專利名稱：一種適于畢赤酵母表達(dá)的高比活植酸酶基因及其制備方法和表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及ー種適于畢赤酵母表達(dá)的高比活植酸酶基因及其制備方法和表達(dá)。
背景技術(shù)：
植酸磷(六磷酸肌醇)是禾谷類、豆科類及油料作物籽實(shí)中淋得主要儲(chǔ)存方式。但是因單胃動(dòng)物體內(nèi)缺乏能分解植酸(六磷酸肌醇)的酶，以植酸磷形式存在的磷很難被動(dòng)物吸收和利用從而造成了許多問題第一，植酸磷是ー種抗?fàn)I養(yǎng)因子，它在動(dòng)物胃腸道的消化過程中會(huì)與多種金屬離子以及蛋白質(zhì)螯合成相應(yīng)的不溶性復(fù)合物，使ー些消化酶的作用受到抑制，使多種微量元素和氨基酸的利用率下降，降低了動(dòng)物對(duì)以上營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的生物利用率；第二，為滿足動(dòng)物對(duì)磷的需求，飼料中添加的磷酸氫鈣等無機(jī)磷(主要磷酸氫鈣)從動(dòng)物體內(nèi)排出，從而導(dǎo)致水體的富營(yíng)養(yǎng)化和土壤的嚴(yán)重污染。植酸酶廣泛存在于植物、動(dòng)物和微生物中，它能夠催化植酸及植酸鹽，水解成肌醇與磷酸。飼料中添加植酸酶有助于解除飼料中植酸鹽的抗?fàn)I養(yǎng)因子作用的，增加動(dòng)物對(duì)飼料中微量元素、蛋白質(zhì)、脂肪、淀粉、氨基酸及維生素等的吸收和利用，同時(shí)還能夠降低磷的排放對(duì)環(huán)境的危害。植酸酶作為ー種重要的新型飼用酶制劑，在飼料エ業(yè)中有廣泛的應(yīng)用前景，因此，通過基因改組技術(shù)獲得高比活的植酸酶基因，能夠有效地促進(jìn)植酸酶效能的充分發(fā)揮。目前植酸酶的生產(chǎn)主要依靠真菌、細(xì)菌等微生物的發(fā)酵。畢赤酵母(Pichia pastoris)系統(tǒng)是近年來發(fā)展很快的一個(gè)真核表達(dá)系統(tǒng)，許多有活性的蛋白質(zhì)已經(jīng)在畢赤酵母系統(tǒng)中大量表達(dá)。畢赤酵母在缺乏抑制性碳源如葡萄糖、甘油吋，能以甲醇為唯一碳源生長(zhǎng)。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是真核表達(dá)系統(tǒng)，可以對(duì)表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行加工折疊和修飾，還具有發(fā)酵方法成熟、發(fā)酵密度高、培養(yǎng)簡(jiǎn)單廉價(jià)、外源蛋白質(zhì)既可以胞內(nèi)積累又可分泌；表達(dá)產(chǎn)量高、背景蛋白質(zhì)少、易于表達(dá)產(chǎn)物純化等優(yōu)點(diǎn)，是生產(chǎn)植酸酶的較為理想的表達(dá)系統(tǒng)。 而且，偏愛密碼子的使用能夠較大幅度提高基因的表達(dá)水平。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供ー種適于畢赤酵母表達(dá)的高比活植酸酶基因及其制備方法和表達(dá)。本發(fā)明對(duì)來源于大腸桿菌的APP2植酸酶，按畢赤酵母偏愛密碼子優(yōu)化的原則，利用化學(xué)法合成，并通過DNA重組技術(shù)得到本發(fā)明的高比活植酸酶APPA2-1基因。將本發(fā)明制備的高比活植酸酶基因構(gòu)建到畢赤酵母表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化入畢赤酵母中高效表達(dá)，在飼料エ業(yè)中有廣泛的應(yīng)用潛力。所述適于畢赤酵母表達(dá)的高比活植酸酶APPA2-1基因的核苷酸序列SEQ ID NO 1， 其核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)序列如SEQ ID NO 2。本發(fā)明按照畢赤酵母偏愛密碼子(如精氨酸用AGA，賴氨酸采用AAA，半胱氨酸采用TGG，天冬氨酸采用AAC等等)，并且使用畢赤酵母信號(hào)肽序列(Lys Arg Glu AlaGlu Ala Gln Ser)替換原來的大腸桿菌(Escherichia coli)信號(hào)肽序列，對(duì)原始的來源于大腸桿菌的植酸酶APPA2基因進(jìn)行改造。