專利名稱:一種HIV-1 CRF07BC gp41多肽疫苗設(shè)計(jì)及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及到分子生物學(xué),氨基酸點(diǎn)突變、結(jié)構(gòu)生物學(xué)和蛋白質(zhì)表達(dá)純化等技木,特別是HIV gp41第559、560和563位點(diǎn)的突變。
背景技術(shù):
艾滋病(acquired immunodeficiency syndrome,簡稱 AIDS)是由人類免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiency virus,簡稱HIV)感染所導(dǎo)致的ー種病死率極高的慢性傳染病,正在全球肆虐。全球艾滋病病毒感染者人數(shù)已經(jīng)達(dá)到3330萬,死亡2500萬,2009年新增艾滋病病毒感染者500萬,其中成人達(dá)到430萬,320萬人因艾滋病死亡。目前艾滋病的治療和預(yù)防并沒有非常有效的措施,治療主要集中在抗病毒治療而預(yù)防則主要是宣傳教育和切斷HIV傳播途徑。目前臨床上所用的抗病毒藥物主要包括逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、蛋白酶抑制劑、HIV進(jìn)入/融合抑制劑、整合酶抑制劑等等,雖然高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(highly active anti-retroviraltherapy,HARRT)在臨床上取得了很好的效果,但是抗病毒藥物的使用引起了 HIV基因的突變,進(jìn)而產(chǎn)生抗藥性和耐藥性,遠(yuǎn)期治療效果并不是很肯定;并且由于艾滋病感染人數(shù)巨大,且大都集中在發(fā)展中國家,多數(shù)AIDS患者支付不起昂貴的抗病毒藥物治療,因此抗病毒治療并不能有效地控制AIDS的傳播。切斷HIV傳播的途徑雖然對(duì)預(yù)防HIV感染有重大意義,但是不能從根本上解決艾滋病的致病性問題。由于疫苗在疾病的預(yù)防和治療中發(fā)揮了重要的作用,因此自AIDS發(fā)現(xiàn)之日起,人們就一直嘗試研制ー種艾滋病疫苗來控制和預(yù)防HIV感染,如滅活疫苗、減毒活疫苗、病毒顆粒樣(VLP)疫苗、重組亞單位疫苗、重組活載體疫苗、DNA疫苗等。目前已有近40種HIV疫苗進(jìn)入臨床試驗(yàn)但是均未達(dá)到預(yù)期的效果。分析這些疫苗失敗的主要原因是HIV高度遺傳變異性所致,因此以HIV 為靶標(biāo)的疫苗設(shè)計(jì)和研制目前仍在困境之中。隨著對(duì)HIV感染機(jī)制研究的深入,HIV包膜蛋白gp41為新型抗病毒藥物和HIV疫苗的研制提供了新的靶點(diǎn)。Gp41是HIV —個(gè)重要的包膜蛋白,gp41平時(shí)鑲嵌在包膜內(nèi),當(dāng)gpl20與⑶4分子結(jié)合吋,gpl20發(fā)生構(gòu)象變化,暴露出HIV輔助受體的結(jié)合位點(diǎn),在與輔助受體結(jié)合后,gp41介導(dǎo)HIV與CD4的細(xì)胞融合,從而使HIV感染核心進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。Gp41參與HIV與細(xì)胞膜融合的過程,是早期HIV進(jìn)入細(xì)胞所需要的重要分子之一。因此,近年來以gp41為靶點(diǎn)的抗HIV策略越來越受到重視,其中包括gp41拮抗劑、gp41單克隆抗體、RNAi干渉、gp41自體疫苗等。Gp41抗體穩(wěn)定而持久, 對(duì)HIV的診斷和治療有重要意義。因此,尋找和設(shè)計(jì)高效的gp41免疫原成為研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。其中,以gp41三級(jí)結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的免疫原為設(shè)計(jì)和研制新型AIDS疫苗提供了一條新的思路。gp41分子和HIV感染的關(guān)系1抗HIV感染新的靶點(diǎn)_gp411. Igp41 的功能HIV gp41是HIV的跨膜糖蛋白,其功能為介導(dǎo)HIV包膜與靶細(xì)胞膜的融合,在病毒進(jìn)入靶細(xì)胞的早期階段發(fā)揮關(guān)鍵的作用。