專利名稱：致病性弧菌通用檢測(cè)法及所用的核酸等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及海水養(yǎng)殖動(dòng)物病原檢測(cè)技術(shù)，具體是涉及海水養(yǎng)殖動(dòng)物致病性弧菌的核酸等溫?cái)U(kuò)增通用檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
致病性弧菌是海洋環(huán)境中常見的病原菌類群之一，引起的弧菌病是一種流行范圍廣，危害嚴(yán)重的傳染性疾病，可危害魚類、甲殼類和貝類等多種海水養(yǎng)殖動(dòng)物，對(duì)海水養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。隨著海水養(yǎng)殖業(yè)的蓬勃發(fā)展，弧菌病頻繁發(fā)生，常見病原種類有哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)、溶藻弧菌(K alginolyticus)、副溶血弧菌(K paraAa湖ο斤iit^s)、創(chuàng)傷弧菌(V. rahi/it^s)、弗氏弧菌(V. /tfraiwii)、河流弧菌(V. fluvialis)、擬態(tài)弧菌(K mimicus)、鰻弧菌(V. anguillarum)等，其中大多數(shù)種類還是人類的致病菌。對(duì)由致病性弧菌中的不同種類感染引起的海水養(yǎng)殖動(dòng)物病害，在養(yǎng)殖生產(chǎn)中采用的具體預(yù)防或控制措施基本上是相似的，海水養(yǎng)殖動(dòng)物患病后，養(yǎng)殖場(chǎng)(戶)關(guān)心的是養(yǎng)殖種類是否被致病性弧菌所感染，而不太會(huì)去關(guān)心是哪一種致病性弧菌所感染，因此建立一種致病性弧菌的通用檢測(cè)方法及檢測(cè)試劑盒是非常有必要的。但現(xiàn)行的弧菌檢測(cè)方法針對(duì)樣品單一，而且操作步驟繁瑣，不易實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)批量檢測(cè)，很難滿足海水養(yǎng)殖動(dòng)物病害防治的需要。現(xiàn)行檢測(cè)致病性弧菌主要有三種方法①生理生化鑒定法，該法操作步驟繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力；②酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)，該法雖檢測(cè)快速、靈敏度高、可用于大批量檢測(cè)等特點(diǎn)，但對(duì)新鮮樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)易出現(xiàn)假陽性問題，在一定程度上限制了在生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用；③聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(PCR)，該法快速、靈敏，但需要昂貴的核酸擴(kuò)增儀，同樣限制了在生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用。近年來發(fā)展起來的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(LAMP)，是一種新型的恒溫核酸擴(kuò)增方法， 可以有選擇性地高效擴(kuò)增靶基因序列，產(chǎn)物是一系列反向重復(fù)的靶序列構(gòu)成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)和多環(huán)花椰菜樣結(jié)構(gòu)的DNA片段混合物，電泳后在凝膠上顯現(xiàn)出不同大小區(qū)帶組成的階梯式圖譜。LAMP與其它致病性弧菌檢測(cè)方法相比優(yōu)點(diǎn)明顯①雖然反應(yīng)原理、引物設(shè)計(jì)比較復(fù)雜，但是在恒溫條件下擴(kuò)增，只需要一個(gè)恒溫裝置(如水浴鍋、保溫杯等)就可以進(jìn)行；②高效靈敏，模板僅需要10個(gè)拷貝或更少；③特異性強(qiáng)，應(yīng)用包含了六個(gè)區(qū)段的四條引物按嚴(yán)格順序進(jìn)行擴(kuò)增；④檢測(cè)時(shí)間短，擴(kuò)增可以在60min內(nèi)完成；⑤產(chǎn)物可以通過直接在反應(yīng)管中加入熒光染料染色，結(jié)果形象直觀。盡管現(xiàn)已有LAMP方法用于弧菌檢測(cè)，如副溶血弧菌 (中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?00710046637. 4，200710030441. 6，200710026389. 7，200810030340. 3 ； Wataru Y, 2009)、霍亂弧菌(中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?00710030446. 9 ;Srisuk C, 2009)、擬態(tài)弧菌(中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?200710026390.X)、河流弧菌(中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?200710026391. 