采用連續(xù)延伸PCR方法合成改造后的基因?；蚝铣蓵r(shí)兩側(cè)弓I物分別加入》ioI和SacI酶切位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD 18-T載體相連(Takara)，4°C 連接過夜，高效轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)中，獲得陽性克隆。陽性克隆質(zhì)粒，經(jīng)BioI和SacI雙酶切后，通過T4DNA連接酶與畢赤酵母表達(dá)載體pYPX88 (invitrogen)連接，酶切鑒定和序列測(cè)定獲得了含有目的基因的重組質(zhì)粒PAPPA2。為了獲得更高比活的植酸酶基因，本發(fā)明以含有密碼子優(yōu)化的APPA2基因的重組質(zhì)粒pAPPA2為模板，PhyFl和PhyRl為引物，采用體外分子重組技術(shù)，隨機(jī)對(duì)APPA2不同位點(diǎn)進(jìn)行突變。經(jīng)》ιοΙ和Mel雙酶切后，與畢赤酵母表達(dá)載體PYPX88 (invitrogen)連接， 通過電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得APPA2的突變文庫。突變文庫經(jīng)BglII酶切，利用電擊法轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115菌中，篩選得到活性提高的菌株。通過基因測(cè)序得到高比活植酸酶基因 APPA2-1。通過測(cè)定，本發(fā)明所述畢赤酵母表達(dá)的高比活植酸酶APPA2-1基因在畢赤酵母中的表達(dá)量達(dá)到0. 105mg/ml以上，植酸酶活性達(dá)到232U/ml以上，活力為野生型対照的2. 2倍。通過DNAMAN軟件進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明合成的適于畢赤酵母表達(dá)的高比活植酸酶APPA2-1基因與原基因序列同源性為72. 58%以上。通過氨基酸序列比對(duì)，本發(fā)明的適于畢赤酵母表達(dá)的高比活植酸酶APPA2-1基因有6個(gè)位點(diǎn)突變，分別為 Thr52Arg, Serl52Glu, Glyl63Ser, Argl65Tyr, Asn210Cys, Tyr261Asp。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明按畢赤酵母偏愛密碼子合成的植酸酶基因可以在畢赤酵母中表達(dá)出高比活的植酸酶，表達(dá)量達(dá)到0. 105mg/ml以上，植酸酶活性達(dá)到232U/ml以上，活力為野生型對(duì)照的2. 2倍。本發(fā)明植酸酶產(chǎn)量和活力的提高，有助于進(jìn)一歩降低植酸酶在飼料添加劑中的應(yīng)用成本，在促進(jìn)單胃動(dòng)物對(duì)植酸中磷的吸收，解除飼料中植酸鹽的抗?fàn)I養(yǎng)因子作用，提高畜禽對(duì)蛋白質(zhì)、氨基酸、淀粉、脂類和礦物元素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用率，減少磷的排放上有很大的應(yīng)用潛力。


圖1為本發(fā)明用于畢赤酵母表達(dá)的pAPP2載體。圖2為本發(fā)明合成的植酸酶APPA2-1基因和野生型植酸酶APPA2基因的編碼氨基酸的序列比對(duì)，其中，上行為野生型植酸酶APPA2基因，下行為本發(fā)明合成的植酸酶 APPA2-1 基因，同源性=72. 58%。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)ー步詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案。本發(fā)明實(shí)施中未注明的實(shí)驗(yàn)方法，如連接、轉(zhuǎn)化、相關(guān)培養(yǎng)基的配制等參照分子克隆實(shí)驗(yàn)指南第三版(黃培堂等譯，中國(guó)，科學(xué)出版社，200 和畢赤酵母表達(dá)手冊(cè) (invitrogen)中方法進(jìn)行。相關(guān)的DNA回收試劑盒、載體、連接酶、核酸內(nèi)切酶均購(gòu)自