因此,HIV gp41可以作為開發(fā)抗HIV藥物的一個(gè)新靶點(diǎn)。Gp41的胞外區(qū)存在N-末端重復(fù)序列(NHR)和C-末端重復(fù)序列(CHR),他們相互作用能形成六螺旋束結(jié)構(gòu),將HIV包膜與靶細(xì)胞膜拉近,介導(dǎo)兩者的融合,最終實(shí)現(xiàn)HIV的感染過程。1. 2HIV gp41 的結(jié)構(gòu)Gp41為HIV包膜蛋白的跨膜亞基,其包膜外區(qū)含有三個(gè)功能區(qū)(1).位于gp41 N 末端的融合多肽;(2).位于融合多肽下游的N-末端重復(fù)序列(NHR) ; (3).位于gp41包膜外區(qū)C-末端的重復(fù)序列(Offi)。NHR和CHR含有能形成螺旋結(jié)構(gòu)的疏水氨基酸序列,他們是gp41形成多聚體及介導(dǎo)膜融合的功能性結(jié)構(gòu)。HIV gp41的X-射線衍射分析表明,其核心結(jié)構(gòu)為六股α -螺旋束,其中三個(gè)NHR組成的N-螺旋相互作用,形成位于中心的螺旋三聚體,而三個(gè)CHR組成的C-螺旋以反向平行的方式結(jié)合在由三個(gè)N-螺旋形成的溝槽中, 該溝槽中含有由疏水殘基構(gòu)成的深穴。HIV gp41亞基核心結(jié)構(gòu)中的這一“深穴”被認(rèn)為是研究阻斷HIV與靶細(xì)胞融合藥物作用的新靶點(diǎn)。目前申請(qǐng)人課題組已經(jīng)成功解析了 HIV CRF07BC(中國境內(nèi)流行的HIV亞型)gp41的晶體結(jié)構(gòu)(附圖1)。1. 3 EIAV gp45 的結(jié)構(gòu)(Equine infectious anemia virus, EIAV) % HIV
屬,是感染馬類的免疫缺陷病毒,可以作為研究HIV的模式病毒。在上世紀(jì)70年代,通過沈榮顯院士及其團(tuán)隊(duì)的艱苦努力,EIAV的疫苗已經(jīng)研制成功,并成功應(yīng)用到EIAV的防治中。 這項(xiàng)巨大的成就為人類研制艾滋病疫苗提供了基礎(chǔ)。申請(qǐng)人:課題組在世界上第一次解析了 EIAV病毒株(野生株)和疫苗株gp45(相應(yīng)于HIV的gp41)的晶體結(jié)構(gòu)(附圖2),通過比較二者的不同,我們找到了一些在疫苗株中存在的特異的突變位點(diǎn),這些位點(diǎn)構(gòu)成了疫苗株病毒能夠引起宿主免疫反應(yīng),但是又不致病的結(jié)構(gòu)機(jī)理。通過對(duì)這些結(jié)構(gòu)的比較和分析,我們設(shè)計(jì)了 HIV CRF07BC gp41的免疫原多肽,希望將此多肽應(yīng)用于抗艾滋病的疫苗設(shè)計(jì)中。EIAV gp45的晶體結(jié)構(gòu)整體上與HIV gp41相似,也是有六股α -螺旋構(gòu)成。由于這兩種病毒同屬慢病毒屬,這種結(jié)構(gòu)上的相似在意料之中,這也為我們將EIAV gp45疫苗株的結(jié)構(gòu)信息應(yīng)用到HIV gp41的設(shè)計(jì)上提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。2以HIV gp41為靶點(diǎn)的抗HIV藥物研究進(jìn)展越來越多的研究表明,gpl20的變異性很大,作為HIV疫苗和藥物作用的靶點(diǎn)有較大的局限性。Gp41序列比gpl20更為保守,并且與人體自身蛋白沒有同源性,是病毒特有蛋白。因此,gp41被認(rèn)為是更適合作為研究抑制HIV與靶細(xì)胞融合的藥物作用靶點(diǎn)。2.1多肽類融合抑制劑以Roche制藥公司開發(fā)的T_20作為HIV與靶細(xì)胞融合過程的第三類抗艾滋病藥物,即HIV進(jìn)入抑制劑。Τ-20単獨(dú)或與其他抗HIV藥物合用,療效均非常顯著,對(duì)那些已對(duì)現(xiàn)有抗HIV藥物出現(xiàn)耐藥反應(yīng)的患者也有良好療效,且無明顯毒副作用。Τ-20在HIV進(jìn)入抑制劑中最先研制成功也表明gp41作為抗艾滋病藥物的作用靶點(diǎn)具有明顯的優(yōu)越性和合理性?!?-helix”蛋白具有很好的溶解性,也不發(fā)生聚集,能與gp41的CHR區(qū)結(jié)合并具有很強(qiáng)的抑制HIV與靶細(xì)胞融合和HIV復(fù)制的活性,證明CHR區(qū)也是抗HIV藥物開發(fā)的ー個(gè)重要靶位?!?