專利名稱：一種對(duì)阪崎腸桿菌o抗原特異的核苷酸及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種對(duì)阪崎腸桿菌0抗原基因簇特異的核苷酸及其應(yīng)用，尤其涉及一種對(duì)阪崎腸桿菌0抗原基因簇中單個(gè)基因特異的核苷酸及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
阪崎腸桿菌是人和動(dòng)物的腸道寄生菌和條件致病菌，已被世界衛(wèi)生組織和許多國(guó)家確定為引起嬰幼兒死亡的重要條件致病菌，可導(dǎo)致任何年齡層人群的疾病，尤其是對(duì)早產(chǎn)兒、出生體重輕的嬰兒或免疫受損嬰兒的威脅最大，嚴(yán)重者可導(dǎo)致敗血癥、腦膜炎或壞死性小腸結(jié)腸炎，死亡率可達(dá)40% 80%。目前，微生物學(xué)家尚不清楚阪崎腸桿菌的污染來(lái)源，但多份研究報(bào)告表明嬰兒配方奶粉是當(dāng)前發(fā)現(xiàn)致嬰兒、早產(chǎn)兒腦膜炎、敗血癥和壞死性結(jié)腸炎的主要感染渠道，阪崎腸桿菌已引起世界多國(guó)相關(guān)部門的重視，已被列為嬰兒配方奶粉的A類致病菌。

目前阪崎腸桿菌的分類地位剛剛建立，其0抗原血清型的研究也逐漸成為熱點(diǎn)。 脂多糖是革蘭式陰性細(xì)菌的主要表面成分，包括類脂A，核心多糖和0抗原。0抗原是革蘭氏陰性細(xì)菌脂多糖分子的最外層結(jié)構(gòu)，它是由多個(gè)寡糖重復(fù)單位組成的多糖鏈，重復(fù)單位一般由3 6個(gè)單糖組成。在大腸桿菌、沙門氏菌和志賀氏菌中，負(fù)責(zé)0抗原合成的基因相鄰排列于兩個(gè)持家基因galF和gnd之間，在染色體上形成一個(gè)基因簇。0抗原基因簇內(nèi)部的基因通常分為三類單糖合成酶基因、糖基轉(zhuǎn)移酶基因和寡糖單位處理酶基因。單糖合成酶負(fù)責(zé)單糖前體的合成，糖基轉(zhuǎn)移酶負(fù)責(zé)將單糖串聯(lián)成寡糖重復(fù)單位，而寡塘單位處理酶負(fù)責(zé)將寡糖單位從內(nèi)膜內(nèi)側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)膜外側(cè)，并將寡糖單位進(jìn)行串聯(lián)。脂多糖特別是其中的0-抗原的組成和結(jié)構(gòu)的變化決定了革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞表面抗原決定簇的多樣性，比如國(guó)際上根據(jù)脂多糖的結(jié)構(gòu)特性而鑒定過(guò)沙門氏菌屬的抗原類型多達(dá)2107個(gè)。血清分型是一種經(jīng)典和常用的流行病學(xué)調(diào)查手段，對(duì)于臨床研究及疫苗研制具有重要意義。這種診斷方法需要大量的抗血清，而抗血清一般種類不全，數(shù)量不足，大量的抗血清在制備和儲(chǔ)存中也存在一些困難。另一方面此法耗時(shí)長(zhǎng)、靈敏度低、漏檢率高、 準(zhǔn)確性差，不同的0抗原產(chǎn)生的抗血清之間經(jīng)常存在交叉反應(yīng)。因此，建立基于分子生物學(xué)技術(shù)的血清鑒定方法成為目前的發(fā)展方向。現(xiàn)在普遍認(rèn)為這種傳統(tǒng)的血清學(xué)檢測(cè)方法將為現(xiàn)代分子生物學(xué)方法取代。近年來(lái)，越來(lái)越多的分子技術(shù)用于病原菌的分型、鑒定、檢測(cè)及病害診斷，包括轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)序列分析、隨機(jī)擴(kuò)增長(zhǎng)度多態(tài)性(RAPD)分析、核糖體DNA限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)分析等。分子生物學(xué)方法不僅可用于阪崎腸桿菌的快速血清分型篩查，穩(wěn)定的鑒定結(jié)果可以彌補(bǔ)表型特征鑒定方法的不足。和傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)相比，這些基于多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的分子檢測(cè)技術(shù)，不需要經(jīng)過(guò)病原菌的分離、純培養(yǎng)等過(guò)程，而且具有快速、 靈敏、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。