6Takara公司，DH5 α感受態(tài)由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所植物基因工程研究室保存。未注明的化學(xué)藥品為分析純級(jí)，購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)有限公司。實(shí)施例1密碼子優(yōu)化植酸酶基因的合成根據(jù)來源于大腸桿菌的ΑΡΡΑ2基因(GenBank Accession NO. AAN28334. 1)，采取連續(xù)延伸PCR方法合成密碼子優(yōu)化的植酸酶APPA2基因。由上海生物工程有限公司合成31 條引物，用于植酸酶APPA2基因的合成，兩側(cè)引物分別加入BamHI (CTCGAG)和McI (GAGCTC) 酶切位點(diǎn)。合成使用的iTaq DNA聚合酶為KOD FX taq酶(hyobo公司日本)，在50 μ L反應(yīng)體系中進(jìn)行。50 μ L 反應(yīng)體系為ddH20 11 μ L ；2XPCR^7tyf 25 μ L ；2mM dNTPslOy L ； KOD FX 1ロし；兩側(cè)引物各100叫，內(nèi)側(cè)引物各10叫，補(bǔ)足無菌水至5(^し擴(kuò)增條件為-MV 預(yù)熱 IOmin -MV, 30s, 54°C, 30s, 72°C, 40s, 30 個(gè)循環(huán)；最后 72°C 延伸 lOmin。第一歩，分別以P1、P12，P13、P24，P24.P30為兩側(cè)引物合成片段1、片段2、片段3 ；第二歩，各取1 μ L 片段1、片段2、片段3為模板，用引物Ρ1、Ρ30擴(kuò)增得到片段A ；第三歩，取1 μ L片段A為模板，用引物Ρ1、Ρ31擴(kuò)增得到目的基因。31條引物具體如下Pl :CTC, GAG，AAA, AGA, GAG，GCT，GAG，GCT，CAG，TCC, GAA, CCT，GAG，TTG，AAA, CTG， GAG，TCT，GTC，GTTP2 :TAG, CCT，TGG，TAG, GTG，CTC，TGA，CAC，CAT, GTC，TGG，AGA，CGA，TAA，CGA，CAG， ACT, CCA，GTT，TCAP3 :CAG, AGC, ACC, TAC, CAA, GGC, TAC, TCA, GCT，GAT，GCA, AGA, CGT，TAC, TCC, TGA, TGC，TTG，GCC，TACP4 :ACC, ACC, TCT，AGG, AGT，CAG, CCA, ACC, CAG, TTT，GAC, AGG, CCA, AGT，AGG, CCA, AGC，ATC，AGG，AGTP5 GGC，TGA，CTC，CTA，GAG，GTG，GTG，AGC，TGA，TTG，CTT，ACT，TGG，GTC，ACT，ACC， AAA, GAC，AGA，GACP6 TGA，GGA，CAA，CCC，TTC，TTA，GCC，AAC，AGA,CCG,TCA,GCA，ACC,AGT,CTC,TGT， CTT，TGG，TAG, TGAP7 GCT，AAG，AAG，GGT，TGT，CCT，CAG，TCT，GGT，CAG，GTC，GCT，ATC，ATC，GCT，GAT， GTT，GAC，GAG，AGAP8 :GAG,CCA，GAC，CAG，CAG，CGA，AGG，CTT，CAC，CAG，TCT，TTC，TGG，TTC，TCT，CGT， CAA，CAT, CAG，CGAP9 :CTT,CGC，TGC，TGG，TCT，GGC，TCC，TGA，CTG，TGC，TAT，CAC，TGT，CCA，TAC，TCA， GGC, TGA, CAC, CTCPlO :GAC, ACC, AGT，CTT，CAG，AGG，ATT，GAA，CAG，AGG，ATC，AGG，AGA，GGA，GGT， GTC，AGC，CTG，AGT，ATGPll :ATC, CTC, TGA, AGA, CTG, GTG, TCT, GTC, AAC, TGG, ACA, ACG, CTA, ACG, TCA, CTG，ACG，CTA，TCC，TGTP12 :CTG, TGA, CCA，GTG，AAG，TCA，GCA，ATG，GAA，CCA，CCA，GCT，CTG，GAC，AGG， ATA，GCG，TCA，GTG，ACGP13 :GCT, GAC, TTC, ACT, GGT, CAC, AGA, CAA, ACT, GCT, TTC, AGA, GAA, CTG, GAA, AGA，GTC，CTG，AAC，TTT
