專利名稱：用于抑制流行性乙型腦炎病毒的siRNA的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能誘導(dǎo)RNA干擾的小干擾RNA(SiRNA)，特別是涉及能夠抑制流行性乙型腦炎病毒的siRNA，及其設(shè)計(jì)方法和用途。
背景技術(shù)：
流行性乙型腦炎病毒簡(jiǎn)稱乙腦病毒，是經(jīng)蚊蟲(chóng)傳播的人畜共患急性傳染病，是在全球范圍內(nèi)引起人腦炎的最嚴(yán)重的病因之一。1871年，日本首次報(bào)道了該病的流行，1935 年日本學(xué)者從病死的腦炎病人的腦組織中分離到該病毒，所以國(guó)際上將該病原體命名為日本腦炎病毒(Japanese encephalitisvirus, JEV)。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，全球每年平均發(fā)病50000 例，死亡15000例。大約三分之一的患者會(huì)因此而死亡，存活的患者中有神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的患者占40% -70%,該病主要流行于亞洲、東南亞地區(qū)約20多個(gè)國(guó)家。20世紀(jì)90年代以來(lái)， 乙腦的流行區(qū)域不斷擴(kuò)大，1995年巴布亞新幾內(nèi)亞及澳大利亞北部島嶼出現(xiàn)乙腦的爆發(fā)流行，1998年在澳大利亞本土出現(xiàn)乙腦病例。2005年乙腦在印度和尼泊爾爆發(fā)流行，數(shù)千人患病。我國(guó)地域廣闊，占亞洲四分之一區(qū)域，中國(guó)的乙腦發(fā)病數(shù)占全世界總發(fā)病數(shù)的80%以上，是乙腦流行大國(guó)。根據(jù)《中華人民共和國(guó)傳染病防治法》，流行性乙型腦炎屬于乙類傳染病。自1938年通過(guò)血清學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)乙腦在中國(guó)流行并于1940年在北京分離到第一株乙腦病毒后，乙腦多次在我國(guó)境內(nèi)爆發(fā)。近十年來(lái)，雖然乙腦的發(fā)病數(shù)呈逐年降低的趨勢(shì)，亦未發(fā)生大流行，但每年仍有2萬(wàn)-3萬(wàn)的病例數(shù)。乙型腦炎同時(shí)也是一種人畜共患的自然疫源性傳染病，在動(dòng)物中豬為本病的主要危害對(duì)象。據(jù)報(bào)道豬群的發(fā)病率一般為20-30%，初產(chǎn)母豬的死胎和木乃伊比例可達(dá)50% 左右。因此該病感染豬造成的主要經(jīng)濟(jì)損失是懷孕母豬發(fā)生繁殖障礙，嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的健康穩(wěn)定發(fā)展。針對(duì)乙型腦炎尚無(wú)特殊治療措施，接種疫苗依然是保護(hù)易感人群的最有效預(yù)防措施。雖然接種疫苗能有效地保護(hù)未感染人群，但對(duì)于已感染的乙腦病患者，缺乏有力的治療手段，所以，應(yīng)用現(xiàn)代科技手段發(fā)展方便有效的抑制乙腦病毒感染的治療方法法就顯得尤為重要。乙腦病毒在分類上屬于黃病毒科，黃病毒屬，其基因組為單股正鏈RNA分子， 長(zhǎng)約111Λ，分子量約為4X IO6道爾頓，沉降系數(shù)為42s。整個(gè)基因組由5’端非翻譯區(qū) (5’ -untranslated regions, UTR)，一個(gè)幾乎跨越整個(gè)基因組的單一開(kāi)放閱讀框(open reading frame, 0RF)和3，端非翻譯區(qū)(3，-UTR)所構(gòu)成。5，端95個(gè)核苷酸和3，端586 個(gè)核苷酸為非編碼區(qū)，從5’末端至3’末端編碼的基因順序?yàn)槿齻€(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，包括衣殼蛋白C(Capsid)，膜蛋白M(membrane，PrM為前體)和囊膜蛋白E (envelope)，七個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白 NSl，NS2A, NS2B，NS3，NS4A，NS4B和NS5，共編碼約；3430個(gè)氨基酸，其基因組結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。根據(jù)乙腦病毒基因組的核苷酸序列差異性，可將已鑒定的乙腦病毒毒株分為四個(gè)確定的基因型以及另外一個(gè)推測(cè)的基因型。