專利名稱：一種用于合成胞二磷膽堿的生物工程方法
技術領域：
本發(fā)明涉及ー種磷酸膽堿胞苷轉(zhuǎn)移酶的制備方法，并通過此酶在體外催化合成胞 ニ磷膽堿，同時實現(xiàn)反應與分離耦合的生物工程方法。該方法可用于胞ニ磷膽堿的大規(guī)模生產(chǎn)制備。
背景技術：
胞ニ磷膽堿又稱胞磷膽堿鈉(cytidine diphosphate choline,簡稱 ⑶P-Choline，⑶P-C)，其分子式為C14H25N4NaO11P2,分子量為510. 31，呈白色晶體狀，并極易溶于水。它是核苷衍生物，是磷脂類磷脂酰膽堿的前體物質(zhì)，為卵磷脂合成的主要前體。胞 ニ磷膽堿改善腦功能的作用可能與促進卵磷脂的生物合成有夫。其藥理作用主要有以下幾個方面①能增強腦干網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上行激活系統(tǒng)的功能，增強錐體系和抑制錐體外系的作用， 促進催醒和抑制募集反應改善腦血管張カ，降低腦血管阻力，增加腦血流量，改善腦血液循環(huán)；③增加腦細胞氧耗，改善腦組織代謝，腦能量代謝等。此外，胞ニ磷膽堿尚有降低高血脂和血小板粘滯度，促進糖代謝和預防黑質(zhì)內(nèi)多巴胺生成障礙的作用。目前制備胞ニ磷膽堿的方法有①化學合成法，以CMP、磷酸膽堿(CP)為底物，用對甲苯磺酰氯為縮合劑，在N-ニ甲基甲酰胺(DMF)環(huán)境中，化學合成胞ニ磷膽堿；②酶促合成，提取細胞液中的磷酸膽堿胞苷轉(zhuǎn)移酶，并利用三磷酸胞苷和磷酸膽堿合成胞ニ磷膽堿。 但抽提酶液收率低、成本高；③游離酵母合成胞ニ磷膽堿，此法需要大量游離酵母，且產(chǎn)物回收率較低，不適合エ業(yè)化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供了一種用于合成胞ニ磷膽堿的生物工程方法，g在解決化學合成和生物提取酶法合成胞ニ磷膽堿的種種缺陷，使得胞ニ磷膽堿的制備過程更易進行，產(chǎn)品的收率更高。為了解決上述問題，本發(fā)明通過以下步驟實現(xiàn)用基因工程方法重組構(gòu)建含有編碼磷酸膽堿胞苷轉(zhuǎn)移酶核苷酸序列的大腸桿菌工程菌株；利用該工程菌株進行大規(guī)模高密度培養(yǎng)，井分離純化得到高活性的磷酸膽堿胞苷轉(zhuǎn)移酶；利用磷酸膽堿胞苷轉(zhuǎn)移酶在合適的條件下進行酶法催化合成，得到胞ニ磷膽堿；更近一歩地在酶法催化合成胞ニ磷膽堿的體系中加入陽離子交換樹脂，使得胞ニ磷膽堿在合成的過程中不斷地被吸附在樹脂上，實現(xiàn)胞ニ磷膽堿反應與分離的耦合。
上述的基因工程菌株已于2010年12月08日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏中心地址北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學院微生物研究所，郵政編碼100101。建議的分類命名為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏號為CGMCC NO: 4428。本發(fā)明采用胞ニ磷膽堿反應與分離耦合的方法，明顯提高了反應和純化過程的可控性，使得本發(fā)明適合ェ業(yè)化生產(chǎn)。
下面結(jié)合具體實施例，進ー步闡述本發(fā)明。


圖I是生物催化合成反應前的圖；圖2是生物催化合成反應后的圖。其中圖I保留時間為17. 952min的峰為CTP ;圖2所示，其中保留時間為7. 150min的峰為胞ニ磷膽堿， 保留時間為18. 049min的峰為CTP，由此可推算出反應的CTP轉(zhuǎn)化率為68%。
具體實施例方式實施例I采用常規(guī)方法提取肺炎鏈球菌樣品RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得肺炎鏈球菌cDNA。以權利說明6中所述引物為引物，采用PCR方法從肺炎鏈球菌cDNA中釣取CCT基因。具體PCR條件為95 °C, 5min ；
權利要求
1.一種用于合成胞ニ磷膽堿的生物工程方法，其特征在于用基因工程方法重組構(gòu)建含有編碼磷酸膽堿胞苷轉(zhuǎn)移酶核苷酸序列的大腸桿菌工程菌株；利用該工程菌株進行大規(guī)模高密度培養(yǎng)，井分離純化，得到高純度、高活性的磷酸膽堿胞苷轉(zhuǎn)移酶；利用磷酸膽堿胞苷轉(zhuǎn)移酶在合適的條件下進行酶法催化合成，得到胞ニ磷膽堿；利用分離與反應耦合的エ藝設計，磷酸膽堿胞苷轉(zhuǎn)移酶在具有離子交換樹脂的條件下進行酶法催化合成，反應獲得的胞ニ磷膽堿被吸附在離子交換樹脂上，并可在反應完成后使用具有一定離子強度的緩沖液將其從樹脂上洗脫下來，實現(xiàn)胞ニ磷膽堿反應與分離的耦ムロ o