4)、創(chuàng)傷弧菌(中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?00810151271. 1 ;Han F, 2008 ；Ren C H, 2008)，但均是針對(duì)弧菌屬中細(xì)菌的單一種類。而在海水養(yǎng)殖生產(chǎn)中養(yǎng)殖動(dòng)物面臨被多種致病弧菌感染的可能， 實(shí)踐中養(yǎng)殖生產(chǎn)者更加關(guān)心的是致病病原是否是弧菌，而不必知道是哪一種弧菌所感染， 因此在海水養(yǎng)殖領(lǐng)域建立一種致病性弧菌的通用檢測(cè)方法及檢測(cè)試劑盒是非常有必要的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種成本低、檢測(cè)靈敏度高且易現(xiàn)場(chǎng)大批量操作的海水養(yǎng)殖動(dòng)物致病性弧菌通用檢測(cè)方法及所用的核酸等溫?cái)U(kuò)增通用檢測(cè)試劑盒。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種海水養(yǎng)殖動(dòng)物致病性弧菌核酸等溫?cái)U(kuò)增通用檢測(cè)試劑盒，該試劑盒包括
(1)、研磨液管內(nèi)裝研磨液，
(2)、核酸提取液A管內(nèi)裝乙酸鈉溶液，
(3)、核酸提取液B管內(nèi)裝無水乙醇，
(4)、核酸提取液C管內(nèi)裝質(zhì)量濃度70%的乙醇溶液，
(5)、TE緩沖液管內(nèi)裝TE緩沖液；
(6)、UNG酶管內(nèi)裝尿嘧啶DNA糖基化酶；
(7)、LAMP反應(yīng)液管內(nèi)裝LAMP反應(yīng)液；
(8),Bst DNA聚合酶管內(nèi)裝fei DNA聚合酶；
(9)、顯色劑管內(nèi)裝核酸染料STORGreen I ；
(10)、陽性對(duì)照核酸管內(nèi)裝弧菌陽性DNA；
(11)、陰性對(duì)照管內(nèi)裝滅菌的雙蒸水。作為本發(fā)明的致病性弧菌核酸等溫?cái)U(kuò)增通用檢測(cè)試劑盒的改進(jìn)研磨液是由以下體積的組分組成廣2 M的三羥甲基氨基甲烷溶液5 10份，0.25 1.0M的乙二胺四乙酸二鈉溶液0. 5 2. 0份，質(zhì)量濃度5 10%的十二烷基磺酸鈉溶液5 10份，巰基乙醇0. θΓ . O 份，8-羥基喹啉0. ΟΓΟ. 02份，平衡酚5 10份和氯仿5 10份，用雙蒸水定容到100份。作為本發(fā)明的致病性弧菌核酸等溫?cái)U(kuò)增通用檢測(cè)試劑盒的進(jìn)一步改進(jìn)LAMP 反應(yīng)液由以下組分組成LAMP弓丨物VIBRI0-FIP和VIBRI0-BIP各廣4 μ Μ, LAMP弓丨物 VIBRI0-F3 和 IVIBRI0-B3 各 0. Γθ. 5 μ Μ, dATP、dGTP 和 dCTP 各 0. 5 2 mM, dTTP、dUTP 各 0.25 1 mM, Tris-HCl 10 40 mM, KCl 10 20 mM, (NH4)2SO4 5 15 mM, MgSO4 Γ4 mM, Triton X-100 0. 05% 1. 0%, Betaine 0. 8 1. 2 M ；其余為雙蒸水。作為本發(fā)明的致病性弧菌核酸等溫?cái)U(kuò)增通用檢測(cè)試劑盒的進(jìn)一步改進(jìn)LAMP引物的核酸序列如下
VIBRIO-FIP (SEQ ID NO. 1)
5’- CGGCTGCTGGCACGGAGTTTTTGCATTATTTGACGTTAGCGACAGAAG ； VIBRI0-BIP (SEQ ID N0. 2)
5’- GAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCTTTTCCGGGCTTTCACATCTGACTTAAC ； VIBRI0-F3 (SEQ ID NO. 3) 5’- CAGTCGTGAGGAAGGTGGTGT ； VIBRI0-B3 (SEQ ID NO. 4) 5' - CTAGTCTGCCAGTTTCAAATGCT。本發(fā)明還提供了利用檢測(cè)試劑盒進(jìn)行的海水養(yǎng)殖動(dòng)物致病性弧菌的檢測(cè)方法，包括下列步驟
⑴、取待測(cè)樣品組織0. 2g置于離;Lfl中，加入0. 5 ml研磨液，用研磨棒充分磨碎至菜狀；(2)、將上述研磨所得的漿狀樣品煮沸(100°C，10 min)后以10000 r/min離心5 min, 取上清液置于離心管Π中；
(3)、向離心管Π內(nèi)加入核酸提取液A管內(nèi)的乙酸鈉溶液混勻，所述乙酸鈉溶液與上清液的體積比為1/10 ；再加入-20°C預(yù)冷的核酸提取液B管內(nèi)的無水乙醇混合，靜置10 min, 以12000 r/min離心5min，棄上清液，保留沉淀物，所述無水乙醇與上清液的體積比為2 1 ；
(4)、用核酸提取液C管內(nèi)的乙醇溶液洗滌上述步驟(3)所得的沉淀物，然后以12000 r/min離心5 min，棄上清液，保留沉淀物；
(5)、用核酸提取液C管內(nèi)的乙醇溶液洗滌上述步驟(4)所得的沉淀物，然后以12000 r/min離心5 min，棄上清液，保留沉淀物；
(6)、將上述步驟(5)所得的沉淀物于室溫晾干，加入20μ TE緩沖液溶解沉淀物，得到樣品核酸；
