專利名稱：補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)β-聚蘋果酸的工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的技術(shù)方案屬于發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種采用補(bǔ)料工藝提高一株出芽短梗霉(A.pullulims ipe-1)發(fā)酵生產(chǎn)β-聚蘋果酸的方法。
背景技術(shù)：
聚蘋果酸是一種特殊的脂肪族聚酯，以蘋果酸為唯一單體、相互通過酯鍵聯(lián)接而成。與許多其它天然多聚合物不同，聚蘋果酸分子中有許多自由羧基和非對稱碳原子，這些自由羧基賦予了它許多特別的性質(zhì)，它除了具有良好的水溶性、可生物降解性、生物相容性和生物可吸收性之外，還具有兩個顯著的優(yōu)點(diǎn)(1)易代謝性。由于L-蘋果酸是生物體內(nèi)克雷伯氏三羧酸循環(huán)的中間體，β-聚蘋果酸容易在生物體內(nèi)通過正常的三羧酸循環(huán)代謝途徑除去；(2)易修飾性。聚蘋果酸具有懸掛羧基，容易與其它官能團(tuán)反應(yīng)而制得聚蘋果酸衍生物，或引入功能基團(tuán)或小分子藥物，從而制得許多具有特殊功能的產(chǎn)物。因此，聚蘋果酸及其衍生物可作為手術(shù)縫合線、組織工程支架材料、藥物載體或原生藥物、藥物控制釋放體系、食品包裝材料、化妝品等，在生物醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域獲得重要的應(yīng)用。到目前為止，液態(tài)深層發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋果酸的專利較少，已知NakajimaToshiaki等在日本申請專利(專利名稱聚-L-蘋果酸的生產(chǎn)方法，申請?zhí)朖P7284395A)是用出芽短梗霉基因工程菌或其基因工程菌的固定化細(xì)胞，在特殊條件下用處于穩(wěn)態(tài)的細(xì)胞作為酶催化劑，利用糖原料和鐵離子溶液生產(chǎn)聚-L-蘋果 酸。宋存江等申請專利(專利名稱同時獲得副產(chǎn)物普魯蘭的聚蘋果酸的制備方法，申請?zhí)?00710058396)是采用乙醇分步沉淀普魯蘭、黑色素和β _聚蘋果酸，實現(xiàn) β-聚蘋果酸和副產(chǎn)物普魯蘭的分離。萬印華等申請專利(專利名稱β-聚蘋果酸及其鹽的制備方法，申請?zhí)?200910078227)是采用膜與發(fā)酵耦合工藝、離子交換提純出芽短梗霉發(fā)酵產(chǎn)生的β _聚蘋果酸。萬印華等申請專利(專利名稱β -聚蘋果酸發(fā)酵新工藝，申請?zhí)?00910236646) 是通過ΡΗ、溶解氧的發(fā)酵控制工藝提高β-聚蘋果酸發(fā)酵產(chǎn)率。在目前的聚蘋果酸發(fā)酵工藝中，關(guān)于補(bǔ)料發(fā)酵的工藝未有報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的是提供一種補(bǔ)料工藝生產(chǎn)β “聚蘋果酸的新方法，該方法通過流加碳源為葡萄糖、蔗糖、葡萄糖與果糖混合液或葡萄糖與蔗糖混合液，無機(jī)鹽包括氯化鈣、硫酸鋅和硝酸鈉的補(bǔ)料溶液得以實現(xiàn)，解決分批發(fā)酵中β “聚蘋果酸產(chǎn)率較低的問題， 顯著提高聚蘋果酸的產(chǎn)率，降低生產(chǎn)成本。本發(fā)明解決該技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是1.補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋果酸的工藝，其特征在于將出芽短梗霉ipe-Ι經(jīng)活化和種子培養(yǎng)后接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在控制pH6. 0及溶解氧濃度大于70 %條件下，在含碳源、氮源、無機(jī)鹽及微量元素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)出芽短梗霉ipe-1 ；初糖采用葡萄糖，發(fā)酵36-48h開始流加補(bǔ)料溶液，發(fā)酵60-120h。