基因1型和基因3型主要分布于中國(guó)、韓國(guó)、印度、泰國(guó)、菲律賓等大多數(shù)亞洲國(guó)家，為主要的流行基因型?；?型和基因4型主要分布于馬來(lái)西亞、印度尼西亞和北澳大利亞等國(guó)家，為地方性的基因型。RNA干擾(RNA interfering, RNAi)技術(shù)是近年來(lái)新發(fā)展起來(lái)的一種高效的、特異性強(qiáng)的基因阻斷技術(shù)，是一種由雙鏈RNA (dsRNA)或微RNA(microRNA，mi RNA)介導(dǎo)的、轉(zhuǎn)錄后mRNA水平關(guān)閉相應(yīng)基因表達(dá)的序列特異性基因沉默機(jī)制。它也是體內(nèi)基因組抵御外在感染和內(nèi)部轉(zhuǎn)座的一種保護(hù)機(jī)制，廣泛存在于各種生物，如植物、真菌、昆蟲(chóng)、后生動(dòng)物和哺乳動(dòng)物，包括人類。對(duì)外源dsRNAs來(lái)說(shuō)，當(dāng)dsRNAs被導(dǎo)入體內(nèi)后，dsRNA被Dicer切割成 21-25nt 的小干擾 RNAs (small interfering RNAs, siRNAs)。這些 siRNAs 結(jié)合 RNA 依賴性沉默復(fù)合體(RISC)后特異性降解序列上同源的靶標(biāo)mRNAs。對(duì)于內(nèi)源性miRNAs來(lái)說(shuō)，RNA 的源轉(zhuǎn)錄本(primary RNAtranscripts，pri-miRNAs)在細(xì)胞核內(nèi)被Drosha切割成60_70nt 的miRNA前體(miRNA precursors, pre-miRNAs)后被Exportin-5轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)中，在細(xì)胞質(zhì)中，pre-miRNAs被Dicer切割成成熟的miRNAs。成熟的miRNAs行使切割靶標(biāo)mRNA或者抑制翻譯的作用。大多數(shù)的pri-miRNA轉(zhuǎn)錄本都以成簇的形式排列在RNA聚合酶II啟動(dòng)子下，以多順?lè)醋拥男问奖磉_(dá)多個(gè)不同的miRNAs。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，外源導(dǎo)入化學(xué)合成的 21-29nt 的 siRNAs 或者短發(fā)卡 RNA (short hairpin RNA, shRNA)表達(dá)載體均能誘導(dǎo) RNAi。 它的作用在基因功能研究領(lǐng)域和各種疾病的治療領(lǐng)域尤其是病毒性疾病的治療領(lǐng)域已顯現(xiàn)出不可估量的價(jià)值。通過(guò)RNAi技術(shù)，選擇不同的靶位點(diǎn)應(yīng)用SiRNA抑制病毒復(fù)制與侵染已在多種病毒中公開(kāi)。針對(duì)乙腦病毒，以往的研究已有報(bào)道能有效抑制乙腦病毒復(fù)制的siRNAs或者 shRNAs。但這些報(bào)道的siRNAs或者shRNAs均只針對(duì)基因3型中的某一株乙腦病毒，這一特性使其效果受到極大的限制，因?yàn)?，由于乙腦病毒基因組RNA序列的多變性，針對(duì)基因三型中某一株病毒有效的siRNA很難保證在基因3型中的其它株中有效，即使能在基因3型中適用，也很難保證其能在其他三種基因型中適用。另外，長(zhǎng)期處于RNAi抑制下的病毒會(huì)在其靶序列的位置出現(xiàn)逃逸突變，單個(gè)或兩個(gè)siRNAs很容易會(huì)由于逃逸突變的產(chǎn)生而失去效果。所以，最有效的抑制病毒復(fù)制的手段是針對(duì)乙腦病毒保守區(qū)靶序列的多條siRNAs 的聯(lián)合用藥。而這一方案在以往針對(duì)乙腦病毒的siRNAs的設(shè)計(jì)中并未涉及到。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明應(yīng)用RNAi技術(shù)，通過(guò)針對(duì)乙腦病毒基因組保守區(qū)的siRNA進(jìn)行乙腦病毒的抑制研究，并驗(yàn)證了多個(gè)siRNA同時(shí)應(yīng)用的有效性。具體地，本發(fā)明包括以下幾個(gè)方面本發(fā)明的一個(gè)方面涉及誘導(dǎo)RNA干擾的分子，其包括正義鏈和反義鏈，其特征在于所述正義鏈或反義鏈選自以下(1)-(5)的序列(I)SEQ ID NO :1 SEQ ID NO :9 以及 SEQ ID N0:33 SEQ IDNO :50 所示任一序列；(2)與 SEQ ID NO 1 SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :33 SEQ IDNO 50 中任一序列的同一性至少為70%的序列；(3)經(jīng)過(guò)改造的選自(1)或(2)中的序列，其是在所述序列的5’方向和3’方向、 5’方向或3’方向上添加有至多60個(gè)核苷酸的序列；(4)將選自(1)-(3)的序列按照5’ -3’方向可操作地串聯(lián)得到的序列，其中可操作地串聯(lián)的序列為1種，其拷貝數(shù)為2個(gè)或者2個(gè)以上；和