-helix”可通過基因工程手段大量獲得,作為藥物進(jìn)行開發(fā),也可望用于艾滋病基因治療和疫苗開發(fā)。但是,上述的T-20和5-Helix等均為多肽類或蛋白類抗HIV,藥物,分子量大,容易被內(nèi)源性蛋白酶降解,不能ロ服,而且用量大(T-20毎日注射劑量200mg),合成的成本高, 藥品價(jià)格高昂O0000美元/病人/年)。另外,肽類還可能導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生抗體,降低藥物療效,誘發(fā)免疫復(fù)合物反應(yīng)。因此,人們希望找到作用HIVgp41的一些非肽類的小分子化合物,用于HIV感染和艾滋病的治療。2.2小分子融合抑制劑RPR103611和IC9564是由白樺酯酸及其衍生物發(fā)展而來的HIV進(jìn)入抑制劑,抗病毒活性在IOnM量級(jí)。對(duì)這類抑制劑的作用機(jī)理的研究表明,RPR103611和IC9564很可能通過破壞gpl20-gp41復(fù)合物的穩(wěn)定性而發(fā)揮抗病毒作用。除此之外,還有單克隆抗體、基因治療等針對(duì)gp41的治療手段也在嘗試階段。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在干,設(shè)計(jì)和表達(dá)了ー種來自HIV-I gp41的突變體的自體多肽疫苗,其特征在干,參考EIAV疫苗株的序列,對(duì)野生株HIV-I CRF07BC gp41的三個(gè)關(guān)鍵氨基酸進(jìn)行突變,突變位點(diǎn)為A559S,I560M,Q563T,得到了針對(duì)HIV gp41的多肽疫苗,所述的免疫多肽的氨基酸序列如下SGIVQQQNNLLRSMEATQHLLQLTVWGIKQLQARVLGGSGGWMQWEKEIDNYTGLIYRLIEESQTQQEK NEQDLL。為了實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是運(yùn)用結(jié)構(gòu)生物學(xué)方法,比較 EIAV野生株和疫苗株gp45 —級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的不同,找到了影響毒株差異的三個(gè)重要的氨基酸,分別是A559、1560和Q563,然后通過比較HIV野生株gp41與EIAV野生株gp45 的序列和結(jié)構(gòu),分析他們之間的同源性,通過點(diǎn)突變的方法得到類似EIAV疫苗株gp45的 HIV gp41,用于誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)gp41的抗體。上述gp41自體多肽疫苗的制備方法,其特征在干,根據(jù)gp41的結(jié)構(gòu)應(yīng)用 linker (GGSGG)將NHR和CHR連接起來,運(yùn)用overlap PCR獲得了此表達(dá)序列,并克隆入 PET30原核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌,在大腸桿菌中高效表達(dá),經(jīng)過Ni-NTA親和層折、離子交換層析和分子篩層析等純化,即可獲得純化的目的蛋白gp41疫苗多肽,理論上該疫苗可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性的抗HIV抗體。
圖1是HIV-I CRF07BC gp41的三維結(jié)構(gòu)圖。 圖2是EIAV gp45的三維結(jié)構(gòu)圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例HIV-1 CRF07BC gp41多肽疫苗的表達(dá)和純化步驟一、Gp41表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建運(yùn)用PCR點(diǎn)突變的方法將野生株HIV gp41突變?yōu)樾枰膅p41模板,突變位點(diǎn)為 A559S、I560M和Q563T。然后截取NHR和CHR氨基酸序列,應(yīng)用柔性linker連接,獲得模擬 EIAV疫苗株gp45的HIV gp41。截取的氨基酸序列和linker序列如下
SGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVffGIKQLQARVL 為 NHR 序列;WMQffEKEIDNYTGLIYRLIEESQTQQEKNEQDLL 為 CHR 序列;