說明(1)第1步所采用的活化培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基，121°C滅菌15min ；(2)第1步所采用的種子培養(yǎng)基(w/v) 葡萄糖，0.2%硝酸鈉，0.01%磷酸二氫鉀，0. 02%七水硫酸鎂，0. 05%氯化鉀，0. 蛋白胨，pH4. 0 4. 5，121°C滅菌15min。(3)第1步所采用的發(fā)酵培養(yǎng)基(w/v) :100_300g/L葡萄糖，6g/L硝酸鈉，0.5g/L 磷酸二氫鉀，0. 2g/L七水硫酸鎂，0. 5g/L氯化鉀，15g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，0. 005-1.0g/L 七水硫酸鋅，0. 04-1. Og/L 氯化鈣，ρΗ4· 0-7. 0，121°C滅菌 15min ；(4)第1步菌種活化方法將出芽短梗霉菌株(Aureobasidium pul lulans ipe1l)采用活化培養(yǎng)基在 20-28 °C進(jìn)行活化培養(yǎng)48-96小時；(5)第1步采用的種子培養(yǎng)方法將斜面上活化的種子培養(yǎng)物接種于種子培養(yǎng)基中，在20-28°C，200r/min條件下振蕩培養(yǎng)48-96h小時。2.根據(jù)步驟1所述的補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)β “聚蘋果酸的工藝，其特征在于初糖采用葡萄糖，補(bǔ)料溶液中碳源為葡萄糖、蔗糖、葡萄糖與果糖混合液或葡萄糖與蔗糖混合液。3.根據(jù)步驟1所述的補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋果酸的工藝，其特征在于補(bǔ)料溶液中無機(jī)鹽包含硫酸鋅、氯化鈣、硝酸鈉。4.根據(jù)步驟2所述的補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)β -聚蘋果酸的工藝，其特征在于初始葡萄糖濃度為100-300g/L，補(bǔ)料溶液中葡萄糖濃度為300-800g/L，通過流加碳源為葡萄糖的補(bǔ)料溶液可有效提高發(fā)酵周期內(nèi)β-聚蘋果酸的得率。5.根據(jù)步驟2所述的補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)β -聚蘋果酸的工藝，其特征在于初始葡萄糖濃度為100-300g/L，補(bǔ)料溶液中蔗糖濃度為300-600g/L，通過流加碳源為蔗糖的補(bǔ)料溶液可有效提高發(fā)酵周期內(nèi)β-聚蘋果酸的得率和產(chǎn)率。6.根據(jù)步驟2所述的補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)β -聚蘋果酸的工藝，其特征在于初始葡萄糖濃度為100-300g/L，葡萄糖與果糖混合液或葡萄糖與蔗糖混合液中果糖或蔗糖濃度為葡萄糖濃度的十分之一到二十分之一，葡萄糖濃度為300-800g/L，采用碳源混合液的有益效果是降低補(bǔ)料溶液的成本。7.根據(jù)步驟3所述的補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)β -聚蘋果酸的工藝，其特征在于補(bǔ)料溶液中硫酸鋅濃度為0. 005-0. lg/L、氯化鈣濃度為0. 04-1.0g/L、硝酸鈉濃度為2. 0-8.0g/L本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，有益效果是通過流加補(bǔ)料溶液提高了 β-聚蘋果酸的發(fā)酵產(chǎn)率，發(fā)酵周期內(nèi)產(chǎn)物得率，降低了成本。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，本發(fā)明所涉及的主要保護(hù)范圍并非僅限于這些實施例。實施例1按如下步驟發(fā)酵生產(chǎn)β -聚蘋果酸