(5)將選自(1)-(3)的序列按照5’ -3’方向可操作地串聯(lián)得到的序列，其中可操作地串聯(lián)的序列為2種以上，每1種的拷貝數(shù)至少為1。其中(2)的同一性優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少84%，更優(yōu)選至少89%，更優(yōu)選至少 94%。其中( 中添加的核苷酸個(gè)數(shù)為至多50個(gè)，優(yōu)選至多40個(gè)，更優(yōu)選至多30個(gè)，更優(yōu)選至多20個(gè)，最優(yōu)選至多10個(gè)。其中(4)所述的序列為將3個(gè)、6個(gè)或9個(gè)拷貝的SEQ ID NO :2、SEQID NO 34或 SEQ ID NO 43的序列可操作地串聯(lián)得到的序列，例如為SEQID NO 51 SEQ ID NO 53所示序列；其中(5)所述的序列為將SEQ ID NO :1 4、SEQ ID NO 5 9、SEQ ID NO :1 9、SEQ ID NO 33 36、SEQ IDNO 37 41、SEQ ID NO 33 41、SEQ ID NO 42 45、SEQ ID NO 46 50或SEQ ID NO 42 50的序列可操作地串聯(lián)得到的序列，例如為SEQ IDNO 54 SEQ ID NO 56所示序列。本發(fā)明的另一方面涉及一種重組載體，其可操作地連接有本發(fā)明所述的誘導(dǎo)RNA 干擾的分子。本發(fā)明的還一方面涉及一種組合物，其含有本發(fā)明所述的誘導(dǎo)RNA干擾的分子或者重組載體，以及藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明的還一方面涉及獲得抑制流行性乙型腦炎病毒的誘導(dǎo)RNA干擾的分子的方法，其包括(1)根據(jù)流行性乙型腦炎病毒的全基因組序列，選取在基因1型、2型、3型和4型分離株中的保守序列，作為潛在的靶序列；(2)將(1)中的潛在的靶序列與人類基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，排除和人類基因組中其它編碼序列或表達(dá)序列標(biāo)簽同源的序列，將剩余的序列作為靶序列；和(3)根據(jù)步驟(2)獲得的靶序列合成誘導(dǎo)RNA干擾的分子。其中所述的保守序列是指在基因1型、2型、3型和4型分離株的全基因組序列中 80%以上保守的序列，并且在基因1型和3型分離株的全基因組序列中90%以上保守的序列。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，為在基因1型和3型分離株的全基因組序列中95%以上保守的序列。其中，步驟(3)中所述的靶序列選自兩種或兩種以上流行性乙型腦炎病毒蛋白的轉(zhuǎn)錄子序列。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，其中所述兩種或兩種以上流行性乙型腦炎病毒蛋白的轉(zhuǎn)錄子序列選自(1)膜蛋白M和NSl蛋白；(2)賂2八、賂28、賂3、賂4六和賂48蛋白；或(3)膜蛋白M、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A和NS4B蛋白。本發(fā)明的還一方面涉及本發(fā)明所述的誘導(dǎo)RNA干擾的分子或者重組載體在制備用于抑制流行性乙型腦炎病毒基因表達(dá)的組合物中的用途。本發(fā)明的還一方面涉及本發(fā)明所述的誘導(dǎo)RNA干擾的分子或者重組載體在制備用于治療和/或預(yù)防流行性乙型腦炎的藥物中的用途。本發(fā)明的還一方面涉及本發(fā)明所述的誘導(dǎo)RNA干擾的分子在制備用于抑制流行性乙型腦炎病毒的SiRNA中的用途。本發(fā)明的還一方面涉及抑制流行性乙型腦炎病毒的SiRNA所針對(duì)的靶序列，所述靶序列用cDNA表示為以下序列中的至少一種(1) SEQ ID NO :1 SEQ ID NO 9 以及 SEQ ID NO 33 SEQ IDNO 50 所示任一序列；(2)與 SEQ ID NO :1 SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :33 SEQ IDNO 50 中任一序列的同一性至少為70 %的序列；優(yōu)選至少80 %，更優(yōu)選至少84 %，更優(yōu)選至少89 %，更優(yōu)選至少 94%。