專利名稱：使用腸桿菌科細(xì)菌生產(chǎn)l-氨基酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物產(chǎn)業(yè)，特別涉及使用腸桿菌科的細(xì)菌生產(chǎn)L-氨基酸方法，所述細(xì)菌具有來源于屬于泛菌屬(Pantoea)的細(xì)菌的蛋白質(zhì)，且所述蛋白質(zhì)能夠賦予對半胱氨酸的抗性。
背景技術(shù)：
常規(guī)上，L-氨基酸是通過利用從天然來源獲得的微生物菌株，或其突變體的發(fā)酵方法進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)的。通常，對所述微生物進(jìn)行修飾以提高L-氨基酸的產(chǎn)量。已經(jīng)報道了許多提高L-氨基酸產(chǎn)量的技術(shù)，包括用重組DNA轉(zhuǎn)化微生物(美國專利號4，278，765)。其它提高產(chǎn)量的技術(shù)包括增加參與氨基酸生物合成的酶的活性和/ 或使所述目標(biāo)酶對由所得的L-氨基酸導(dǎo)致的反饋抑制脫敏(desensitize)(美國專利號 4，346，170,5, 661，012 和 6，040，160)。公開了一種新的微生物菌株，其適于發(fā)酵生產(chǎn)L-半胱氨酸、L-胱氨酸、N-乙?；?絲氨酸(其是從0-乙?；?L-絲氨酸通過非酶法轉(zhuǎn)化生產(chǎn)的)，和/或噻唑烷 (thiazolidine)衍生物。該新菌株過表達(dá)至少一種編碼介導(dǎo)抗生素或其它對所述微生物有毒的物質(zhì)的細(xì)胞清除的蛋白質(zhì)的基因(EP 0885982)。已經(jīng)在基因庫(gene bank)中鑒定了一種來自大腸桿菌(Escherichia coli)的染色體片段，其能夠在工業(yè)生產(chǎn)菌株中增加半胱氨酸的產(chǎn)量。亞克隆和遺傳分析顯示其原因是編碼299個氨基酸的產(chǎn)物的開放閱讀框，稱為0rf299。在T7聚合酶/啟動子系統(tǒng)中合成了該0rf299，其顯示了膜內(nèi)在蛋白質(zhì)的特性。這些結(jié)果進(jìn)一步表明0RF299編碼負(fù)責(zé)排出半胱氨酸途徑的不同代謝物的輸出泵(export pump) (Dassler Τ.等，Mol. Microbiol.； 36(5) :1101-12^000)。發(fā)現(xiàn)ORF yfiK基因當(dāng)在一種工業(yè)大腸桿菌生產(chǎn)菌株中過表達(dá)時，能夠增加半胱氨酸的生產(chǎn)。yfiK基因產(chǎn)物為膜內(nèi)在蛋白質(zhì)，具有約六個預(yù)測的跨膜螺旋，且其屬于輸出蛋白 (export protein)的IihtB家族。從質(zhì)粒過度產(chǎn)生YfiK導(dǎo)致0-乙?；?L-絲氨酸和半胱氨酸強(qiáng)烈(drastic)并平行(parallel)地分泌到培養(yǎng)基中，但僅當(dāng)所述生物具有對由半胱氨酸導(dǎo)致的反饋抑制不敏感的絲氨酸轉(zhuǎn)乙酰酶時方如此。當(dāng)將過量的0-乙?；?L-絲氨酸添加至培養(yǎng)基中時，在攜帶yfiK的轉(zhuǎn)化體以及在野生型菌株中，這種對于半胱氨酸分泌過程中存在反饋非敏感性絲氨酸轉(zhuǎn)乙酰酶的需要均被消除。AyfiK突變體并不顯示任何表型，且當(dāng)用攜帶ydeD(之前已表征的另一種0-乙?；?L-絲氨酸/半胱氨酸輸出蛋白)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化時，能夠輸出0-乙?；?L-絲氨酸和半胱氨酸。因為ydeD-yfiK雙重突變體顯示相同的表現(xiàn)模式(pattern)，看來YfiK和YdeD獨立地起作用。細(xì)胞需要藉由輸出蛋白的合成來調(diào)節(jié)0-乙酰基-L-絲氨酸內(nèi)部儲備池(internal pool)大小可能與該化合物(當(dāng)外源供應(yīng)時)可抑制生長的事實有關(guān)。ydeD或yfiK的過表達(dá)可減輕該抑制，并增加對0-乙酰基-L-絲氨酸的類似物重氮絲氨酸(azaserine)的抗性(Franke I等，J Bacteriol.； 185(4) :1161-6(2003)) ο