GGSGG 為 NHR 和 CHR 之間的 1 inker。其中用到的點(diǎn)突變引物為,上游引物CAGCAGAGCAACCTGCTGAGGTCCATGGAGGCCACGCAGCACCTGCTGCAG下游引物CTGCAGCAGGTGCTGCGTGGCCTCCATGGACCTCAGCAGGTTGCTCTGCTG通過PCR擴(kuò)增的方法獲得突變后的gp41片段,連接到pET30表達(dá)載體中,經(jīng)過酶切和測序鑒定正確后,獲得含有g(shù)p41融合基因的原核表達(dá)載體pET30-gp41。其中用到的擴(kuò)增引物為,上游引物TACTTCCAATCCAATGCCAGCGGCATCGTGCAG下游引物TTATCCACTTCCAATGCTACAGCACCCTGGTCTGCAG步驟ニ、感受態(tài)細(xì)胞的制備BL21種子菌株涂布無抗性LB瓊脂平板,37°C過夜培養(yǎng)后,挑取單菌落到3ml無抗性LB培養(yǎng)基中37°C,200rpm搖菌過夜。按接菌量到50ml LB,37°C搖到OD = 0. 3 0. 4 (Ih左右),轉(zhuǎn)入無菌離心管,4°C 5000rpm 5min,棄上清,倒置使剰余液體流盡。加入 15ml的0. IM CaC12(存放于4°C冰箱中,直接倒,大概15ml即可)輕輕晃動(dòng)管,致使細(xì)胞懸浮,至冰上10 30rnin,5000rpm 4°C 5min回收細(xì)胞(離出的菌體應(yīng)成圓環(huán)狀),棄上清, 在加2ml冰冷的0. IM CaCl2懸浮細(xì)胞,每管IOOul分裝到無菌印pendorf管中,-70°C保存步驟三、表達(dá)質(zhì)粒pET30_gp41的轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)加40ng pET30-gp41質(zhì)粒到IOOul感受態(tài)中,混合均勻,冰浴30min。42°C熱休克 90s,迅速放入冰里(此步最為重要),將管插入冰中,冷卻1 aiiin后,每管加入800ul無抗性LB培養(yǎng)基中。37°C,70rpm/min,培養(yǎng)45min,讓細(xì)菌中的質(zhì)粒表達(dá)抗性蛋白。4000rpm 5min去上清,余下100 200ul,涂布Kan (Kan,卡那霉素)的LB平板。正放平板20 30min, 倒置37°C溫箱中培養(yǎng)12 16h。步驟四、gp41蛋白的表達(dá)純化挑取BL21單菌落于IOml LB培養(yǎng)基(50 μ g/ml Kan)中,37°C振蕩培養(yǎng);將IOmL菌液轉(zhuǎn)移至IL LB培養(yǎng)基(50 μ g/ml Kan)中,37°C 220rpm振蕩培養(yǎng)3_4h,當(dāng)OD6tltl達(dá)0. 8 1.0時(shí),加入0. IM IPTG誘導(dǎo),16°C過夜誘導(dǎo);6000rpm 15min收集菌體,菌體加入用40ml裂解液重懸,用微量移液器或吸管輕吹,確保重懸菌液中無明顯可見的團(tuán)塊。打超聲前才加入溶菌酶至0. lmg/ml ;超聲破碎菌體至菌液變澄清為止。4°C 18000rpm離心40min,上清過鎳柱,上樣完成后,分別用含OmM、20mM、50mM、100mM、200mM、500mM、以及IM咪唑的平衡液進(jìn)行梯度洗脫,收集穿透液,并用SDS-PAGE電泳分析(15%分離膠)。對(duì)含有g(shù)p41的組分濃縮,進(jìn)ー步進(jìn)行離子交換層析和分子篩層析等步驟進(jìn)行純化。步驟五、目的蛋白的鑒定將純化得到的gp41蛋白跑15%的SDS-PAGE膠,每孔2ug gp41 (根據(jù)純化的gp41 的量進(jìn)行調(diào)節(jié))。在預(yù)冷的轉(zhuǎn)移緩沖液05mM Tris,200mM Glycine,20%甲醇)中,100V 穩(wěn)壓電泳70min,將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。在5%的脫脂奶粉中封閉45min。用小鼠抗人 gp41 單克隆抗體(1 1000 稀釋)孵育 PVDF 膜,室溫 1. 5h,TBST (20mM Tris, 150mM NaCl, pH8. 0,0. 05% Tween20)洗膜3次,再以HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體(1 10000稀釋)孵育PVDF膜,室溫45min,TBST洗膜3次。加入HRP發(fā)光底物曝光。Western blotting結(jié)果顯示,表達(dá)純化得到的蛋白確實(shí)為突變后的gp41。