本發(fā)明的還一方面涉及SiRNA分子，其含有與本發(fā)明所述的靶序列對(duì)應(yīng)或互補(bǔ)的 RNA序列。所述對(duì)應(yīng)是指將用cDNA表示的靶序列中的T替換為U ；所述互補(bǔ)是指按照本領(lǐng)域公知的A-U、G-C、C-G、T-A原則與靶序列進(jìn)行互補(bǔ)，得到RNA序列。在本發(fā)明中，誘導(dǎo)RNA干擾的分子在細(xì)胞或機(jī)體內(nèi)被轉(zhuǎn)換為實(shí)施抑制基因表達(dá)的效應(yīng)siRNA分子。siRNA分子包括正義鏈和反義鏈，適用于本發(fā)明的siRNA分子可以通過(guò)本領(lǐng)域常用的方法制備。可以在體外制備siRNA，然后將其直接導(dǎo)入細(xì)胞中(例如通過(guò)轉(zhuǎn)染)。更具體地，例如可以通過(guò)化學(xué)合成、體外轉(zhuǎn)錄或由siRNA表達(dá)質(zhì)?；虿《据d體在細(xì)胞中表達(dá)，來(lái)制備本發(fā)明的的siRNA分子。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，將SEQ ID NO 11 SEQ ID NO 28所示序列分別連接入 siRNA表達(dá)載體中，將載體導(dǎo)入細(xì)胞以表達(dá)siRNA分子，干擾乙腦病毒基因的表達(dá)。本發(fā)明的實(shí)施方案中，將siRNA表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞后，siRNA以類似于內(nèi)源性 miRNA的方式來(lái)表達(dá)，即RNA的源轉(zhuǎn)錄本在RNA聚合酶II的作用下轉(zhuǎn)錄后，在細(xì)胞核內(nèi)被 Drosha切割成60_70nt的前體后被Exportin-5轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)中，在細(xì)胞質(zhì)中，siRNA前體被Dicer切割成成熟的siRNA分子，成熟的siRNA分子行使切割靶標(biāo)mRNA的作用。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，根據(jù)抑制效果，挑選出抑制效果最好的、針對(duì)一種靶序列的siRNA分子，例如NS1-447，采用多拷貝，例如3個(gè)、6個(gè)、9個(gè)拷貝進(jìn)行串聯(lián)，以進(jìn)一步增強(qiáng)抑制效果。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，將針對(duì)不同基因的、部分或全部靶序列的siRNA分子進(jìn)行串聯(lián)，例如本發(fā)明中的siRNAX4，siRNAX5或siRNAX9，并在細(xì)胞中表達(dá)，實(shí)驗(yàn)證明，其具有更好的抑制基因表達(dá)的效果?？梢圆捎脤⒁陨蟽煞N方法聯(lián)合應(yīng)用的方式，針對(duì)多個(gè)基因、同時(shí)采用多拷貝，以增強(qiáng)抑制效果。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”是指將核酸與另外的核酸序列置于在功能上具有關(guān)系的狀態(tài)。這可以是相互連接的基因和控制序列以這樣的方式連接，使得當(dāng)適當(dāng)?shù)姆肿颖唤Y(jié)合到控制序列時(shí)，該基因的表達(dá)變得可行。例如，如果啟動(dòng)子控制編碼序列的轉(zhuǎn)錄， 那么該啟動(dòng)子將可操作性地與該序列結(jié)合。通常，術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”是指被連接的DNA 序列是相鄰的，并且在分泌性前導(dǎo)序列的情況中，是相鄰的且在閱讀框內(nèi)。所述序列的連接是通過(guò)在適當(dāng)?shù)南拗泼肝稽c(diǎn)上進(jìn)行連接來(lái)實(shí)施的。如果所述位點(diǎn)不存在，可以使用根據(jù)常規(guī)方法合成的寡聚核苷酸銜接子或接頭。