(7)、分別將上述樣品核酸、陰性對(duì)照管內(nèi)的雙蒸水、陽性對(duì)照核酸管內(nèi)的陽性對(duì)照核酸2 μ 1，加至21 μ 1 LAMP反應(yīng)液中，再加入1 μ 1 UNG酶，分別得檢測(cè)管、陰性對(duì)照管和陽性對(duì)照管；對(duì)上述檢測(cè)管、陰性對(duì)照管和陽性對(duì)照管均于37°C保溫10 min進(jìn)行酶解；
(8)、將上述檢測(cè)管、陰性對(duì)照管和陽性對(duì)照管酶解后的反應(yīng)體系分別進(jìn)行如下操作 先于95°C保溫5 min，然后再迅速置于碎冰塊中5 min ；
(9)、向步驟(8)所得的檢測(cè)管、陰性對(duì)照管和陽性對(duì)照管的反應(yīng)體系中再分別加入 1 μ 1 Bst DNA 聚合酶；
(10)、將上述步驟(9)所得的檢測(cè)管、陰性對(duì)照管和陽性對(duì)照管分別進(jìn)行如下操作先于64 °C保溫45 min，然后于90 °C保溫2 min完成LAMP反應(yīng)；
(11)、LAMP反應(yīng)結(jié)束后，加入1μ1核酸染料SYBR Green I，如果檢測(cè)管內(nèi)LAMP反應(yīng)產(chǎn)物的顏色與陰性對(duì)照管反應(yīng)產(chǎn)物的顏色均呈橙色，則待測(cè)品致病性弧菌檢測(cè)結(jié)果為陰性； 如果檢測(cè)管內(nèi)LAMP反應(yīng)產(chǎn)物的顏色同陽性對(duì)照管反應(yīng)產(chǎn)物的顏色均呈綠色，則待測(cè)品致病性弧菌檢測(cè)結(jié)果為陽性。在本發(fā)明的試劑盒中，原料能以市購(gòu)的方式獲得，例如乙二胺四乙酸二鈉、三羥甲基氨基甲烷、十二烷基磺酸鈉、醋酸鈉、氯仿、平衡酚、巰基乙醇、8-羥基喹啉、MgCl2、dATP、 dGTP、dCTP、dTTP購(gòu)自上海生物工程有限責(zé)任公司，dUTP購(gòu)自上海閃晶分子生物科技有限公司，尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)、Bst DNA聚合晦等購(gòu)自美國(guó)NEB公司，核酸染料SYBR Green I購(gòu)自北京鼎國(guó)生物科技有限公司，Betaine、Triton X-100購(gòu)自Sigma公司。LAMP 弓丨物 VIBRIO-FIP、VIBRIO-BIP、VIBRI0-F3 禾Π VIBRI0-B3 以及 PCR 引物 VIBRIO-Pf、VIBRIO-Pr可委托美國(guó)invitrogen (上海)英濰捷基生物技術(shù)有限公司合成。

致病性弧菌陽性DNA的獲得方式為提取哈維氏弧菌基因組DNA，用PCR引物 VIBRIO-Pf和VIBRIO-Pr進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25 μ 1體系包括2. 5 μ 1 10XPCR反應(yīng)緩沖液、1.0 μ 1 dNTPs(10mM)、l. 0μ 1 VIBRIO-Pf■和 VIBRIO-Pr (20 μΜ)、0.5 μ 1 Taq DNA 聚合酶(5 U/μ 1，北京鼎國(guó)生物科技有限公司)，其余為雙蒸水。擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)變性5 min，之后進(jìn)入擴(kuò)增循環(huán)，94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸60s完成一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，重復(fù)循環(huán)30輪，最后72°C 10 min，4°C保存。擴(kuò)增得474bp的條帶，回收該片段后，按T載體說明書要求連接到T載體(pMD-18 T-Vector，購(gòu)自大連寶生物公司)上，并按感受態(tài)細(xì)胞操作要求將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞JM109 (購(gòu)自大連寶生物公司)內(nèi)，用藍(lán)白斑方法篩選陽性菌，并用引物VIBRIO-Pf和VIBRIO-Pr進(jìn)行PCR驗(yàn)證(程序同上)。最后用堿法提取陽性菌的質(zhì)粒，作為弧菌陽性DNA。本發(fā)明檢測(cè)方法的步驟(7)中，通過在提取的樣品核酸中加入1個(gè)單位的UNG酶來消除模板污染對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾。也可在步驟(9)中預(yù)先加入不抑制LAMP反應(yīng)的核酸染料，避免了反應(yīng)結(jié)束后開蓋加入染料檢測(cè)結(jié)果，大大降低了模板污染的可能，可避免假陽性的產(chǎn)生。與其他報(bào)道的LAMP技術(shù)相比，本發(fā)明的核心之一是針對(duì)弧菌屬保守的16s RNA基因，優(yōu)選了目的基因區(qū)段來設(shè)計(jì)LAMP特異性引物，使得該引物能有效檢測(cè)弧菌屬細(xì)菌，而且檢測(cè)特異性好；核心之二是用專門設(shè)計(jì)的研磨液進(jìn)行樣品的處理，使得樣品的處理過程極其簡(jiǎn)單；核心之三是采用尿嘧啶糖基化酶消除LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物的污染，避免了因LAMP產(chǎn)物擴(kuò)增量大造成的假陽性結(jié)果；核心之四是實(shí)現(xiàn)了可不開蓋檢測(cè)，從源頭上避免了污染的產(chǎn)生，進(jìn)一步避免了假陽性結(jié)果的出現(xiàn)；核心之五是優(yōu)化了整個(gè)操作過程的技術(shù)參數(shù)，并將其標(biāo)準(zhǔn)化、配套化，形成檢測(cè)試劑盒，便于現(xiàn)場(chǎng)大批量應(yīng)用。