸，其特征在于所述寡聚核酸經(jīng)過如下1)或2)修 飾得到的寡聚核酸1)對所述寡聚核酸的連接核苷酸的磷酸二酯鍵進行修飾，優(yōu)選將所述磷酸二酯鍵的氧 用硫取代；2)對所述寡聚核酸的核糖的2’-0H的修飾，優(yōu)選將所述2’-0H用甲氧基或氟取代或者 對所述2’ -OH進行脫氧修飾。
6.表達出權(quán)利要求3-5中任一所述的寡聚核酸的DNA。
7.權(quán)利要求3-5中任一所述的寡聚核酸在制備抑制腫瘤生長的試劑或在制備抑制腫瘤細(xì)胞周期蛋白Dl表達的試劑中的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述試劑是權(quán)利要求3-5中任一所述的藥 物組合物。
9.如權(quán)利要求1或2所述的組合物，其特征在于所述腫瘤是腸癌、鼻咽癌、宮頸癌、肝 癌、乳腺癌或肺癌。
10.如權(quán)利要求7或8所述的應(yīng)用，其特征在于所述腫瘤是腸癌、鼻咽癌、宮頸癌、肝 癌、乳腺癌或肺癌。
全文摘要
本發(fā)明公開了一組抑制腫瘤生長及血管生成的寡聚核酸組合物及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的寡聚核酸組合的主要成分是一種雙鏈RNA，其中所述雙鏈RNA的第一條鏈的核苷酸序列如序列表中序列1所示；第二條鏈的核苷酸序列與所述第一條鏈的反向互補鏈具有63.6％以上的同源性。本發(fā)明提供的寡聚核酸組合作為新型小核酸類的抗腫瘤藥物，組合中所有的寡聚核酸成分均為化學(xué)合成并修飾的寡聚核酸，其特點是不易被降解，有較長的效應(yīng)半衰期，能用于體外實驗，更能用于體內(nèi)治療。部分寡聚核酸組合較單一成分有好的抗腫瘤效果。
文檔編號C12N15/113GK102125696SQ20111000458
公開日2011年7月20日 申請日期2011年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月11日
發(fā)明者何杰, 張佩琢, 張雅鷗, 徐乃寒, 李建娜, 謝偉東 申請人:上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司, 清華大學(xué)深圳研究生院