在本發(fā)明中，小干擾RNA (siRNA)指包括約10_60個(gè)核苷酸(或核苷酸類似物)，能夠指引或介導(dǎo)RNA干擾的RNA (或RNA類似物)。siRNA包括雙鏈siRNA和單鏈siRNA，在本發(fā)明中一般是指雙鏈siRNA，包括正義鏈和反義鏈。在本發(fā)明中，靶序列除包括SEQ ID NO :1 SEQ ID NO :9所示序列以外，還包括與此序列不同的其它乙腦病毒株的全基因組序列中與SEQ IDNO :1 SEQ ID NO 9所示序列相對(duì)應(yīng)的序列。在本發(fā)明中，所述同一性是指在比較的兩條序列的對(duì)應(yīng)窗口中相同核苷酸所占的比例，所述窗口的大小是指15個(gè)以上核苷酸組成的窗口，優(yōu)選至少17，更優(yōu)選至少約18或 19至21-23或24- 個(gè)核苷酸的窗口，所述同一性至少70%，是指在對(duì)應(yīng)窗口中至少70% 的核苷酸相同，優(yōu)選至少80 %，更優(yōu)選至少84%，更優(yōu)選至少89 %，更優(yōu)選至少94 %，例如 95%，96%，97%，98%，99%或100%。其中不同的核苷酸優(yōu)選位于序列的5'和/或3' 端，例如位于距5'和/或3'端1-4個(gè)核苷酸序列內(nèi)。在本發(fā)明中，所述抑制流行性乙型腦炎病毒基因表達(dá)，是指蛋白，DNAJP /或RNA 水平可觀察到的降低或消失，例如減少至少約50 %，60 %，70 %，80 %，90 %，95 %，99 %或更多的表達(dá)。抑制的結(jié)果可通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞或機(jī)體的表型或生化技術(shù)而證實(shí)，所述生化技術(shù)例如為Northern雜交，基因芯片，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)，Western Blot，熒光激活細(xì)胞分選(FACS)或放射免疫試驗(yàn)(RIA)等。發(fā)明的有益效果在本發(fā)明中，應(yīng)用RNAi技術(shù)，通過(guò)針對(duì)乙腦病毒基因組保守區(qū)的siRNA進(jìn)行乙腦病毒的抑制研究，為抑制各種不同基因型乙腦病毒復(fù)制引起的感染提供了新的途徑，也為乙腦的預(yù)防與治療提供了新的思路。有效的siRNA靶位點(diǎn)不僅可以作為新的化學(xué)藥物靶位點(diǎn)，而且siRNA可以直接作為強(qiáng)有效的藥物用于乙腦的預(yù)防與治療，特異性強(qiáng)，不易引起副反應(yīng)，給藥方便、快捷。多條siRNAs的聯(lián)合用藥不僅進(jìn)一步增加了其廣譜的抗乙腦病毒的效果，而且對(duì)于預(yù)防病毒的逃逸突變提供了保證。本發(fā)明目前研制和開(kāi)發(fā)治療乙腦的siRNA 藥物不但具有實(shí)際可操作性而且擁有良好的應(yīng)用前景。


圖 IsiRNAs 表達(dá)載體 pcDNA 6. 2-Gff/EmGFP-miR 示意2螢火蟲(chóng)熒光素酶siRNAs報(bào)告質(zhì)粒載體示意3siRNAs表達(dá)載體對(duì)靶序列表達(dá)的抑制效果圖，其中NC對(duì)照為轉(zhuǎn)染無(wú)關(guān)siRNA 及熒光素酶表達(dá)載體的細(xì)胞，mock為轉(zhuǎn)染熒光素酶表達(dá)載體未轉(zhuǎn)染siRNAs表達(dá)載體的細(xì)胞，其它為轉(zhuǎn)染能表達(dá)針對(duì)PrM，NSl, NS2A, NS2B, NS3, NS4A和NS4B基因不同靶位點(diǎn)特異 siRNA及熒光素酶表達(dá)載體的細(xì)胞?？v坐標(biāo)表示以轉(zhuǎn)錄活性內(nèi)對(duì)照的海腎熒光素酶為標(biāo)準(zhǔn)化的螢火蟲(chóng)熒光素酶活性。圖4siRNAs表達(dá)框架的串聯(lián)示意5流式細(xì)胞儀檢測(cè)siRNA轉(zhuǎn)染陽(yáng)性的細(xì)胞百分比，其中左圖為未轉(zhuǎn)染siRNA的細(xì)胞，右圖為轉(zhuǎn)染了 siRNA表達(dá)載體NS1-447的細(xì)胞。圖6瞬時(shí)轉(zhuǎn)染特異siRNAs表達(dá)載體對(duì)乙腦病毒SA14_14_2株基因組RNA抑制情況。其中NC為轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA表達(dá)載體，Mock為未轉(zhuǎn)染siRNAs的對(duì)照。圖中的每一