在發(fā)明中引物設(shè)計(jì)時(shí)所選取的目標(biāo)序列為弧菌屬細(xì)菌保守的16S RNA基因，故原則上反應(yīng)能檢測(cè)出所有弧菌屬內(nèi)細(xì)菌(絕大多數(shù)是致病性弧菌)；反應(yīng)不會(huì)對(duì)其他細(xì)菌基因進(jìn)行擴(kuò)展，故不能檢測(cè)出非弧菌屬的細(xì)菌。本發(fā)明是根據(jù)弧菌屬細(xì)菌16S RNA基因的保守序列區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物，建立致病性弧菌LAMP的通用檢測(cè)技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)海水養(yǎng)殖動(dòng)物患病臨床樣本的大批量現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。因此，本發(fā)明的積極效果在于在試劑盒中匯集了弧菌檢測(cè)所需的研磨液、核酸提取液等十種試劑和三種器材，使得弧菌檢測(cè)能有序地進(jìn)行，實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)過程現(xiàn)場(chǎng)化、程序化和標(biāo)準(zhǔn)化，使得操作規(guī)范、不易出錯(cuò)；本發(fā)明的通用檢測(cè)方法是根據(jù)弧菌屬保守的16s RNA 基因區(qū)序列設(shè)計(jì)的一套LAMP引物為主體而設(shè)計(jì)的，因而使弧菌檢測(cè)完全具有了 LAMP技術(shù)靈敏、快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的特點(diǎn)；UNG酶能消除多次檢測(cè)過程中的核酸污染，解決了限制LAMP 技術(shù)廣泛應(yīng)用的易被污染干擾的問題。使用本發(fā)明的試劑盒及檢測(cè)方法在2小時(shí)內(nèi)就可完成致病性弧菌的檢測(cè)，檢測(cè)過程無需昂貴的儀器設(shè)備如PCR儀和凝膠成像系統(tǒng)，僅需有水浴鍋或金屬浴和普通離心機(jī)即可；而且檢測(cè)結(jié)果非常容易判別；與弧菌屬細(xì)菌已有的檢測(cè)技術(shù)相比，本發(fā)明的試劑盒及相應(yīng)檢測(cè)方法不僅實(shí)現(xiàn)了弧菌的通用檢測(cè)，而且成本低、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單，可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)?？傊?，本發(fā)明的方法具有比以往檢測(cè)方法更高的靈敏度和便捷性，可以替代致病性弧菌之前的相關(guān)檢測(cè)方法如生理生化法、PCR法、酶聯(lián)免疫吸附法等。
具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例1、一種海水養(yǎng)殖動(dòng)物致病性弧菌核酸等溫?cái)U(kuò)增通用檢測(cè)試劑盒(5樣份，即可用于5樣次的檢測(cè))，由以下內(nèi)容物組成
(1)研磨液管，1管，3 ml。研磨液配制1 M的三羥甲基氨基甲烷溶液(Tris-HCl，pH8. 0) 10份，0. 25M的乙二胺四乙酸二鈉溶液(EDTANii2) 2份，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5 %的十二烷基磺酸鈉溶液(SDS) 10 份，巰基乙醇0. 5份，8-羥基喹啉0. 01份，平衡酚7份，氯仿8份，用雙蒸水定容到100份而成。以上份數(shù)均為體積份數(shù)。(2)核酸提取液A管，1管，內(nèi)裝400 μ 1 3Μ乙酸鈉溶液(ρΗ5. 2)。(3)核酸提取液B管，1管，內(nèi)裝10 ml無水乙醇。(4)核酸提取液C管，1管，內(nèi)裝10 ml質(zhì)量濃度70%的乙醇溶液。(5) TE 緩沖液管，1 管，內(nèi)裝400 μ 1 TE 緩沖液(含 10 mM Tris-HCl^P ImM EDTA, PH8.0，其余為雙蒸水)。(6) UNG酶管，1管，內(nèi)裝6 U尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)， (7) LAMP反應(yīng)液管，1管，內(nèi)裝150 μ 1 LAMP反應(yīng)液，