不同抗原的糖基轉(zhuǎn)移酶和寡糖單位處理酶的序列同源性很低，具有高度的血清型特異性，可用作靶基因進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。寡糖單位處理酶基因包括0抗原轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因(wzx)和O抗原聚合酶基因(wzy)。利用上述兩個(gè)基因作為血清型分型檢測(cè)的特異靶基因 是十分理想的。如大腸桿菌(王威，彭霞，2006年)、變形桿菌和沙門氏菌均有利用該基因做特異檢測(cè)的實(shí)例。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(Polymerase chain reaction，簡(jiǎn)稱PCR技術(shù))作為微生物檢測(cè)技術(shù)目前正在得到認(rèn)同和推廣，該技術(shù)相對(duì)于傳統(tǒng)的方法有高通量、檢測(cè)速度快、特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，只需對(duì)樣品進(jìn)行簡(jiǎn)單的預(yù)增菌或增菌過(guò)程，再通過(guò)離心及裂解制備細(xì)菌DNA模板，就可以在高特異性引物介導(dǎo)下的PCR過(guò)程中擴(kuò)增目標(biāo)序列，達(dá)到檢測(cè)樣品中是否含有待測(cè)的致病性微生物的目的。PCR的擴(kuò)增過(guò)程僅需1個(gè)半小時(shí)。這對(duì)檢驗(yàn)檢疫部門和臨床檢驗(yàn)無(wú)疑極大提高了工作速度和降低了工作成本。不論從國(guó)內(nèi)和國(guó)際的角度來(lái)看，快速、準(zhǔn)確地鑒定出血清類型，為阪崎腸桿菌的防控提供有效技術(shù)支持是十分重要的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種對(duì)阪崎腸桿菌抗原特異的核苷酸，所述核苷酸包括DSEQ ID NO :1_15所示核苷酸中的至少一種；2)與SEQ ID NO :1_15所示核苷酸互補(bǔ)的核苷酸中的至少一種。本發(fā)明進(jìn)一步公開了核苷酸序列在制備檢測(cè)阪崎腸桿菌用PCR試劑盒或基因芯片方面的應(yīng)用。本發(fā)明還公開了一種快速檢測(cè)臨床標(biāo)本的PCR試劑盒，該試劑盒包括PCR引物、 dNTP、緩沖液和DNA聚合酶，所述PCR引物包括SEQ ID NO 1_15所示的核苷酸中的至少一種。該試劑盒包括PCR引物、dNTP、緩沖液和DNA聚合酶，所述PCR引物包括SEQ IDNO 1-15所示的核苷酸中的至少一種；其中10 μ M引物各0.5 μ 1，IOmM dNTP 0. 5 μ 1，10 X酶特異性反應(yīng)緩沖液2. 5μ l,5U/y 1耐熱DNA聚合酶0. 3 μ 1，25mM MgCl22. 5 μ 1，余下的體積在除去5 μ 1待測(cè)樣品的量后用ddH20補(bǔ)足至25 μ 1。本發(fā)明公開的對(duì)阪崎腸桿菌0抗原基因簇中單個(gè)基因特異的核苷酸及其應(yīng)用與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)(1)實(shí)用性強(qiáng)本發(fā)明提供血清分型檢測(cè)所用到的特異引物，利用該P(yáng)CR方法可以對(duì)臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。最終能夠利用PCR的方法檢測(cè)鑒別7個(gè)血清型。本發(fā)明所配制的PCR試劑盒等配制方法簡(jiǎn)便，檢測(cè)周期短、速度快，可操作性強(qiáng)， 易于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，而檢測(cè)成本卻相對(duì)較低。(2)準(zhǔn)確性高本發(fā)明通過(guò)對(duì)阪崎腸桿菌的各血清型特異的基因wzx和wzy的PCR反應(yīng)，每個(gè)樣品得到一條目的條帶，將得到目的片段與已知長(zhǎng)度相比較，就可以得到阪崎腸桿菌所屬的
血清型。(3)靈敏度高本發(fā)明提供的檢測(cè)引物及阪崎腸桿菌檢測(cè)試劑盒等具有較高的敏感性，檢測(cè)精度高，可以檢測(cè)到Ing/ μ 1的DNA模板。