8個(gè)數(shù)據(jù)表示三個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。圖7siRNA表達(dá)載體對(duì)病毒囊膜蛋白E蛋白表達(dá)的抑制情況圖。其中，泳道1_13 依次表示 BHK-21 細(xì)胞在轉(zhuǎn)染 PrM-54，NS1-447，NS1-630，NS1-1207，NS2A-461，NS2B-123， NS3-1112，NS4A-289，NS4B-115，siRNAs X 4，siRNAs X 5，siRNAs X 9 和 NC 對(duì)照后感染乙腦病毒SA 14-14-2囊膜蛋白E蛋白的表達(dá)情況；泳道14表示未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的BHK-21細(xì)胞中囊膜蛋白E蛋白的表達(dá)情況；泳道15為未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒未感染乙腦病毒的BHK-21細(xì)胞對(duì)照。Actin 作為內(nèi)對(duì)照。圖 8 感染后 24 小時(shí)穩(wěn)定表達(dá) NS1-447、(NS1-447) X6、siRNAsX9 禾Π NC 的 ΒΗΚ-21 細(xì)胞對(duì)乙腦病毒SA14-14-2株基因組RNA的抑制情況比較。其中，Mock為普通ΒΗΚ-21感染病毒的對(duì)照。圖中的每一個(gè)數(shù)據(jù)表示三個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。圖9穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系對(duì)病毒囊膜蛋白E蛋白的抑制情況。其中，泳道1-4分別依次代表穩(wěn)定表達(dá)siRNAsX9、(NS1-447) X6、NS1_447和NC對(duì)照的細(xì)胞系對(duì)病毒囊膜蛋白E 蛋白的抑制情況，泳道5為普通BHK-21感染病毒的對(duì)照，泳道6為普通BHK-21細(xì)胞未感染病毒的對(duì)照。Actin為內(nèi)對(duì)照。圖 10 感染后 48 小時(shí)穩(wěn)定表達(dá)NS1-447、(NS1-447) X6、siRNAsX9 和 NC 的 BHK-21 細(xì)胞對(duì)乙腦病毒SA14-14-2株擴(kuò)增滴度的抑制情況比較。Mock為普通BHK-21感染病毒的對(duì)照。圖中的每一個(gè)數(shù)據(jù)表示三個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。圖 11 感染后 96 小時(shí)穩(wěn)定表達(dá)NS1-447、(NS1-447) X6、siRNAsX9 和 NC 的 BHK-21 細(xì)胞的存活情況對(duì)比。Mock為普通BHK-21感染病毒的對(duì)照。Cell control為未感染病毒的BHK-21細(xì)胞。圖中的每一個(gè)數(shù)據(jù)表示三個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。圖12穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系對(duì)病毒SA14、SH53以及SHlOl囊膜蛋白E蛋白的抑制情況。 圖中，泳道1-3分別依次代表穩(wěn)定表達(dá)siRNAsX9、(NS1-447) X6和NC對(duì)照的細(xì)胞系對(duì)病毒囊膜蛋白E蛋白的抑制情況，泳道4為普通BHK-21感染病毒的對(duì)照，泳道5為普通BHK-21 細(xì)胞未感染病毒的對(duì)照。Actin為內(nèi)對(duì)照。圖13感染后48小時(shí)穩(wěn)定表達(dá)siRNAsX9、(NS1-447) X6禾Π NC的ΒΗΚ-21細(xì)胞對(duì)乙腦病毒SA14、SH53以及SHlOl滴度的抑制情況。Mock為普通ΒΗΚ-21感染病毒的對(duì)照。 圖中的每一個(gè)數(shù)據(jù)表示三個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。圖14穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系在SA14、SH53或者SHlOl病毒感染96小時(shí)候存活率檢測(cè)。 感染后96小時(shí)穩(wěn)定表達(dá)siRNAsX9、(NS1-447) X6和NC的BHK-21細(xì)胞的存活情況對(duì)比。 Mock為普通BHK-21感染病毒的對(duì)照。Cell control為未感染病毒的BHK-21細(xì)胞。圖中的每一個(gè)數(shù)據(jù)表示三個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。