第一步，培養(yǎng)基配制①活化培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基，121°C滅菌15min ；②種子培養(yǎng)基的配制(w/v) 葡萄糖，0.2%硝酸鈉，0.01%磷酸二氫鉀， 0. 02%七水硫酸鎂，0. 05%氯化鉀，0. 蛋白胨，pH 4. 0 4. 5，121°C滅菌15min。③發(fā)酵培養(yǎng)基的配制(w/v) :100-300g/L葡萄糖，6g/L硝酸鈉，0. 1-0. 6g/L磷酸二氫鉀，0. 2g/L七水硫酸鎂，0. 5g/L氯化鉀，15g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，0. 005-0. lg/L七水硫酸鋅，0. 04-1. Og/L 氯化鈣，pH4. 0-7. 0，121°C滅菌 15min。第二步，菌種活化將4°C保存的出芽短梗霉菌株(Aureobasidium pullulans ipe_l)，轉(zhuǎn)接于活化培養(yǎng)基斜面上，在25°C進(jìn)行活化培養(yǎng)72-96小時。第三步，種子培養(yǎng)將斜面上活化的種子培養(yǎng)物接種于裝IOOmL種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，在 250C，200r/min條件下振蕩培養(yǎng)48h。第四步，接種發(fā)酵將第三步制得的培養(yǎng)物以10%的接種量接種于裝4L發(fā)酵培養(yǎng)基的7L發(fā)酵罐中， pH 6. 0，溫度250C，初始轉(zhuǎn)速800r/min,通氣量0. 75vvm,罐壓在0. 01-0. IMpa,發(fā)酵前16h 控制溶解氧濃度大于70 %，之后控制溶解氧濃度在70 %，培養(yǎng)72h。初始葡萄糖濃度分別為 100g/L或300g/L，發(fā)酵周期分別為48h和72h，發(fā)酵液中β -聚蘋果酸含量分別為25. Og/L 和32. Og/L,菌體干重分別為55. 9g/L和60. 2g/L。實施例2 按如下步驟發(fā)酵生產(chǎn)β -聚蘋果酸第一步，培養(yǎng)基配制同實施例1第二步，菌種活化同實施例1第三步，種子培養(yǎng)同實施例1第四步，接種發(fā)酵將第三步制得的培養(yǎng)物以10%的接種量接種于裝4L發(fā)酵培養(yǎng)基的7L發(fā)酵罐中，pH 6. 0，溫度250C，初始轉(zhuǎn)速800r/min,通氣量0. 75vvm,罐壓在0. 01-0. IMpa,發(fā)酵前16h 控制溶解氧濃度大于70%，之后控制溶解氧濃度在70%，培養(yǎng)72h。初糖為190g/L葡萄糖或190g/L蔗糖，發(fā)酵周期分別為60h和72h，發(fā)酵液中β -聚蘋果酸含量分別為43. 8g/L和 42. 3g/L，菌體干重分別為68. 9g/L和70. 2g/L。實施例3 按如下步驟發(fā)酵生產(chǎn)β -聚蘋果酸第一步，培養(yǎng)基配制同實施例1第二步，菌種活化同實施例1
第三步，種子培養(yǎng)同實施例1第四步，接種發(fā)酵將第三步制得的培養(yǎng)物以10%的 接種量接種于裝4L發(fā)酵培養(yǎng)基的7L發(fā)酵罐中， pH 6. 0，溫度250C，初始轉(zhuǎn)速800r/min,通氣量0. 75vvm,罐壓在0. 01-0. IMpa,發(fā)酵前16h 控制溶解氧濃度大于70%，之后控制溶解氧濃度在70%。初糖為190g/L葡萄糖，發(fā)酵36h 開始流加的補(bǔ)料溶液中含300g/L或800g/L葡萄糖，發(fā)酵周期為72h，流加補(bǔ)料溶液1L，發(fā)酵結(jié)束發(fā)酵液中β _聚蘋果酸含量分別為38. 6g/L和45. 3g/L，菌體干重分別為59. 7g/L和 72. Og/L。實施例4 按如下步驟發(fā)酵生產(chǎn)β -聚蘋果酸第一步，培養(yǎng)基配制同實施例1第二步，菌種活化同實施例1第三步，種子培養(yǎng)同實施例1第四步，接種發(fā)酵將第三步制得的培養(yǎng)物以10%的接種量接種于裝4L發(fā)酵培養(yǎng)基的7L發(fā)酵罐中， pH 6. 0，溫度250C，初始轉(zhuǎn)速800r/min,通氣量0. 75vvm,罐壓在0. 01-0. IMpa,發(fā)酵前16h 控制溶解氧濃度大于70%，之后控制溶解氧濃度在70%。初糖為190g/L葡萄糖，發(fā)酵36h 開始流加的補(bǔ)料溶液中葡萄糖濃度為500g/L，硝酸鈉濃度分別為2g/L或8g/L，發(fā)酵周期為 72h,流加補(bǔ)料溶液1L，發(fā)酵結(jié)束發(fā)酵液中β -聚蘋果酸含量分別為45. 3g/L和46. Og/L,菌體干重分別為70. lg/L和71. 5g/L。