P14 CGT，CCT，GTT，TCT，CTC，TCT，TCA，AGC，ACA，AGT，TGG，ATT，GAG，GAA，AGT， TCA，GGA，CTC，TTT，CCAP15 :GAA, GAG, AGA，GAA，ACA，GGA，CGA，ATC，CTG，TTC，CTT，GAC，CCA，GGC，TCT， GCC，TTC，TGA，ACT, GAAP16 :GGA, GAC, AGC，ACC，AGT，CAA，GGA，GAC，ATT，GTC，AGC，AGA，GAC，CTT，CAG， TTC，AGA，AGG，CAG，AGCP17 :CCT, TGA, CTG, GTG, CTG, TCT, CCC, TGG, CTT, CCA, TGC, TGA, CTG, AAA, TCT, TCT, TGC, TGC, AAC, AAGP18 :TCG, GTG, ATT，CTA，CCC，CAA，CCA，GGT，TCA，GGC，ATA，CCT，TGA，GCT，TGT， TGC，AGC，AAG，AAG，ATTP19 :GGT, TGG, GGT，AGA，ATC，ACC，GAC，TCT，CAT, CAA，TGG，AAC，ACC，TTG，CTG， TCC, TTG, CAC, AAT, GCTP20 :ATC, TAG, CAA, CTT, CAG, GAG, TTC, TCT, GAA, GCA, AGT, CGA, ACT, GAG, CAT, TGT，GCA，AGG，ACA，GCAP21 :AAC, TCC, TGA, AGT, TGC, TAG, ATC, CAG, AGC, TAC, TCC, TCT, GTT, GTA, CCT, GAT, CAA, GAC, TGC, TCTP22 :AGT, GAC, ACC, ATA, GGC, TTG, CTT, CTG, AGG, AGG, ATG, AGG, AGT, CAG, AGC, AGT，CTT，GAT，CAG，GTAP23 :AGC, AAG, CCT, ATG, GTG, TCA, CTC, TTC, CTA, CCT, CTG, TTC, TGT, TCA, TTG, CTG，GTC，ACG，ACA，CCAP24 :GTC, CAG，TTG，AGT，TCC，AGA，GCA，CCA，CCC，AAG，TTG，GCA，AGA，TTG，GTG， TCG，TGA，CCA，GCA，ATGP25 :GCT, CTG, GAA, CTC, AAC, TGG, ACC, TTG, CCT, GGT, CAG, CCT, GAC, AAT, ACT, CCT，CCT，GGT，GGT，GAAP26 :GAG, AGT，TGT，CAG，ACA，GTC，TTC，TCC，ATC，TTT，CGA，AGA，CCA，GTT，CAC， CAC，CAG，GAG, GAG, TATP27 :AAG, ACT, GTC, TGA, CAA, CTC, TCA, GTG, GAT, TCA, GGT, CTC, CTT, GGT, CTT, CCA，GAC，CTT，GCA，GCAP28 :TGG, AGG，AGT，GTT，CAA，GGA，CAG，AGG，AGT，CTT，GTC，TCT，CAT, CTG，CTG， CAA，GGT，CTG，GAA，GACP29 :TGT, CCT，TGA，ACA，CTC，CTC，CAG，GTG，AAG，TTA，AGC，TGA，CTC，TGG，CTG， GAT，GTG，AAG，AGA，GAAP30 :ATC, TGA, GTG, AAA, CCA, GCC, AAG, GAG, CAC, ATA, CCT, TGA, GCG, TTT, CTC, TCT, TCA, CAT, CCA, GCCP31 :GAG, CTC，TTA，CAG，GGA，ACA，GGC，AGG，GAT，TCT，GGC，TTC，GTT，GAC，AAT， CTG，AGT，GA, AAC，CAG，CCA實(shí)施例2表達(dá)質(zhì)粒的重組構(gòu)建1. 5%瓊脂糖膠回收實(shí)例1中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，取10 μ L PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD18_T 載體相連(Takara)，4°C連接過夜，高效轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)中，獲得陽性克隆。陽性克隆質(zhì)粒，經(jīng)XhoI和SacI雙酶切后，通過T4DNA連接酶與畢赤酵母表達(dá)載體pYPX88(invitrogen) 連接，酶切鑒定和序列測(cè)定獲得了含有目的基因的重組質(zhì)粒PAPPA2 (參見圖1)。