具體實(shí)施例方式下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實(shí)施例IsiRNA靶位點(diǎn)的選擇分析GenBank中收錄的所有乙腦病毒的全基因組序列共計(jì)64條，其中包括34條中國(guó)分離株。使用SeqMan軟件做同源性比對(duì)，選取在80%以上全球分離株、95%以上中國(guó)分離株中保守的序列作為靶序列設(shè)計(jì)siRNAs。靶序列設(shè)計(jì)使用INVITR0GEN根據(jù)其siRNAs 表達(dá)載體提供的相應(yīng)在線設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)(http://rnaidesiRner. invitroRen. com/rnai express/ set Option, do ？ designQption = mirna&pid = 509133211138749536)。設(shè)計(jì)完成后使用 BLAST (www, ncbi. nlnuiiik^i)，將潛在的靶序列與人類基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，排除那些和其他編碼序列或EST同源的序列。同時(shí)設(shè)計(jì)一組陰性對(duì)照siRNAs (negative control,NC)。表1為針對(duì)乙腦病毒ft"M，NSl, NS2A, NS2B, NS3, NS4A和NS4B基因編碼區(qū)的siRNAs的靴序列。表1針對(duì)乙腦病毒基因編碼區(qū)的siRNAs的靶序列
權(quán)利要求
1.誘導(dǎo)RNA干擾的分子，其包括正義鏈和反義鏈，其特征在于所述正義鏈或反義鏈選自以下(1)-(5)的序列(1)SEQID NO :1 SEQ ID NO 9 以及 SEQ ID NO 33 SEQ IDNO 50 所示任一序列；(2)與SEQ ID NO :1 SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :33 SEQ IDNO 50 中任一序列的同一性至少為70%的序列；(3)經(jīng)過(guò)改造的選自⑴或(2)中的序列，其是在所述序列的5’方向和3’方向、5’方向或3’方向上添加有至多60個(gè)核苷酸的序列；(4)將選自(1)-(3)的序列按照5’-3’方向可操作地串聯(lián)得到的序列，其中可操作地串聯(lián)的序列為1種，其拷貝數(shù)為2個(gè)或者2個(gè)以上；和(5)將選自(1)-(3)的序列按照5’-3’方向可操作地串聯(lián)得到的序列，其中可操作地串聯(lián)的序列為2種以上，每1種的拷貝數(shù)至少為1。
2.權(quán)利要求1的誘導(dǎo)RNA干擾的分子，其中(2)的同一性優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少 84 %，更優(yōu)選至少89 %，更優(yōu)選至少94 %。
3.權(quán)利要求1的誘導(dǎo)RNA干擾的分子，其中( 中添加的核苷酸個(gè)數(shù)為至多50個(gè)，優(yōu)選至多40個(gè)，更優(yōu)選至多30個(gè)，更優(yōu)選至多20個(gè)，最優(yōu)選至多10個(gè)。
4.權(quán)利要求1的誘導(dǎo)RNA干擾的分子，其中(4)所述的序列為將3個(gè)、6個(gè)或9個(gè)拷貝的SEQ ID NO 2,SEQ ID NO 34或SEQ ID NO :43的序列可操作地串聯(lián)得到的序列，例如為 SEQ ID N0:51 SEQ ID NO :53所示序列；其中(5)所述的序列為將SEQ ID N0:1 4、 SEQ ID NO 5 9、SEQ ID NO :1 9、SEQ ID NO 33 36、SEQ ID NO 37 41、SEQ ID NO 33 41、SEQ ID NO :42 45、SEQ ID NO :46 50 或 SEQ ID NO 42 50 的序列可操作地串聯(lián)得到的序列，例如為SEQ ID N0:54 SEQ ID N0:56所示序列。
5.重組載體，其可操作地連接有權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的誘導(dǎo)RNA干擾的分子。
6 組合物，其含有權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的誘導(dǎo)RNA干擾的分子或者權(quán)利要求5的重組載體，以及藥學(xué)上可接受的載體。