大腸桿菌細(xì)胞色素bd及周質(zhì)(periplasmic)細(xì)胞色素的組裝需要ATP-結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白(cassette transporter) CydDC，其底物未知。對來自野生型和cydD突變體菌株的周質(zhì)的二維SDS-PAGE比較顯示，后者有數(shù)種周質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)合蛋白缺陷，盡管cydD周質(zhì)中并未缺少任一種主要的蛋白質(zhì)。相反，CydDC將氨基酸半胱氨酸從細(xì)胞質(zhì)輸出到周質(zhì)，這可使用反轉(zhuǎn)的膜囊來進(jìn)一步示明這些膜囊將放射性標(biāo)記的半胱氨酸以依賴ATP、不依賴解耦合 (uncoupled)的方式向內(nèi)轉(zhuǎn)運。報道了新的多效cydD表型，包括具有對芐青霉素和二硫蘇糖醇敏感性的表型，和喪失活動力(motility)的表型。這兩種表型均與二硫鍵形成的周質(zhì)缺陷一致。在cydD和野生型菌株中外源半胱氨酸的存在能夠反轉(zhuǎn)(reverse)這些表型，并影響周質(zhì)C-型細(xì)胞色素的水平，但并不恢復(fù)細(xì)胞色素d。與CydDC是半胱氨酸輸出蛋白相一致，cydD突變體生長對高半胱氨酸濃度高度敏感，并產(chǎn)生更高的細(xì)胞質(zhì)半胱氨酸水平，一種0RM99(其編碼主要易化蛋白超家族(major facilitator superfamily)的輸出蛋白) 有缺陷的突變體也是如此。cydD 0RM99雙重突變體對于半胱氨酸極其敏感，并具有更高的細(xì)胞質(zhì)半胱氨酸水平，而CydDC過表達(dá)賦予對高胞外半胱氨酸濃度的抗性。很可能CydDC負(fù)責(zé)半胱氨酸的輸出，半胱氨酸的輸出對于周質(zhì)中的氧化還原的穩(wěn)態(tài)是至關(guān)重要的(Pittman M. S.等，J Biol Chem. ；277 (51) :49841-9 (2002)) 除了 YdeD和YfiK(它們先前已作為大腸桿菌中的L-半胱氨酸輸出蛋白被報道) 之外，分析了大腸桿菌中33個推定的藥物轉(zhuǎn)運蛋白基因?qū)-半胱氨酸輸出和過度產(chǎn)生的作用。acrD、acrEF、bcr、cusA、emrAB、emrKY、yb_]TZ 和 yojIH 的過表達(dá)反轉(zhuǎn)了 L-半胱氨酸對tnaA被破壞的大腸桿菌細(xì)胞的生長抑制。tnaA基因是主要的半胱氨酸脫巰基酶基因。 發(fā)現(xiàn)這八個基因的過表達(dá)可減少在L-半胱氨酸的存在下培養(yǎng)之后的胞內(nèi)L-半胱氨酸水平。氨基酸轉(zhuǎn)運測定顯示Bcr過表達(dá)，其賦予對雙環(huán)霉素和四環(huán)素的抗性，尤其促進(jìn)了由質(zhì)子梯度產(chǎn)生的能量所驅(qū)動的L-半胱氨酸輸出。當(dāng)用攜帶bcr基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化tnaA被破壞的、表達(dá)被改變的cysE基因的大腸桿菌菌株時，轉(zhuǎn)化體與僅攜帶所述載體的細(xì)胞相比產(chǎn)生更多的L-半胱氨酸。報道基因測定表明所述bcr基因以顯著的水平組成性表達(dá)。這些結(jié)果表明主要易化蛋白家族中的多種藥物轉(zhuǎn)運蛋白Bcr參與遺傳工程改造的大腸桿菌細(xì)胞中L-半胱氨酸的輸出和過度產(chǎn)生(Yamada S.等，Appl Environ Microbiol. ；72 (7) 4735-42(2006))ο然而目前，并無使用具有如下蛋白質(zhì)的細(xì)菌以供生產(chǎn)L-氨基酸的目的的報道所述蛋白質(zhì)來源于屬于泛菌屬的細(xì)菌、且能夠賦予針對由細(xì)菌中的L-半胱氨酸導(dǎo)致的生長抑制的抗性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開的主題的方面可包括提高L-氨基酸生產(chǎn)菌株的生產(chǎn)能力，并提供使用這些菌株生產(chǎn)非芳族或芳族L-氨基酸的方法。通過發(fā)現(xiàn)賦予細(xì)菌對由L-半胱氨酸導(dǎo)致的生長抑制的抗性的蛋白質(zhì)活性可導(dǎo)致 L-氨基酸(如L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-半胱氨酸、L-甲硫氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、 L-纈氨酸、L-組氨酸、甘氨酸、L-絲氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸)的產(chǎn)量提高而實現(xiàn)了上述方面。