2.根據(jù)權利要求I所述的生物工程方法，其特征在干所述大腸桿菌工程菌株是含有編碼磷酸膽堿胞苷轉(zhuǎn)移酶核苷酸序列的工程菌株，該磷酸膽堿胞苷轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列來源于肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae),該基因工程菌株已于2010年12月08日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心， 保藏中心地址北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學院微生物研究所，郵政編碼100101。建議的分類命名為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏號為CGMCC NO :4428。
3.根據(jù)權利要求I所述的生物工程方法，其特征在于所述大腸桿菌工程菌株中包含ー種含有磷酸膽堿胞苷轉(zhuǎn)移酶基因序列的原核表達載體 pET28a-CCT。
4.根據(jù)權利要求3所述的生物工程方法，其特征在干所述的該原核表達載體pET28a-CCT中含有編碼磷酸膽堿胞苷轉(zhuǎn)移酶蛋白的一段基因序列(SEQl)。
5.根據(jù)權利要求4中所述的生物工程方法，其特征在于所述基因序列(SEQl)，其序列信息見說明書。
6.一對引物(primerl and primer2),用于擴增權利要求5中所述基因序列的引物,其序列信息上游引物序列5' -ctGAATTCATATG aaagcca tcatcttag-31 ;下游引物序列5' -GtCGTCGACTCGAG attttcgtttttaagaatttc-3'。
7.根據(jù)權利要求I所述的生物工程方法，其特征在干所述高純度、高活性的磷酸膽堿胞苷轉(zhuǎn)移酶是通過在改良的培養(yǎng)基中對權利要求I和 2中所述的工程菌株進行大規(guī)模高密度培養(yǎng)、井分離和純化得到的。
8.根據(jù)權利要求7所述的生物工程方法，其特征在干所述培養(yǎng)基包括胰蛋白胨5-15g/L、酵母抽提物5-15g/L、K2HPO4 3H2010_30g/L、 NaH2PO4 2H20 5_20g/L、以及消泡劑 0. 05% -0. 2%
9.根據(jù)權利要求7所述的生物工程方法，其特征在于在接種前還在所述培養(yǎng)基中加入卡那霉素至最終濃度20-100mg/L、無菌MgSO4至終濃度0. 5-1. 5g/L、無菌葡萄糖至終濃度2-10g/L，并將pH值調(diào)節(jié)至6. 0-7. O。
10.根據(jù)權利要求7所述的生物工程方法，其特征在于所述高密度培養(yǎng)的方法包括以下步驟在發(fā)酵罐中進行補料分批高密度發(fā)酵，將PH值控制在6.0-7.0、溫度控制在 25 0C _37°C、用于菌體富集的培養(yǎng)時間控制在2-8小吋、IPTG誘導的工作濃度控制在.0.05-lmM，并將誘導時間控制在10-30小時。
11.根據(jù)權利要求I所述的生物工程方法，其特征在于所述酶法催化合成的方法包括以下步驟以磷酸膽堿、三磷酸胞苷(CTP)為原料，添加鎂離子和磷酸膽堿胞苷轉(zhuǎn)移酶，以 Tris-HCl作為緩沖體系，在一定pH值、溫度和時間范圍內(nèi)進行反應，并在反應體系中加入陽離子交換樹脂。
12.根據(jù)權利要求11所述的生物工程方法，其特征在于反應液中CTP濃度控制在 10-50mM,磷酸膽堿濃度控制在ATP濃度的2_5倍，氯化鎂濃度控制在10_50mM，Tris-HCl濃度控制在50-100mM，磷酸膽堿胞苷轉(zhuǎn)移酶的加入量控制在10-200mg/L，陽離子交換樹脂的加入量控制在50-200ml/L，pH值控制在6_8，反應溫度控制在20°C _50°C，反應時間控制在 1-5小時。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于合成胞二磷膽堿的生物工程方法，該方法包括以下步驟用基因工程方法重組構(gòu)建含有磷酸膽堿胞苷轉(zhuǎn)移酶的大腸桿菌工程菌株；利用該工程菌株進行大規(guī)模高密度培養(yǎng)并分離純化，得到高純度、高活性的磷酸膽堿胞苷轉(zhuǎn)移酶；利用磷酸膽堿胞苷轉(zhuǎn)移酶在合適的條件下進行酶法催化合成，得到胞二磷膽堿；在酶法催化合成胞二磷膽堿的體系中加入陽離子交換樹脂，使得胞二磷膽堿在合成的過程中不斷地被吸附在樹脂上，實現(xiàn)胞二磷膽堿反應與分離的耦合。該方法具有底物利用率高、產(chǎn)物回收率高、反應條件溫和、反應時間短、對環(huán)境污染小、成本低等優(yōu)點，適合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號C12N15/11GK102605025SQ201110021049
公開日2012年7月25日 申請日期2011年1月19日 優(yōu)先權日2011年1月19日
發(fā)明者劉桂禎, 王永宏, 王琳, 鄭春楊 申請人:中國科學院生物物理研究所, 開平牽牛生化制藥有限公司