7.獲得抑制流行性乙型腦炎病毒的誘導(dǎo)RNA干擾的分子的方法，其包括(1)根據(jù)流行性乙型腦炎病毒的全基因組序列，選取在基因1型、2型、3型和4型分離株中的保守序列，作為潛在的靶序列；(2)將(1)中的潛在的靶序列與人類基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，排除和人類基因組中其它編碼序列或表達(dá)序列標(biāo)簽同源的序列，將剩余的序列作為靶序列；和(3)根據(jù)步驟(2)獲得的靶序列合成誘導(dǎo)RNA干擾的分子。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述的保守序列是指在基因1型、2型、3型和4型分離株的全基因組序列中80%以上保守的序列，并且在基因1型和3型分離株的全基因組序列中 90%以上保守的序列，優(yōu)選為在基因1型和3型中95%以上保守的序列。
9.權(quán)利要求7的方法，其中，步驟C3)中所述的靶序列選自兩種或兩種以上流行性乙型腦炎病毒蛋白的轉(zhuǎn)錄子序列。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述兩種或兩種以上流行性乙型腦炎病毒蛋白的轉(zhuǎn)錄子序列選自(1)膜蛋白M和NSl蛋白；(2)NS2A、NS2B、NS3、NS4A禾口 NS4B 蛋白；或(3)膜蛋白 M、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A 和 NS4B 蛋白。
11.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的誘導(dǎo)RNA干擾的分子或者權(quán)利要求5的重組載體在制備用于抑制流行性乙型腦炎病毒基因表達(dá)的組合物中的用途。
12.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的誘導(dǎo)RNA干擾的分子或者權(quán)利要求5的重組載體在制備用于治療和/或預(yù)防流行性乙型腦炎的藥物中的用途。
13.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的誘導(dǎo)RNA干擾的分子在制備用于抑制流行性乙型腦炎病毒的siRNA中的用途。
14.抑制流行性乙型腦炎病毒的siRNA所針對(duì)的靶序列，所述靶序列用cDNA表示為以下序列中的至少一種(1)SEQID NO :1 SEQ ID NO 9 以及 SEQ ID NO 33 SEQ IDNO 50 所示任一序列；(2)與SEQ ID NO :1 SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :33 SEQ IDNO 50 中任一序列的同一性至少為70%的序列；優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少84%，更優(yōu)選至少89%，更優(yōu)選至少 94%。
15.siRNA分子，其含有與權(quán)利要求14所述的靶序列對(duì)應(yīng)或互補(bǔ)的RNA序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于抑制流行性乙型腦炎病毒的siRNA，及其設(shè)計(jì)方法和用途。具體地，本發(fā)明根據(jù)流行性乙型腦炎病毒的全基因組序列，選取在基因1型、2型、3型和4型分離株中的保守序列作為靶序列。根據(jù)靶序列設(shè)計(jì)的siRNA分子在導(dǎo)入細(xì)胞后，能夠有效抑制乙腦病毒基因的表達(dá)；當(dāng)不同的siRNA分子串聯(lián)后導(dǎo)入細(xì)胞，能獲得更好的抑制效果。本發(fā)明還涉及所述的siRNA分子用于抑制流行性乙型腦炎病毒基因表達(dá)的用途以及用于制備治療和/或預(yù)防流行性乙型腦炎的藥物的用途。本發(fā)明為抑制各種不同基因型乙腦病毒引起的感染提供了新的途徑。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102154290SQ20111000510
公開(kāi)日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2011年1月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月12日
發(fā)明者吳志強(qiáng), 金奇 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所