本發(fā)明提供了腸桿菌科的細(xì)菌，其具有增加的生產(chǎn)氨基酸(如L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-半胱氨酸、L-甲硫氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-纈氨酸、L-組氨酸、甘氨酸、L-絲氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸)的能力。本發(fā)明的一個方面是提供生產(chǎn)L-氨基酸的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)腸桿菌科的細(xì)菌，并從所述培養(yǎng)基收集所述L-氨基酸，其中所述細(xì)菌能夠生產(chǎn)L-氨基酸，且經(jīng)修飾而增加了能夠賦予細(xì)菌對由L-半胱氨酸導(dǎo)致的生長抑制的抗性的蛋白質(zhì)的活性，其中所述蛋白質(zhì)選自下組(A)SEQ ID NO 2的蛋白質(zhì)或其變體，和(B)SEQ ID NO 4的蛋白質(zhì)或其變體。本發(fā)明另一個方面是提供如上所述的方法，其中在所述細(xì)菌中編碼所述蛋白質(zhì)的 DNA表達(dá)增強(qiáng)。本發(fā)明的另一個方面是提供如上所述的方法，其中所述細(xì)菌用編碼所述蛋白質(zhì)的 DNA轉(zhuǎn)化。本發(fā)明另一個方面是提供如上所述的方法，其中所述DNA選自cOOll和d0663基因。本發(fā)明另一個方面是提供如上所述的方法，其中所述細(xì)菌經(jīng)修飾以至少增加了蛋白質(zhì)(B)或其變體的活性，并進(jìn)一步經(jīng)修飾以增加編碼SEQ ID NO :6的蛋白質(zhì)或其變體的 DNA的表達(dá)。本發(fā)明另一個方面是提供如上所述的方法，其中所述DNA是C09478基因。本發(fā)明另一個方面是提供如上所述的方法，其中所述細(xì)菌屬于埃希氏菌屬 (Escherichia)0本發(fā)明另一個方面是提供如上所述的方法，其中所述細(xì)菌屬于泛菌屬。本發(fā)明另一個方面是提供如上所述的方法，其中所述細(xì)菌是大腸桿菌。本發(fā)明另一個方面是提供如上所述的方法，其中所述細(xì)菌是Pantoea ananatis。本發(fā)明另一個方面是提供如上所述的方法，其中所述L-氨基酸選自芳族L-氨基酸和非芳族L-氨基酸。本發(fā)明另一個方面是提供如上所述的方法，其中所述芳族L-氨基酸選自L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸。本發(fā)明另一個方面是提供如上所述的方法，其中所述非芳族L-氨基酸選L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-半胱氨酸和L-半胱氨酸衍生物、L-甲硫氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、 L-纈氨酸、L-組氨酸、甘氨酸、L-絲氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-精氨酸和0-乙?；?L-絲氨酸。本發(fā)明另一個方面是提供如上所述的方法，其中所述L-氨基酸選自下組L_半胱氨酸、L-纈氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-蘇氨酸、L-谷氨酸、L-甘氨酸、L-丙氨酸、 L-組氨酸和0-乙?；?L-絲氨酸。本發(fā)明如下詳細(xì)描述。附圖簡述

圖1顯示攜帶質(zhì)粒pSTV-cOOllPF和pSTV-PA36ccd的菌株在含有半胱氨酸的培養(yǎng)基中的生長曲線。
具體實施例方式1.細(xì)菌所述細(xì)菌可為腸桿菌科的L-氨基酸生產(chǎn)菌，其中所述細(xì)菌具有來源于屬于泛菌屬的細(xì)菌的蛋白質(zhì)，且所述蛋白質(zhì)能夠賦予對由L-半胱氨酸導(dǎo)致的生長抑制的抗性。短語“L-氨基酸生產(chǎn)菌”可意指當(dāng)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，具有生產(chǎn)L-氨基酸并將 L-氨基酸排入該培養(yǎng)基中的能力的細(xì)菌。短語“L-氨基酸生產(chǎn)菌”還可意指能夠生產(chǎn)L-氨基酸，并導(dǎo)致L-氨基酸在培養(yǎng)基中以大于野生型或親本大腸桿菌菌株(如大腸桿菌K-12)的量積累的細(xì)菌，優(yōu)選可意指所述微生物能夠?qū)е履繕?biāo)L-氨基酸在培養(yǎng)基中的積累量不少于0. 5g/L，并在另一個實施方案中不少于1. Og/L。