實(shí)施例3植酸酶基因APPA2突變文庫的構(gòu)建3. IPCR擴(kuò)增密碼子優(yōu)化的APPA2基因以含有密碼子優(yōu)化的APPA2基因的重組質(zhì)粒pAPPA2為模板，PhyFl GCTGAGGCTGTCATCGGTTACTC 和 PhyRl :GATCAGGAGCAAGCTCGTACGAG 為引物，擴(kuò)增使用 daq DNA聚合酶(Toyobo公司日本)，在50 μ L反應(yīng)體系中進(jìn)行，其中包括ddH20 37. 7 μ L ； 10XPCR^7tyf 5μ L ； 2. 5mM dNTPs 4μ L ；rTaq 0· 3 μ L ;PhyFl 禾ロ PhyR 各 1 μ L，模板 1 μ し 反應(yīng)條件為94預(yù)變性IOmin ；94°C變性30s，72 °C退火30s和延伸2min，共30個(gè)循環(huán)， 1.5%瓊脂糖膠回收1.7Kb的基因片段，回收產(chǎn)物用入IOOyL DNaseI緩沖液(50mmol/L Tris-Cl ρΗ7· 4+lmmol/L MgCl2)溶解。3. 2DNase I降解DNA及回收小片段取回收的基因片段，加入0. IU DNase I，30°C處理:3min。80°C處理IOmin失活 DNase I。12%丙烯酰胺凝膠電泳，透吸袋法回收50_100bp的小片段DNA，然后用ddH20溶
解沉淀。3. 3 無引物 PCR(Primerless PCR)無引物PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系25 μ L 小片段 DNA ；4 μ L 2. 5mmol/L dNTPs ；5 μ L IOXPCRBuffer ；0. 3μ L rTaq ；15. 7μ L ddH20 ；反應(yīng)程序94 預(yù)變性 2min ；94°C 變性 30s， 42°C退火30s ；延伸2min，共45個(gè)循環(huán)，Agrose電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果。3. 4 有引物 PCR (Primer PCR)有引物PCR反應(yīng)體系以IyL無引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，上文所述WiyFl和 PhyRl為引物，反應(yīng)程序同實(shí)施例3. 1，電泳檢測(cè)，回收1. 7kp基因片段。有引物PCR產(chǎn)物經(jīng)BioI和Mel雙酶切后，與畢赤酵母表達(dá)載體 pYPX88(invitrogen)連接，通過電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)，獲得植酸酶ΑΡΡΑ2的突變文庫。實(shí)施例4突變文庫的篩選4. 1畢赤酵母的轉(zhuǎn)化挑取劃線培養(yǎng)的GS115(mut+his invitrogen)單克隆接種到 IOmL YPD, 30 °C, 225rpm培養(yǎng)過夜，取ImL轉(zhuǎn)接到IOOmL新鮮YPD中繼續(xù)培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)3- 至OD6tltl = 0.5, 5000rpm離心收集菌體。用等體積重蒸水洗滌兩次后，加入ImL預(yù)冷的山梨醇懸浮菌體，即可作為畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞。APPA2的突變文庫經(jīng)BglII線性化后，用電擊法轉(zhuǎn)入畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞。用 Bio-RedGenePulser電擊儀電擊，參數(shù)2. 5kV，25 μ F。電擊結(jié)束后，立即加入1. OmL預(yù)冷的 1. Omol/L山梨醇，取200 μ L涂布于SD_his培養(yǎng)基平板，30°C培養(yǎng)3_4天至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。由于受體酵母為His缺陷型(His—)，在不加His的基本培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)，只有整合得到的重組酵母才能正常生長(zhǎng)。通過這ー標(biāo)記，篩選得到各質(zhì)粒大量的His+轉(zhuǎn)化子。4. 