圖1表示Olwzy基因Pl和P2引物的篩選，目的條帶為364bp，其余的血清型沒(méi)有任何條帶。圖2表示02wzy基因P3和P4引物的篩選，目的條帶為473bp，其余的血清型沒(méi)有任何條帶。圖3表示03wzy基因P5和P6引物的篩選，目的條帶為704bp，其余的血清型沒(méi)有任何條帶。圖4表示04wzy基因P7和P8引物的篩選，目的條帶為890bp，其余的血清型沒(méi)有任何條帶。圖5表示05wzy基因P9和PlO引物的篩選，目的條帶為235bp，其余的血清型沒(méi)有任何條帶。圖6表示06wzx基因Pll和P12引物的篩選，目的條帶為615bp，其余的血清型沒(méi)有任何條帶。圖7表示07wzy基因P13和P14引物的篩選，目的條帶為424bp，其余的血清型沒(méi)有任何條帶。圖8表示種特異性的鑒定，其中檢測(cè)了種間的四株細(xì)菌和其他種屬四株細(xì)菌，均無(wú)任何條帶。具體菌株信息見表2。圖9表示PCR試劑盒應(yīng)用分型結(jié)果，能夠檢測(cè)出相應(yīng)0型的菌株并且非對(duì)應(yīng)0型無(wú)條帶。其中01、02、03、04、05、06、07和負(fù)對(duì)照(-)表示相應(yīng)血清型引物擴(kuò)增結(jié)果，最后 —^h^lcit^ 2000bp ladder marker。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York =Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件。實(shí)施例1 基因組的提取370C LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)阪崎腸桿菌，收集細(xì)菌，提取基因組具體步驟如下用500ul 50mM Tris-HCl (ρΗ8· 0)和 IOul 0. 4Μ EDTA 重懸細(xì)胞，37°C溫育 20 分鐘，然后加入IOul 10mg/ml的溶菌酶繼續(xù)保溫20分鐘。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶 K、15ul 10% SDS，50°C溫育2小時(shí)，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65°C溫育30分鐘。加等體積酚抽提混合物，取上清液，再用等體積的酚氯仿異戊醇(25 24 1)溶液抽提兩次，取上清液，再用等體積的乙醚抽提以除去殘余的酚。上清液用2倍體積乙醇沉淀DNA， 用玻璃絲卷出DNA并用70%乙醇洗DNA，最后將DNA重懸于30ul TE中?；蚪MDNA通過(guò) 0. 4%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。實(shí)施例2 序列破譯(1)通過(guò)Long-PCR擴(kuò)增阪崎腸桿菌的0抗原基因簇。根據(jù)Genbank中g(shù)alF基因和O抗原基因簇之間的JumpStart設(shè)計(jì)上游引物為wl_10324，5，_GCACTGGTAGCTATTGAGCCA GGGGCGGTAGCAT-3，，再根據(jù) gnd 基因設(shè)計(jì)下游引物為 wl_22115，-ACTGCCATACCGACGACGCCGA TCTGTTGCTTGG-3，(分別為 SEQ ID NO 15-16)。PCR反應(yīng)程序如下在94°C預(yù)變性5分鐘；然后94°C變性30秒，61°C退火30秒， 680C延伸15分鐘，這樣進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后，在68°C繼續(xù)延伸8分鐘，得到PCR產(chǎn)物，用 0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物的大小及其特異性，合并8管50μ1 long PCR產(chǎn)物， 并用Promega公司的Wizard PCR Preps純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物。(2)構(gòu)建0抗原基因簇文庫(kù)用shot-gun法構(gòu)建0抗原基因簇文庫(kù)，反應(yīng)體系是 600ngPCR純化產(chǎn)物，經(jīng)過(guò)核酸片段儀剪切成1 3kb片段、補(bǔ)平粘性術(shù)端、pUC18的載體連接(采用fastlink ligase)連接得到測(cè)序的基因文庫(kù)。(3)對(duì)文庫(kù)中的克隆測(cè)序從文庫(kù)中挑選插入片段在Ikb以上的200個(gè)克隆用本實(shí)驗(yàn)室ABI3730型DNA自動(dòng)測(cè)序儀對(duì)克隆中的插入片段進(jìn)行測(cè)序，序列達(dá)到8 10倍的覆蓋率，從而獲得0抗原基因簇的所有序列。