術(shù)語“L-氨基酸”可包括L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、 L-賴氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-纈氨酸和0-乙酰基L-絲氨酸。術(shù)語“芳族L-氨基酸”可包括L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸。術(shù)語“非芳族L-氨基酸”可包括L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-半胱氨酸和半胱氨酸衍生物、L-甲硫氨酸、 L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-纈氨酸、L-組氨酸、甘氨酸、L-絲氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、 L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-精氨酸和0-乙?；鵏-絲氨酸。其它實施方案是L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-半胱氨酸、L-亮氨酸、L-組氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-脯氨酸、L-精氨酸和0-乙酰基L-絲氨酸。—些由細(xì)菌生產(chǎn)的L-半胱氨酸可在培養(yǎng)基中通過形成二硫鍵而變?yōu)長-胱氨酸。培養(yǎng)基中存在的L-半胱氨酸和硫代硫酸反應(yīng)可生成S-磺基半胱氨酸(kczepkowski Τ. W. ,Nature, vol. 182(1958))。當(dāng)培養(yǎng)基中生產(chǎn)S-磺基半胱氨酸時，可通過用還原劑(如二硫蘇糖醇)還原來將其轉(zhuǎn)化為L-半胱氨酸。此外，在所述細(xì)菌細(xì)胞中生成的L-半胱氨酸可與同樣存在于所述細(xì)胞中的酮、醛，或(例如)丙酮酸縮合，以通過中間產(chǎn)物半縮硫酮 (hemithioketal)生產(chǎn)噻唑烷衍生物(參見日本專利號四92010)。所述噻唑烷衍生物和半縮硫酮可作為平衡的混合物存在。當(dāng)在培養(yǎng)基中生產(chǎn)了 L-半胱氨酸的噻唑烷衍生物時，可通過下述方法生產(chǎn)L-半胱氨酸從培養(yǎng)基收集所述噻唑烷衍生物以打破噻唑烷衍生物與 L-半胱氨酸之間的反應(yīng)平衡，從而使得L-半胱氨酸過量產(chǎn)生。因此，所述L-半胱氨酸生產(chǎn)能力并不僅限于在培養(yǎng)基或細(xì)胞中積累L-半胱氨酸的能力，還包括在培養(yǎng)基中積累L-胱氨酸或其衍生物如S-磺基胱氨酸、噻唑烷衍生物、半縮硫酮或其混合物的能力。一些L-半胱氨酸衍生物，如Y-谷氨酰半胱氨酸、谷胱甘肽、胱硫醚、高半胱氨酸、 甲硫氨酸和S-腺苷甲硫氨酸，可從作為重要起始材料的半胱氨酸來生物合成。所述L-半胱氨酸衍生物還可包括甲基半胱氨酸、乙基半胱氨酸、羰基半胱氨酸(carbocysteine)、磺基半胱氨酸(sulfocysteine)、乙酰基半胱氨酸(acetylcysteine)等。如上所述獲得的L-半胱氨酸可用于產(chǎn)生這些L-半胱氨酸衍生物。這些化合物的發(fā)酵生產(chǎn)可通過使用相應(yīng)的生產(chǎn)微生物作為宿主菌株，結(jié)合過量產(chǎn)生半胱氨酸的能力來實現(xiàn)。因此，所述L-半胱氨酸生產(chǎn)能力包括上述化合物，如Y-谷氨酰半胱氨酸、谷胱甘肽、胱硫醚、高半胱氨酸、甲硫氨酸和S-腺苷甲硫氨酸，這些化合物產(chǎn)生半胱氨酸作為重要的中間產(chǎn)物。為了賦予生產(chǎn)由半胱氨酸生物合成的化合物(如Y-谷氨酰半胱氨酸、谷胱甘肽、 胱硫醚、高半胱氨酸、甲硫氨酸和S-腺苷甲硫氨酸)的能力，可使用在培育棒狀桿菌型細(xì)菌或埃希氏菌屬細(xì)菌中常規(guī)使用的方法(參見“Amino Acid Fermentation",Gakkai Shuppan Center (Ltd.)，第一版，1986年5月30日出版，pp. 77-100)。上述方法包括生產(chǎn)具有營養(yǎng)缺陷性突變體、類似物抗性菌株、或代謝調(diào)節(jié)突變體的特性的微生物，或構(gòu)建重組菌株使得其過表達(dá)相應(yīng)的生物合成酶。減少催化從主途徑分支的反應(yīng)和/或參與降解相應(yīng)的化合物或其中間產(chǎn)物的酶的活性，也可有效地增加所述產(chǎn)物。