實施例5 按如下步驟發(fā)酵生產(chǎn)β -聚蘋果酸第一步，培養(yǎng)基配制同實施例1第二步，菌種活化同實施例1第三步，種子培養(yǎng)同實施例1第四步，接種發(fā)酵將第三步制得的培養(yǎng)物以10%的接種量接種于裝4L發(fā)酵培養(yǎng)基的7L發(fā)酵罐中， pH 6. 0，溫度250C，初始轉(zhuǎn)速800r/min,通氣量0. 75vvm,罐壓在0. 01-0. IMpa,發(fā)酵前16h 控制溶解氧濃度大于70%，之后控制溶解氧濃度在70%。初糖為190g/L葡萄糖，發(fā)酵36h 開始流加500g/L葡萄糖，6. Og/L硝酸鈉，氯化鈣濃度分別為0. 04g/L或1. Og/L的補(bǔ)料溶液，發(fā)酵周期為72h，流加補(bǔ)料溶液1L，發(fā)酵結(jié)束發(fā)酵液中β-聚蘋果酸含量分別為52. Og/ L和53. 3g/L，菌體干重分別為73. lg/L和72. 5g/L。
實施例6 按如下步驟發(fā)酵生產(chǎn)β -聚蘋果酸第一步，培養(yǎng)基配制同實施例1
第二步，菌種活化同實施例1第三步，種子培養(yǎng)同實施例1第四步，接種發(fā)酵將第三步制得的培養(yǎng)物以10%的接種量接種于裝4L發(fā)酵培養(yǎng)基的7L發(fā)酵罐中， ρΗ 6. 0，溫度250C，初始轉(zhuǎn)速800r/min,通氣量0. 75vvm,罐壓在0. 01-0. IMpa,發(fā)酵前16h 控制溶解氧濃度大于70%，之后控制溶解氧濃度在70%。初糖為190g/L葡萄糖，發(fā)酵36h 開始流加含500g/L葡萄糖，0. lg/L氯化鈣，6g/L硝酸鈉，硫酸鋅濃度分別為0. 005g/L和 0. lg/L的補(bǔ)料溶液，發(fā)酵周期縮短為60h，流加補(bǔ)料溶液1L，發(fā)酵結(jié)束發(fā)酵液中β -聚蘋果酸含量分別為52. 5g/L和51. 8g/L，菌體干重分別為74. Og/L和72. 5g/L。實施例7 按如下步驟發(fā)酵生產(chǎn)β -聚蘋果酸第一步，培養(yǎng)基配制同實施例1第二步，菌種活化同實施例1第三步，種子培養(yǎng)同實施例1第四步，接種發(fā)酵將第三步制得的培養(yǎng)物以10%的接種量接種于裝4L發(fā)酵培養(yǎng)基的7L發(fā)酵罐中， ρΗ 6. 0，溫度250C，初始轉(zhuǎn)速800r/min,通氣量0. 75vvm,罐壓在0. 01-0. IMpa,發(fā)酵前16h 控制溶解氧濃度大于70%，之后控制溶解氧濃度在70%，培養(yǎng)72h。初糖為190g/L葡萄糖， 發(fā)酵36h開始流加含300g/L或600g/L蔗糖，0. lg/L氯化鈣，6g/L硝酸鈉，0. 005g/L硫酸鋅的補(bǔ)料溶液，發(fā)酵周期為72h，流加補(bǔ)料溶液1L，發(fā)酵結(jié)束發(fā)酵液中β -聚蘋果酸含量分別為42. 6g/L和62. 3g/L，菌體干重分別為71. lg/L和73. 5g/L。實施例8 按如下步驟發(fā)酵生產(chǎn)β -聚蘋果酸第一步，培養(yǎng)基配制同實施例1第二步，菌種活化同實施例1第三步，種子培養(yǎng)同實施例1第四步，接種發(fā)酵
將第三步制得的培養(yǎng)物以10%的接種量接種于裝4L發(fā)酵培養(yǎng)基的7L發(fā)酵罐中， pH 6. 0，溫度250C，初始轉(zhuǎn)速800r/min,通氣量0. 75vvm,罐壓在0. 01-0. IMpa,發(fā)酵前16h 控制溶解氧濃度大于70%，之后控制溶解氧濃度在70%，培養(yǎng)72h，初糖為190g/L葡萄糖， 發(fā)酵36h開始流加含500g/L葡萄糖，0. lg/L氯化鈣，6g/L硝酸鈉，0. 005g/L硫酸鋅的補(bǔ)料溶液，果糖濃度分別為50g/L和25g/L，發(fā)酵72h，流加補(bǔ)料溶液1L，發(fā)酵結(jié)束時發(fā)酵液中 β -聚蘋果酸含量分別為63. 4g/L和62. 8g/L，菌體干重為73. 5g/L和72. 5g/L。實施例9按如下步驟發(fā)酵生產(chǎn)β -聚蘋果酸第一步，培養(yǎng)基配制同實施例1第二步，菌種活化同實施例1第三步，種子培養(yǎng)同實施例1第四步，接種發(fā)酵將第三步制得的培養(yǎng)物以10%的接種量接種于裝4L發(fā)酵培養(yǎng)基的7L發(fā)酵罐中， pH 6. 