(4)核苷酸序列的拼接及分析用英國(guó)劍橋MRC分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室出版的 Stadenpackage軟件包的Pregap4和Gap4軟件拼接和編輯所有的序列后，用美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息學(xué)中心的orf finder發(fā)現(xiàn)基因，找到開放的閱讀框，用blast系列軟件與GenBank 中的基因比較以發(fā)現(xiàn)這些開放的閱讀框的功能并確定它們是什么基因，再用英國(guó)Sanger 中心的Artemis軟件完成基因注釋，用Clustral W軟件做DNA和蛋白質(zhì)序列間的精確比對(duì)， 最后得到阪崎腸桿菌的基因簇的序列。實(shí)施例3 引物設(shè)計(jì)及篩選根據(jù)基因簇破譯情況，我們發(fā)現(xiàn)wzy和WZX基因確實(shí)是血清型特異的基因，所以選取該基因特異區(qū)段設(shè)計(jì)特異引物。由于wzy更加特異，所以主要以wzy基因?yàn)榘谢?，但是因?yàn)橛?6血清型中不含該基因，所以該血清型以wzx為靶基因設(shè)計(jì)引物。引物設(shè)計(jì)是該發(fā)明的核心部分。設(shè)計(jì)引物根據(jù)文獻(xiàn)中敘述的特異基因來(lái)設(shè)計(jì)。wzx 和wzy這兩個(gè)基因是阪崎腸桿菌0抗原基因簇中比較特異的基因，可以作為血清型鑒定的靶基因。將上述基因?qū)隤rimer Premier 5進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物的長(zhǎng)度最好在18 24bp 之間，Tm值在50 55°C。每個(gè)基因設(shè)計(jì)一對(duì)引物，有單一目的條帶。引物設(shè)計(jì)之后在Genbank中進(jìn)行BLAST，設(shè)計(jì)的引物不能與其它近緣細(xì)菌的序列相似性過(guò)高，這樣就能確保該引物只在自己的預(yù)定位置進(jìn)行擴(kuò)增，而不與其它的近緣菌或者采集標(biāo)本的環(huán)境中的近緣菌不產(chǎn)生陽(yáng)性反應(yīng)。這一點(diǎn)對(duì)于避免非特異條帶的產(chǎn)生和實(shí)驗(yàn)的成敗十分重要。設(shè)計(jì)出的引物如表1所示。表1用于PCR的引物序列
權(quán)利要求
1.一種對(duì)阪崎腸桿菌0抗原特異的核苷酸，其特征在于核苷酸包括1)SEQID NO :1-15所示核苷酸中的至少一種;2)與SEQID NO :1-15所示核苷酸互補(bǔ)的核苷酸中的至少一種。
2.權(quán)利要求1所述核苷酸序列在制備檢測(cè)阪崎腸桿菌用PCR試劑盒或基因芯片方面的應(yīng)用。
3.—種PCR試劑盒，其特征在于該試劑盒包括PCR引物、dNTP、緩沖液和DNA聚合酶，所述PCR引物包括SEQ ID NO :1-15所示的核苷酸中的至少一種；其中10 μ M引物各0. 5 μ 1， IOmM dNTP 0. 5 μ 1，IOX酶特異性反應(yīng)緩沖液2. 5 μ 1，5U/μ 1耐熱DNA聚合酶0. 3 μ 1，25mM MgCl22. 5 μ 1，余下的體積在除去5 μ 1待測(cè)樣品的量后用ddH20補(bǔ)足至25 μ 1。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種對(duì)阪崎腸桿菌(Cronobacter sakazakii)O抗原特異的核苷酸及其應(yīng)用，所述核苷酸包括1)SEQ ID NO1-14所示的核苷酸中的至少一種；2)與SEQ ID NO1-14所示的核苷酸互補(bǔ)的核苷酸中的至少一種。這些核苷酸可用于制備檢測(cè)阪崎腸桿菌用PCR試劑盒和基因芯片。本發(fā)明的對(duì)阪崎腸桿菌O抗原特異的核苷酸及包含該核苷酸的PCR試劑盒、基因芯片實(shí)用性強(qiáng)，PCR試劑盒配制方法簡(jiǎn)便，檢測(cè)周期短、速度快，可操作性強(qiáng)，易于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，而檢測(cè)成本卻相對(duì)較低；準(zhǔn)確性高；靈敏度高。
文檔編號(hào)C12Q1/10GK102154270SQ201110004830
公開日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2011年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月11日
發(fā)明者何欣, 孫亞民, 曹勃陽(yáng), 王敏, 王磊 申請(qǐng)人:天津生物芯片技術(shù)有限責(zé)任公司