LAMP反應(yīng)液的組成成分如下LAMP引物VIBRI0-FIP和VIBRI0-BIP各2 μ M，LAMP引物 VIBRI0-F3 和 VIBRI0-B3 各 0. 3 μ M，dATP、dGTP 和 dCTP 各 ImM, dTTP、dUTP 各 0. 5mM, Tris-HCl 20mM, KCl 15mM, (NH4)2SO4 IOmM, MgSO4 2mM, Triton X-100 0. 5%(體積濃度)， Betaine IM ；其余為雙蒸水。上述致病性弧菌基因通用檢測(cè)試劑盒中所述的LAMP引物根據(jù)弧菌屬保守的 16s RNA基因序列設(shè)計(jì)的，LAMP引物設(shè)計(jì)的首選軟件是I^rimerExplore 4.0 (http:// primerexplorer. jp/elamp4. 0. 0/index. html)，也可以使用常用的引物設(shè)計(jì)軟件(如 Primer Primier 5.0或Omiga 2.0)按照LAMP引物的設(shè)計(jì)要求進(jìn)行設(shè)計(jì)。本發(fā)明中利用軟件PrimerExplore 4. 0在線設(shè)計(jì)的一套LAMP引物的DNA序列如下
VIBRI0-FIP
5’- CGGCTGCTGGCACGGAGTTTTTGCATTATTTGACGTTAGCGACAGAAG ； VIBRI0-BIP
5’- GAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCTTTTCCGGGCTTTCACATCTGACTTAAC ； VIBRI0-F3
5’- CAGTCGTGAGGAAGGTGGTGT ； VIBRI0-B3
5' - CTAGTCTGCCAGTTTCAAATGCT。(8) Bstmk聚合酶管，1管，內(nèi)裝5 μ 1 feiDNA聚合酶。(9)顯色劑管，1管，內(nèi)裝5 μ 1的液體染料，該液體染料由核酸染料STOR Green I 和雙蒸水按照1:100的體積比混合而得。(10)陽性對(duì)照核酸管，1管，內(nèi)裝10 μ 1弧菌陽性DNA0制備方法如下用位于LAMP目標(biāo)片段上下游的PCR引物(VIBRIO-Pf [SEQ ID NO. 5] 5' - AGACACGGTCCAGACTCCTAC ；VIBRIO-Pr [SEQ ID NO. 6] 5'-AGGGTATCTAATCCTGTTTGCT )，對(duì)哈維氏弧菌基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94 °C預(yù)變性5 min，94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸60s完成一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，重復(fù)循環(huán)30輪， 最后72°C 10min，4°C保存，得到474bp的條帶，回收該片段后，將其連接到載體pMD_18 T-Vector，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞JM109，經(jīng)PCR驗(yàn)證后，提取質(zhì)粒，稀釋至100拷貝/ μ 1后作為弧菌陽性對(duì)照。該哈維氏弧菌例如可購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，如為 CGMCC 1.1600。
(11)陰性對(duì)照管，1管，內(nèi)裝10 μ 1滅菌雙蒸水。(12)研磨棒，5 支。(13)包裝盒(78 X 78 X 50mm)。 (14) 一塊泡沫板，泡沫板高22 mm,有三列孔，第一列四個(gè)孔，孔徑5. 5 mm,第二列三個(gè)空，孔徑10 mm，第三列三個(gè)空，孔徑15. 5mm。上述廣11的各小管放置于這些小孔中， 該泡沫板與上述包裝盒的底面大小相同，裝于包裝盒內(nèi)。(15)試劑盒使用說明書一份。實(shí)施例2、一種海水養(yǎng)殖動(dòng)物致病性弧菌核酸等溫?cái)U(kuò)增通用檢測(cè)試劑盒(5樣份)，僅以下內(nèi)容不同于實(shí)施例1，其余均同實(shí)施例1。研磨液配制2 M的三羥甲基氨基甲烷溶液(Tris-HCl，pH8. 0) 5份，0. 5M的乙二胺四乙酸二鈉溶液(EDTANa2) 1份，質(zhì)量分?jǐn)?shù)7 %的十二烷基磺酸鈉溶液(SDS) 7份，巰基乙醇0. 01份，8-羥基喹啉0. 02份，平衡酚5份，氯仿10份，以雙蒸水定容到100份而成。 以上份數(shù)均為體積份數(shù)。LAMP反應(yīng)液的組成成分如下LAMP引物VIBRI0-FIP和VIBRI0-BIP各4 μ M, LAMP 引物 VIBRI0-F3 和 VIBRI0-B3 各 0. 5 μ M，dATP、dGTP 和 dCTP 各 2mM, dTTP 和 dUTP 各 1. OmM, Tris-HCl 40mM, KCl 20mM, (NH4)2SO4 15mM, MgSO4 4mM, Triton X-100 1.0%, Betaine 0. 8M ；其余為雙蒸水。實(shí)施例3、一種海水養(yǎng)殖動(dòng)物致病性弧菌核酸等溫?cái)U(kuò)增通用檢測(cè)試劑盒(5樣份)，僅以下內(nèi)容不同于實(shí)施例1，其余均同實(shí)施例1。研磨液配制1. 5 M的三羥甲基氨基甲烷溶液(Tris-HCl，pH8. 0) 7份，1. OM的乙二胺四乙酸二鈉溶液(EDTANa2) 0. 5份，質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的十二烷基磺酸鈉溶液(SDS) 5 份，巰基乙醇0. 01份，8-羥基喹啉0. 015份，平衡酚10份，氯仿10份，以雙蒸水定容到100 份而成。以上份數(shù)均為體積份。LAMP反應(yīng)液的組成成分如下LAMP引物VIBRI0-FIP和VIBRI0-BIP各1 μ M， LAMP 引物 VIBRI0-F3 和 VIBRI0-B3 各 0. 25 μ Μ, dATP、dGTP 和 dCTP 各 0. 5mM, dTTP、dUTP 各0.5mM, Tris-HCl 40mM, KCl IOmM, (NH4)2SO4 5mM, MgSO4 ImM, Triton X-100 0. 05%, Betaine 0. 8M ；其余為雙蒸水。實(shí)施例4、一種海水養(yǎng)殖動(dòng)物致病性弧菌的通用檢測(cè)方法，利用實(shí)施例廣實(shí)施例3 的任意一種檢測(cè)試劑盒，依次進(jìn)行如下步驟