0，溫度250C，初始轉(zhuǎn)速800r/min,通氣量0. 75vvm,罐壓在0. 01-0. IMpa,發(fā)酵前16h 控制溶解氧濃度大于70%，之后控制溶解氧濃度在70%，初糖為190g/L葡萄糖，發(fā)酵36h 開始開始流加的補(bǔ)料溶液中含硝酸鈉6g/L，氯化鈣0. lg/L，硫酸鋅0. 005g/L，葡萄糖500g/ L,蔗糖濃度分別為50g/L和25g/L，發(fā)酵72h，流加補(bǔ)料溶液1L，發(fā)酵結(jié)束時發(fā)酵液中β-聚蘋果酸含量分別為64. lg/L和62. Og/L,菌體干重為74. 6g/L和73. 5g/L。
權(quán)利要求
1.補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)β-聚蘋果酸的工藝其特征在于將出芽短梗霉ipe-Ι經(jīng)活化和種子培養(yǎng)后接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在控制PH及溶解氧條件下，在含碳源、氮源、無機(jī)鹽及微量元素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)出芽短梗霉ipe-Ι ；初糖發(fā)酵 36-48h開始流加由碳源和無機(jī)鹽組成的補(bǔ)料溶液，發(fā)酵60-120h。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋果酸的工藝，其特征在于初糖采用葡萄糖，補(bǔ)料溶液中碳源為葡萄糖、蔗糖、葡萄糖與果糖混合液或葡萄糖與蔗糖混合液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋果酸的工藝，其特征在于補(bǔ)料溶液中無機(jī)鹽包含硫酸鋅、氯化鈣、硝酸鈉。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋果酸的工藝，其特征在于初始葡萄糖濃度為100-300g/L，補(bǔ)料溶液中葡萄糖濃度為300-800g/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋果酸的工藝，其特征在于初始葡萄糖濃度為100-300g/L，補(bǔ)料溶液中蔗糖濃度為300-600g/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋果酸的工藝，其特征在于初始葡萄糖濃度為100-300g/L，葡萄糖與果糖混合液或葡萄糖與蔗糖混合液中果糖或蔗糖濃度為葡萄糖濃度的十分之一到二十分之一，葡萄糖濃度為300-800g/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋果酸的工藝，其特征在于補(bǔ)料溶液中硫酸鋅濃度為0. 005-0. lg/L、氯化鈣濃度為0. 04-1. Og/L、硝酸鈉濃度為2. 0-8. Og/L。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種提高β-聚蘋果酸產(chǎn)量的補(bǔ)料發(fā)酵工藝，通過下述方案予以實現(xiàn)在控制pH及溶解氧條件下，在含碳源、氮源、無機(jī)鹽及微量元素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌株出芽短梗霉ipe-1；在分批發(fā)酵生產(chǎn)工藝基礎(chǔ)上，初糖采用葡萄糖，36-48h開始流加碳源為葡萄糖、蔗糖、葡萄糖與果糖混合液、或葡萄糖與蔗糖混合液，無機(jī)鹽含硝酸鈉、氯化鈣和硫酸鋅的補(bǔ)料溶液，β-聚蘋果酸產(chǎn)量較分批發(fā)酵過程提高20-50％。本發(fā)明改變了原有生產(chǎn)工藝方法，顯著提高了β-聚蘋果酸的產(chǎn)率，降低了成本，可用于工業(yè)規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)β-聚蘋果酸。
文檔編號C12P7/62GK102154389SQ20111000542
公開日2011年8月17日 申請日期2011年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月6日
發(fā)明者萬印華, 曹偉鋒, 沈飛, 蘇儀, 陳向榮 申請人:中國科學(xué)院過程工程研究所