2畢赤酵母的誘導(dǎo)表達(dá)與篩選采用小規(guī)模發(fā)酵篩選活性高的轉(zhuǎn)化子，具體操作方法為接種單個(gè)轉(zhuǎn)化子到含有 50 μ L SD-P(lwt%甲醇)的40孔板中，28°C，225rpm振蕩培養(yǎng)8h，加入100 μ L反應(yīng)底物植酸鈉(sigma)，37°C反應(yīng)30min后，加入100 μ L顯色液，通過測(cè)定420nm光吸收值測(cè)定酶的活性，相關(guān)試劑的配制方法參見國(guó)標(biāo)GB/T 18634-2009。選取活性比對(duì)照高的轉(zhuǎn)化子，接種到50mL BMGY(10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨、13. 4g/L YNB,0. 4mg/L生物素、10g/L甘油)，培養(yǎng)至OD6tltl = 2_3吋，離心收集菌體，然后加入等體積BMMY誘導(dǎo)72h，其間每隔1 !補(bǔ)加甲醇至終濃度Iwt %。12000rpm，離心30min 收集上清。通過測(cè)定，在上清液中的表達(dá)量達(dá)到0. 105mg/ml，植酸酶活性達(dá)到232U/ml，活 カ為野生型対照的2. 2倍。通過基因測(cè)序獲得突變序列APPA2-1，即為本發(fā)明的適于畢赤酵母表達(dá)的高比活植酸酶APPA2-1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 1，其核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)序列如 SEQID NO 2。通過DNAMAN軟件進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明合成的適于畢赤酵母表達(dá)的高比活植酸酶APPA2-1基因與原基因序列同源性為72. 58%，具體參見圖2。通過氨基酸序列比對(duì)，本發(fā)明的適于畢赤酵母表達(dá)的高比活植酸酶APPA2-1基因有6個(gè)位點(diǎn)突變，分別為Thr52Arg，Serl52Glu, Glyl63Ser, Argl65Tyr, Asn210Cys, Tyr261Asp。最后應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍中。
權(quán)利要求
1.ー種適于畢赤酵母表達(dá)的高比活植酸酶基因，其特征在干，其核苷酸序列如SEQID NO 1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的適于畢赤酵母表達(dá)的高比活植酸酶基因，其特征在干，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的適于畢赤酵母表達(dá)的高比活植酸酶基因，其特征在干，所屬適于畢赤酵母表達(dá)的高比活植酸酶基因有6個(gè)突變位點(diǎn)，分別為Thr52Arg、Serl52Glu, Glyl63Ser、Argl65Tyr、Asn210Cys、Tyr261Asp。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的適于畢赤酵母表達(dá)的高比活植酸酶基因的制備方法，包括如下步驟1)采取連續(xù)延伸PCR方法合成密碼子優(yōu)化的植酸酶APPA2基因；2)上述合成的植酸酶APPA2基因與pMDIS-T載體相連，4°C連接過夜，高效轉(zhuǎn)化大腸桿菌中，獲得陽性克隆后，經(jīng)》ιοΙ和McI雙酶切，構(gòu)建到原核表達(dá)載體中獲得含有目的基因的重組質(zhì)粒；3)以上述含有目的基因的重組質(zhì)粒為模板，PhyFl和PhyRl為引物，采用體外分子重組技術(shù)，隨機(jī)對(duì)植酸酶APPA2基因不同位點(diǎn)進(jìn)行突變，將有引物PCR產(chǎn)物經(jīng)BioI和McI雙酶切后，與原核表達(dá)載體連接，通過電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得植酸酶APPA2突變文庫；4)上述突變文庫經(jīng)BglII酶切，利用電擊法轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115菌中，篩選得到活性提高的菌株，再通過基因測(cè)序得到適于畢赤酵母表達(dá)的高比活植酸酶基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在干，所述連續(xù)延伸PCR方法中用的引物具體如下Pl :CTC, GAG, AAA, AGA, GAG, GCT，GAG, GCT，CAG, TCC, GAA, CCT，GAG, TTG, AAA, CTG, GAG, TCT，GTC，GTTP2 :TAG, CCT，TGG，TAG, GTG，CTC，TGA，CAC，CAT, GTC，TGG，AGA，CGA，TAA，CGA，CAG，ACT, CCA，GTT，TCAP3 :CAG, AGC，ACC，TAC，CAA，GGC，TAC，TCA，GCT，GAT，GCA，AGA，CGT，TAC，TCC，TGA，TGC， TTG，GCC，TACP4 :ACC, ACC，TCT，AGG，AGT，CAG，CCA，ACC，CAG，TTT，GAC，AGG，CCA，AGT，AGG，CCA，AGC， ATC, AGG, AGTP5 :GGC, TGA，CTC，CTA，GAG, GTG，GTG，AGC，TGA，TTG，CTT，ACT, TGG，GTC，ACT, ACC，AAA, GAC，AGA，GACP6 :TGA, GGA，CAA，CCC，TTC，TTA，GCC，AAC，AGA，CCG，TCA，GCA，ACC，AGT，CTC，TGT，CTT， TGG，TAG, TGAP7 :GCT, AAG，AAG，GGT，TGT，CCT，CAG，TCT，GGT，CAG，GTC，GCT，ATC，ATC，GCT，GAT，GTT， GAC，GAG, AGAP8 :GAG, CCA, GAC, CAG, CAG, CGA, AGG, CTT，CAC, CAG, TCT，TTC, TGG, TTC, TCT，CGT，CAA, CAT, CAG，CGAP9 :CTT. CGC. TGC. TGG. TCT. GGC. TCC. TGA. CTG. TGC. TAT. CAC. TGT. CCA. TAC. TCA. GGC. TGA. CAC. CTCPlO :GAC, ACC, AGT, CTT, CAG, AGG, ATT, GAA, CAG, AGG, ATC, AGG, AGA, GGA, GGT, GTC,AGC, CTG, AGT, ATGPll :ATC, CTC, TGA, AGA, CTG, GTG, TCT, ACG，CTA，TCC，TGTP12 :CTG, TGA, CCA, GTG, AAG, TCA, GCA, GCG，TCA，GTG，ACGP13 :GCT, GAC, TTC, ACT, GGT, CAC, AGA, GTC，CTG，AAC，TTTP14 :CGT, CCT, GTT, TCT, CTC, TCT, TCA, GGA，CTC，TTT，CCAP15 :GAA, GAG, AGA, GAA, ACA, GGA, CGA, TTC，TGA，ACT, GAAP16 :GGA, GAC, AGC, ACC, AGT, CAA, GGA, AGA，AGG，CAG，AGCP17 :CCT, TGA, CTG, GTG, CTG, TCT, CCC, TGC, TGC, AAC, AAGP18 :TCG, GTG, ATT, CTA, CCC, CAA, CCA, AGC，AAG，AAG，ATTP19 :GGT, TGG, GGT, AGA, ATC, ACC, GAC, TTG, CAC, AAT, GCTP20 :ATC, TAG, CAA, CTT, CAG, GAG, TTC, GCA，AGG，ACA，GCAP21 :AAC, TCC, TGA, AGT, TGC, TAG, ATC, CAA, GAC, TGC, TCTP22 :AGT, GAC, ACC, ATA, GGC, TTG, CTT, CTT，GAT，CAG，GTAP23 :AGC, AAG, CCT, ATG, GTG, TCA, CTC, GTC，ACG，ACA，CCAP24 :GTC, CAG，TTG，AGT，TCC，AGA，GCA， TGA，CCA，GCA，ATGP25 :GCT, CTG, GAA, CTC, AAC, TGG, ACC, CCT，GGT，GGT，GAAP26 :GAG, AGT，TGT，CAG，ACA，GTC，TTC， CAG，GAG, GAG, TATP27 :AAG, ACT, GTC, TGA, CAA, CTC, TCA, GAC，CTT，GCA，GCAP28 :TGG, AGG，AGT，GTT，CAA，GGA，CAG， GGT, CTG, GAA, GACP29 :TGT, CCT，TGA，ACA，CTC，CTC，CAG， GTG，AAG，AGA，GAAGTC，AAC，TGG，ACA，ACG，CTA，ACG，TCA，CTG， ATG，GAA，CCA，CCA，GCT，CTG，GAC，AGG，ATA， CAA，ACT, GCT，TTC，AGA，GAA，CTG，GAA，AGA， AGC，ACA，AGT，TGG，ATT，GAG, GAA，AGT，TCA， ATC，CTG，TTC，CTT，GAC，CCA，GGC，TCT，GCC， GAC，ATT，GTC，AGC，AGA，GAC，CTT，CAG，TTC， TGG, CTT, CCA, TGC, TGA, CTG, AAA, TCT, TCT， GGT，TCA，GGC，ATA，CCT，TGA，GCT，TGT，TGC， TCT，CAT, CAA，TGG，AAC，ACC，TTG，CTG，TCC， TCT，GAA，GCA，AGT，CGA，ACT, GAG, CAT, TGT， CAG，AGC，TAC，TCC，TCT，GTT，GTA，CCT，GAT， CTG, AGG, AGG, ATG, AGG, AGT, CAG, AGC, AGT， TTC，CTA，CCT，CTG，TTC，TGT，TCA，TTG，CTG， CCA，CCC，AAG，TTG，GCA，AGA，TTG，GTG，TCG， TTG，CCT，GGT，CAG，CCT，GAC，AAT，ACT, CCT， TCC，ATC，TTT，CGA，AGA，CCA，GTT，CAC，CAC， GTG, GAT, TCA, GGT, CTC, CTT, GGT, CTT, CCA， AGG，AGT，CTT，GTC，TCT，CAT, CTG，CTG，CAA， GTG，AAG，TTA，AGC，TGA，CTC，TGG，CTG，GAT，P30 :ATC, TGA，GTG，AAA, CCA，GCC，AAG，GAG，CAC，ATA，CCT，TGA，GCG，TTT，CTC，TCT， TCA，CAT, CCA，GCCP31 :GAG, CTC, TTA, CAG, GGA, ACA, GGC, AGG, GAT, TCT, GGC, TTC, GTT, GAC, AAT, CTG, AGT，GA, AAC，CAG，CCA0
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在干，所述原核表達(dá)載體為畢赤酵母表達(dá)載體 PYPX88。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在干，所述WiyFl引物具體如下PhyFl :GCTGAGGCTGTCATCGGTTACTC ；所述 PhyRl 引物具體如下PhyRl GATCAGGAGCAAGCTC GTACGAG。
8.包括權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述適于畢赤酵母表達(dá)的高比活植酸酶基因APPA2-1的 PYPAPPA2-1 載體。
9.權(quán)利要求8所述的pYPAPPA2-l載體在畢赤酵母中的高效表達(dá)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種適于畢赤酵母表達(dá)的高比活植酸酶基因及其制備方法和表達(dá)。所述適于畢赤酵母表達(dá)的高比活植酸酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。本發(fā)明對(duì)來源于大腸桿菌的APP2植酸酶基因按照畢赤酵母偏愛密碼子優(yōu)化，采用連續(xù)延伸PCR方法合成植酸酶APPA2基因，并在原核表達(dá)載體上采用DNA重組技術(shù)建立突變文庫，電擊轉(zhuǎn)入畢赤酵母，篩選出高比活植酸酶基因APPA2-1。將本發(fā)明制備的高比活植酸酶基因構(gòu)建到畢赤酵母表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化入畢赤酵母中表達(dá)，可用于高比活植酸酶的生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12N9/16GK102586294SQ20111000594
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2011年1月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月12日
發(fā)明者付曉燕, 姚泉洪, 彭日荷, 朱波, 熊愛生, 田永生, 薛永, 趙偉, 金曉芬 申請(qǐng)人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院