(1)、取待測(cè)患病青石斑魚肝臟組織0.2 g置于離心管I中，加入研磨液管內(nèi)的0. 5ml
研磨液，用研磨棒充分磨碎至漿狀；
(2)、將上述研磨所得的漿狀樣品煮沸(100°C，10min)后以10000 r/min離心5 min,
取上清液置于離心管Π中；
(3)、向離心管Π內(nèi)加入核酸提取液A管內(nèi)的乙酸鈉溶液混勻，乙酸鈉溶液與上清液的體積比為1/10 ；再加入-20°C預(yù)冷的核酸提取液B管內(nèi)的無水乙醇混合，靜置lOmin，以 12000 r/min離心5min，棄上清液，保留沉淀物，無水乙醇與上清液的體積比為2:1 ；
(4)、用核酸提取液C管內(nèi)的1ml乙醇溶液洗滌上述步驟(3)所得的沉淀物，然后以 12000 r/min離心5 min，棄上清液，保留沉淀物;(5)、用核酸提取液C管內(nèi)的Iml乙醇溶液洗滌上述步驟(4)所得的沉淀物，然后以 12000 r/min離心5 min，棄上清液，保留沉淀物;
(6)、將上述步驟(5)所得的沉淀物(位于離心管Π的底部)于室溫晾干，加入TE緩沖液管內(nèi)的20 μ TE緩沖液溶解沉淀物，得到樣品核酸；
(7)、分別將上述樣品核酸、陰性對(duì)照管內(nèi)的雙蒸水、陽性對(duì)照核酸管內(nèi)的陽性對(duì)照核酸2 μ 1，加至21 μ 1 LAMP反應(yīng)液中，再加入1 μ 1 UNG酶，從而分別得檢測(cè)管、陰性對(duì)照管和陽性對(duì)照管；對(duì)上述檢測(cè)管、陰性對(duì)照管和陽性對(duì)照管均于37°C保溫10 min進(jìn)行酶解， 目的是以酶解方法消除其中可能存在的污染模板；
(8)、將上述檢測(cè)管、陰性對(duì)照管和陽性對(duì)照管酶解后的反應(yīng)體系分別進(jìn)行如下操作先于95°C保溫5 min，然后再迅速置于碎冰塊中5 min ；
(9)、向步驟(8)所得的檢測(cè)管、陰性對(duì)照管和陽性對(duì)照管的反應(yīng)體系中再分別加入 1 μ 1 Bst DNA 聚合酶；
(10)、將上述步驟(9)所得的檢測(cè)管、陰性對(duì)照管和陽性對(duì)照管分別進(jìn)行如下操作 先于64 °C保溫45 min，然后于90 °C保溫2 min完成LAMP反應(yīng)；
(11)、LAMP反應(yīng)結(jié)束后，加入1μ 1核酸染料STOR Green I，如果檢測(cè)管與陽性對(duì)照管均顯示綠色，陰性對(duì)照管顯示橙色，表示該樣品的弧菌檢測(cè)結(jié)果為陽性；如果檢測(cè)管與陰性對(duì)照管均顯示橙色，陽性對(duì)照管顯示綠色，表示該樣品的弧菌檢測(cè)結(jié)果為陰性；如果陽性對(duì)照管顯示橙色，表示該檢測(cè)試劑已失效，需更換檢測(cè)試劑后重新檢測(cè)；如果陰性對(duì)照管顯示綠色，表示該檢測(cè)試劑已被污染，需更換檢測(cè)試劑及檢測(cè)地點(diǎn)后重新檢測(cè)。實(shí)施例5、一種海水養(yǎng)殖動(dòng)物致病性弧菌的通用檢測(cè)方法，對(duì)病樣用營(yíng)養(yǎng)肉湯進(jìn)行增菌后，按照以下步驟對(duì)致病性弧菌進(jìn)行檢測(cè)
(1)、取待測(cè)患病青石斑魚肝臟組織2 g置于無菌勻漿器中勻漿，將勻漿液加到營(yíng)養(yǎng)肉湯(5ml)中25°Cl8°C搖床培養(yǎng)證 61!。營(yíng)養(yǎng)肉湯配方為蛋白凍10g，牛肉膏3g，氯化鈉 5g，蒸餾水 1000ml，pH7. 4。將上述成分混合、溶解后校正pH，121 °C高壓滅菌15min。(2)、取2ml菌液，10000r/m離心lmin，棄上清，加入50 μ 1雙蒸水，水浴煮沸 IOmin0(3)U0000r/m 離心 lmin，取上清。(4)、使用實(shí)施例廣實(shí)施例3的任意一種檢測(cè)試劑盒，按照實(shí)施例4中步驟(7) 步驟(11)所述方法進(jìn)行檢測(cè)。如果檢測(cè)管顯示綠色則表示該樣品的弧菌檢測(cè)結(jié)果為陽性，若檢測(cè)管顯示橙色則表示該樣品的弧菌檢測(cè)結(jié)果為陰性。通過此實(shí)施例5說明本發(fā)明可以不用經(jīng)過較為復(fù)雜的DNA模板制備，如果組織感染細(xì)菌并且經(jīng)擴(kuò)增之后只需煮沸、離心即能制備DNA檢測(cè)模板，此方法簡(jiǎn)便實(shí)用，無需核酸提取液。實(shí)施例6、一種海水養(yǎng)殖動(dòng)物致病性弧菌的通用檢測(cè)方法，以不同種細(xì)菌作為檢測(cè)對(duì)象，驗(yàn)證檢測(cè)方法的特異性。按照以下步驟對(duì)細(xì)菌進(jìn)行檢測(cè)