在此，在每種生產(chǎn)細(xì)菌的培育中，可賦予上述特性中的一種或多種。相應(yīng)的生物合成酶的表達(dá)可單獨增強(qiáng)或以兩種或更多種的組合增強(qiáng)。而且，賦予特性(如營養(yǎng)缺陷性突變、類似物抗性或代謝調(diào)節(jié)突變)可與增強(qiáng)生物合成酶的方法相組合。短語“具有對由L-半胱氨酸導(dǎo)致的生長抑制抗性的細(xì)菌”可意指這樣的細(xì)菌，其來源于作為親本菌株的細(xì)菌菌株，且具有使其能夠在含有L-半胱氨酸的培養(yǎng)基中生長的遺傳特性?？墒褂霉腆w培養(yǎng)基。在含有L-半胱氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，對由L-半胱氨酸導(dǎo)致的生長抑制有抗性的細(xì)菌與親本菌株相比，顯示更有利(favorable)生長。例如，可在34°C在具有含50 μ M或更多(或在另一個實例中，200 μ Μ) L-半胱氨酸的Μ9基本培養(yǎng)基的板上培養(yǎng)20小時內(nèi)形成菌落的細(xì)菌，可對L-半胱氨酸有抗性。攜帶上述基因的菌株在含有50 μ Μ(或在另一個實例中，200 μ Μ) L_半胱氨酸的培養(yǎng)基中與對照菌株相比較可更快地生長，表明該基因或基因位點(gene locus)可賦予半胱氨酸抗性。腸桿菌科包括屬于埃希氏菌屬、腸桿菌屬(Enterobacter)、歐文氏菌屬(E rwinia) > K^M (Klebsiella)(Pantoea) ^jtff ^M (Photorhab-dus) ^ 1 羅威登斯菌屬(Providencia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、沙雷氏菌屬Gerratia)、志賀氏菌屬(Shigella)、摩根氏菌屬(Morganella)、耶爾森氏菌屬(Ye rsinia)等。具體而言，可使用那些根據(jù) NCBI (National Center for Biotechno logy ^formation)數(shù)據(jù)庫 (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/Taxonomy/Browser/ww wtax. cgi ？ id = 91347)使用的分類法歸類為腸桿菌科的那些。短語“屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌”可意指所述細(xì)菌根據(jù)微生物學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員所知的分類法歸類于埃希氏菌屬。屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌的實例包括但不僅限于大腸桿菌 (E. coli) ο埃希氏菌屬所屬的細(xì)菌并無特別限制，但例如，可使用由Neidhardt， F. C.等(Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D. C.，1208，表 1)描述的細(xì)菌。短語“屬于泛菌屬的細(xì)菌”可意指所述細(xì)菌根據(jù)微生物學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員所知的分類法歸類于泛菌屬。最近，一些成團(tuán)腸桿菌(Enterobacter agglomerans)的菌種基于對 16S rRNA的核苷酸序列分析等被重新歸類為成團(tuán)泛菌(Pantoea agglomerans)或Pantoea ananatis> Jff 1 lif (Pantoea stewartii)等(International Journal of SystematicBacteriology, July 1989，39 (3). p. 337-345)。而且，一些屬于歐文氏菌屬的細(xì)菌被 S Τ β ^ Pantoea ananatis KS lif (International Journal of Systematic Bacteriology, Jan. 1993，43 (1)，pp. 162-173)。通常的泛菌屬細(xì)菌的菌株包括但不僅限于， Pantoea ananatis、斯氏泛菌、成團(tuán)泛菌和檸檬泛菌(Pantoea citrea)。具體實例包括下述菌株P(guān)antoea ananatis AJ13355(FERM BP-6614，歐洲專利
發(fā)明者?？ㄌ乩锛{·A·薩夫拉索娃, 宅見和浩, 山崎俊介, 納塔利亞·V·斯托伊諾娃, 野中源 申請人:味之素株式會社