權(quán)利要求
1.一種來自Hiv-I gp41的突變體的自體多肽疫苗,其特征在干,參考EIAV疫苗株的序列,對(duì)野生株HIV-I CRF07BC gp41的三個(gè)關(guān)鍵氨基酸進(jìn)行突變,突變位點(diǎn)為A559S,I560M, Q563T,得到了針對(duì)HIV gp41的多肽疫苗,所述的免疫多肽的氨基酸序列如下SGIVQQQNNLLRSMEA1QHLLQLTVWGIKQLQARVLGGSGGWMQWEKEIDNYTGLIYRLIEESQTQQEKNEQDLL。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的gp41多肽疫苗的制備方法,其特征在于,應(yīng)用點(diǎn)突變和 overlapPCR等技術(shù)獲得多肽疫苗表達(dá)序列,并克隆入pET30原核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌, 在大腸桿菌中獲得高效的可溶性表達(dá),經(jīng)過M-NTA親和層折、離子交換層析和分子篩層析獲得了高純度的gp41蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的三個(gè)突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)方法,其特征為基于申請(qǐng)人自己解析的高分辨率的晶體結(jié)構(gòu)而設(shè)計(jì),具體為A559S,I560M, Q563T。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的三個(gè)突變位點(diǎn)A559,1560,Q563,其特征為HIVgp41的第 559,560,563位氨基酸的突變。并在此基礎(chǔ)上已經(jīng)獲得的其它幾種有效突變,如下A559T, I560S, Q563E ;A559G, I560H, Q563I ;A559H, I560S, Q563C。
全文摘要
本發(fā)明公開了一個(gè)針對(duì)HIV-1 gp41的多肽疫苗設(shè)計(jì)及其制備方法。該多肽疫苗是通過比較EIAV的致病株和疫苗株的gp45在一級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)上的不同,找到兩個(gè)毒株gp45結(jié)構(gòu)上的差異,獲得EIAV疫苗株產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),并通過分析HIV-1 CRF07BC gp41一級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu),在HIV gp41中模擬EIAV在減毒過程中產(chǎn)生的天然突變位點(diǎn),表達(dá)了用來作為HIV gp41免疫原的多肽疫苗。該多肽以HIV gp41為主體,通過突變gp41上的三個(gè)關(guān)鍵位點(diǎn)而得到,三個(gè)突變位點(diǎn)分別為A559S、I560M和Q563T。通過PCR方法得到構(gòu)建好的HIV gp41多肽疫苗表達(dá)序列,克隆入pET30原核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌并高效表達(dá),并經(jīng)過WB免疫印跡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其表達(dá)效果。此設(shè)計(jì)為構(gòu)建新型的gp41多肽疫苗和其它艾滋病疫苗奠定了一定的基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N15/70GK102580078SQ20111002025
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2011年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月18日
發(fā)明者劉新奇, 孫佩龍, 杜建森 申請(qǐng)人:南開大學(xué)