(1)、將溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈維氏弧菌、河流弧菌、嗜水氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌、 大腸桿菌、硝化細(xì)菌分別于合適培養(yǎng)基中培養(yǎng)富集至0D_=0. 6。然后分別進(jìn)行下述步驟
(2)、取Iml菌液，10000r/m離心lmin，棄上清，加入50μ 1雙蒸水，水浴煮沸IOmin0
10
(3)、10000r/m離心lmin，取上清，即得細(xì)菌DNA檢測(cè)模板?？蓪⑸鲜瞿０逵肨E緩沖液進(jìn)行IO-1, IO-2, IO-3, IO-4, IO-5, IO-6, IO-7倍系列稀釋，從而分別得KT1-IO-7模板。 (4)、使用實(shí)施例廣實(shí)施例3的任意一種檢測(cè)試劑盒，按照實(shí)施例4中步驟(7) 步驟(11)所述方法，分別對(duì)KT1-KT7模板進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，LAMP反應(yīng)能檢測(cè)出溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈維氏弧菌、河流弧菌等致病性弧菌，而對(duì)嗜水氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌、大腸桿菌、硝化細(xì)菌等水環(huán)境中常見細(xì)菌的檢測(cè)結(jié)果呈現(xiàn)陰性。上述結(jié)果說明本發(fā)明的LAMP檢測(cè)試劑盒對(duì)致病性弧菌具有很好的特異性。對(duì)比實(shí)驗(yàn)1 以同一患病動(dòng)物樣品(已確認(rèn)感染哈維氏弧菌)作為待測(cè)樣品，利用實(shí)施例1中的試劑盒，按實(shí)施例4中步驟(1廣步驟(6)的方法制備患病青石斑魚的檢測(cè)模板(即樣品核酸)。將上述模板用TE緩沖液進(jìn)行10—1，ΙΟ"2, ΙΟ"3, ΙΟ"4, ΙΟ"5, ΙΟ"6, ΙΟ"7倍系列稀釋，分別作為L(zhǎng)AMP和PCR檢測(cè)模板。1)、按照實(shí)施例4中步驟(7) 步驟(11)所述方法，分別對(duì)KT1-IiT模板進(jìn)行檢查。2)、以同樣的模板進(jìn)行PCR檢測(cè)，使用引物VIBRIO-Pf和VIBRIO-Pr。結(jié)果表明，LAMP反應(yīng)能檢測(cè)到10_6倍稀釋的模板，而PCR只能檢測(cè)至10_3倍稀釋的模板，LAMP檢測(cè)的靈敏度比PCR高1000倍，且用時(shí)更少，無需復(fù)雜設(shè)備。對(duì)比實(shí)驗(yàn)2 以同一只患病青石斑魚作為待測(cè)樣品，利用實(shí)施例2中的試劑盒，實(shí)驗(yàn)方式同對(duì)比實(shí)驗(yàn)1。結(jié)果表明LAMP反應(yīng)能檢測(cè)到10_6倍稀釋的模板，而PCR只能檢測(cè)至10_3倍稀釋的模板。對(duì)比實(shí)驗(yàn)3 以同一只患病青石斑魚作為待測(cè)樣品，利用實(shí)施例3中的試劑盒，實(shí)驗(yàn)方式同對(duì)比實(shí)驗(yàn)1。結(jié)果表明LAMP反應(yīng)能檢測(cè)到10_6倍稀釋的模板，而PCR只能檢測(cè)至10_3倍稀釋的模板。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種海水養(yǎng)殖動(dòng)物致病性弧菌核酸等溫?cái)U(kuò)增通用檢測(cè)試劑盒，其特征是包括(1)、研磨液管內(nèi)裝研磨液，O)、核酸提取液A管內(nèi)裝乙酸鈉溶液，(3)、核酸提取液B管內(nèi)裝無水乙醇， G)、核酸提取液C管內(nèi)裝質(zhì)量濃度70%的乙醇溶液，(5)、TE緩沖液管內(nèi)裝TE緩沖液；(6)、UNG酶管內(nèi)裝尿嘧啶DNA糖基化酶；(7)、LAMP反應(yīng)液管內(nèi)裝LAMP反應(yīng)液；(8),Bst DNA聚合酶管內(nèi)裝fei DNA聚合酶；(9)、顯色劑管內(nèi)裝核酸染料STORGreen I ；(10)、陽性對(duì)照核酸管內(nèi)裝弧菌陽性DNA； (11)、陰性對(duì)照管內(nèi)裝滅菌的雙蒸水。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的海水養(yǎng)殖動(dòng)物致病性弧菌核酸等溫?cái)U(kuò)增通用檢測(cè)試劑盒，其特征是所述研磨液是由以下體積的組分組成廣2 M的三羥甲基氨基甲烷溶液5 10份， 0. 25 1. OM的乙二胺四乙酸二鈉溶液0. 5 2. 0份，質(zhì)量濃度5 10%的十二烷基磺酸鈉溶液 5 10份，巰基乙醇0. 0Γ1. O份，8-羥基喹啉0. ΟΓΟ. 02份，平衡酚5 10份和氯仿5 10份， 用雙蒸水定容到100份。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的海水養(yǎng)殖動(dòng)物致病性弧菌核酸等溫?cái)U(kuò)增通用檢測(cè)試劑盒， 其特征是所述LAMP反應(yīng)液由以下組分組成LAMP引物VIBRI0-FIP和VIBRI0-BIP各廣4 μ Μ, LAMP 引物 VIBRI0-F3 和 IVIBRI0-B3 各 0. Γθ. 5 μ Μ, dATP、dGTP 和 dCTP 各 0. 5 2 mM, dTTP、dUTP 各 0. 25 1 mM, Tris-HCl 10 40 mM,KCl 10 20 mM，(NH4)2SO4 5 15 mM, MgSO4 Γ4 mM, Triton X-100 0. 05% 1. 0%, Betaine 0. 8 1. 2 M ；其余為雙蒸水。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的海水養(yǎng)殖動(dòng)物致病性弧菌核酸等溫?cái)U(kuò)增通用檢測(cè)試劑盒，其特征是所述LAMP引物的核酸序列如下VIBRI0-FIP 5’- CGGCTGCTGGCACGGAGTTTTTGCATTATTTGACGTTAGCGACAGAAG ；VIBRI0-BIP 5’- GAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCTTTTCCGGGCTTTCACATCTGACTTAAC ；VIBRI0-F3:5’- CAGTCGTGAGGAAGGTGGTGT ；VIBRI0-B3:5' - CTAGTCTGCCAGTTTCAAATGCT。
5.利用如權(quán)利要求廣4中任意一種檢測(cè)試劑盒進(jìn)行海水養(yǎng)殖動(dòng)物致病性弧菌的檢測(cè)方法，包括下列步驟(1 )、 取待測(cè)樣品組織0 . 2 g置于離心管 I中，加入0.5 ml研磨液，用研磨棒充分磨碎至漿狀；(2)、將上述研磨所得的漿狀樣品煮沸(100°C，10 min)后以10000 r/min離心5 min, 取上清液置于離心管II中；(3)、向離心管II內(nèi)加入核酸提取液A管內(nèi)的乙酸鈉溶液混勻，所述乙酸鈉溶液與上清液的體積比為1/10 ；再加入-20°C預(yù)冷的核酸提取液B管內(nèi)的無水乙醇混合，靜置10 min, 以12000 r/min離心5min，棄上清液，保留沉淀物，所述無水乙醇與上清液的體積比為2 1 ；(4)、用核酸提取液C管內(nèi)的乙醇溶液洗滌上述步驟(3)所得的沉淀物，然后以12000 r/min離心5 min，棄上清液，保留沉淀物；(5)、用核酸提取液C管內(nèi)的乙醇溶液洗滌上述步驟(4)所得的沉淀物，然后以12000 r/min離心5 min，棄上清液，保留沉淀物；(6)、將上述步驟(5)所得的沉淀物于室溫晾干，加入20μ TE緩沖液溶解沉淀物，得到樣品核酸；(7)、分別將上述樣品核酸、陰性對(duì)照管內(nèi)的雙蒸水、陽性對(duì)照核酸管內(nèi)的陽性對(duì)照核酸2 μ 1，加至21 μ 1 LAMP反應(yīng)液中，再加入1 μ 1 UNG酶，分別得檢測(cè)管、陰性對(duì)照管和陽性對(duì)照管；對(duì)上述檢測(cè)管、陰性對(duì)照管和陽性對(duì)照管均于37°C保溫10 min進(jìn)行酶解；(8)、將上述檢測(cè)管、陰性對(duì)照管和陽性對(duì)照管酶解后的反應(yīng)體系分別進(jìn)行如下操作 先于95°C保溫5 min，然后再迅速置于碎冰塊中5 min ；(9)、向步驟(8)所得的檢測(cè)管、陰性對(duì)照管和陽性對(duì)照管的反應(yīng)體系中再分別加入 1 μ 1 Bst DNA 聚合酶；(10)、將上述步驟(9)所得的檢測(cè)管、陰性對(duì)照管和陽性對(duì)照管分別進(jìn)行如下操作先于64 °C保溫45 min，然后于90 °C保溫2 min完成LAMP反應(yīng)；(11)、LAMP反應(yīng)結(jié)束后，加入1μ1核酸染料STOR Green I，如果檢測(cè)管內(nèi)LAMP反應(yīng)產(chǎn)物的顏色與陰性對(duì)照管反應(yīng)產(chǎn)物的顏色均呈橙色，則待測(cè)品致病性弧菌檢測(cè)結(jié)果為陰性； 如果檢測(cè)管內(nèi)LAMP反應(yīng)產(chǎn)物的顏色同陽性對(duì)照管反應(yīng)產(chǎn)物的顏色均呈綠色，則待測(cè)品致病性弧菌檢測(cè)結(jié)果為陽性。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種海水養(yǎng)殖動(dòng)物致病性弧菌核酸等溫?cái)U(kuò)增通用檢測(cè)試劑盒，包括內(nèi)裝研磨液的研磨液管、內(nèi)裝乙酸鈉溶液的核酸提取液A管、內(nèi)裝無水乙醇的核酸提取液B管、內(nèi)裝質(zhì)量濃度70%的乙醇溶液的核酸提取液C管、內(nèi)裝TE緩沖液的TE緩沖液管、內(nèi)裝尿嘧啶DNA糖基化酶的UNG酶管、內(nèi)裝LAMP反應(yīng)液的LAMP反應(yīng)液管、內(nèi)裝BstDNA聚合酶的BstDNA聚合酶管、內(nèi)裝核酸染料SYBRGreenI的顯色劑管、內(nèi)裝弧菌陽性DNA的陽性對(duì)照核酸管、內(nèi)裝滅菌的雙蒸水的陰性對(duì)照管。本發(fā)明還同時(shí)公開了利用上述檢測(cè)試劑盒進(jìn)行海水養(yǎng)殖動(dòng)物致病性弧菌的檢測(cè)方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102154469SQ20111000804
公開日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2011年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月14日
發(fā)明者何琳, 徐海圣 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)