專利名稱：鵝源免疫球蛋白輕鏈Igλ全基因序列及克隆方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種擴(kuò)增鵝免疫球蛋白輕鏈 IgA基因序列及可變區(qū)基因序列的方法。
背景技術(shù)：
隨著基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，抗體及其受體基因的探索，為基因工程抗體技術(shù)抗體制劑的研究和開發(fā)提供依據(jù)和基礎(chǔ)。上世紀(jì)80年代中期出現(xiàn)的PCR技術(shù)，促進(jìn)了基因工程抗體技術(shù)的突破性進(jìn)展。人源化抗體、嵌合抗體、小分子抗體如Fab，Scfv，輕、重鏈抗體等基因工程抗體在生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域發(fā)揮越來(lái)越大的作用。鵝被認(rèn)為是人類所馴化的第一種家禽，有研究者根據(jù)線粒體DNA控制區(qū)序列、細(xì)胞色素b基因等差異比對(duì)證明，中國(guó)東北家鵝來(lái)自于鴻雁，種屬于Animaiia動(dòng)物界，Phylnm Arthropoda 節(jié)肢云力物門，Class Aves 鳥綱，Order Anseriformes 雁形目，F(xiàn)amily Anatidae 鴨科，Genus anser雁屬，Anser cygnoides鴻雁。生物全基因組序列的揭示是一項(xiàng)具有重大意義的工程，但目前物種的全基因序列的禽類除雞的全基因組的測(cè)知外，其它物種的研究并不十分清楚。基因工程抗體制備的關(guān)鍵前提就是獲取抗體可變區(qū)的基因序列。目前， 對(duì)人、鼠、雞(萊航雞)的抗體基因序列研究報(bào)道較多。關(guān)于水禽的基因研究尚少有報(bào)道。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，PCR技術(shù)、RACE克隆策略已被廣泛用于生物克隆領(lǐng)域。目前對(duì)小鼠的抗體基因研究較多。Orlandi最早系統(tǒng)地分析了小鼠抗體可變區(qū) (V區(qū))基因序列，設(shè)計(jì)出正反方向的通用引物，擴(kuò)增出完整的可變區(qū)基因，在真核細(xì)胞中表達(dá)。根據(jù)小鼠輕鏈區(qū)基因5'及3'端相對(duì)保守的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物通過(guò)反轉(zhuǎn)錄來(lái)擴(kuò)增輕鏈的相應(yīng)功能區(qū)。目前，根據(jù)5'端引物配對(duì)的位置不同，擴(kuò)增鼠抗體可變區(qū)基因的簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)主要分兩種一種是利用抗體輕鏈V區(qū)5'端引物與V區(qū)的前導(dǎo)序列互補(bǔ)，輕鏈V區(qū)3'端引物與K鏈Cj'端和輕鏈V區(qū)的所有J段3'段互補(bǔ)；另一種利用與抗體可變區(qū)基因骨架區(qū)FRl和FR4互補(bǔ)的序列。上述第一種引物的簡(jiǎn)并性基本不會(huì)造成產(chǎn)物與原基因序列的差異，但由于前導(dǎo)序列變化較大，引物設(shè)計(jì)難度很高，往往得不到所需的擴(kuò)增產(chǎn)物。而第二種引物因?yàn)槠浜?jiǎn)并性，有可能造成抗體氨基酸的變異或缺失，這種差異可能會(huì)導(dǎo)致構(gòu)建的嵌合抗體的親和力等功能的降低。由于目前抗體基因庫(kù)的資料有限，因此這些比較常見的引物可能還不適用于擴(kuò)增一些特殊單抗的基因。鑒于此，近年來(lái)出現(xiàn)的RACE 技術(shù)即cDNA末端快速擴(kuò)增法具有省時(shí)、靈敏和高效的特點(diǎn)。RACE(rapid amplification cDNAend)。5' RACE是以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，使用Oligo (Td)對(duì)mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后，再用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)給cDNA的5'端進(jìn)行同聚物加尾反應(yīng)，從而在未知的cDNA 的5'端加上一段linker，然后再用基因特異引物和引物經(jīng)PCR擴(kuò)增未知mRNA的5'端。 采用5' RACE的方法可以得抗體的可變區(qū)及信號(hào)肽的真實(shí)序列，繼而保證通過(guò)基因工程改造得到的抗體的功能。由于兼并引物在克隆抗體基因過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)可變區(qū)兩側(cè)的抗體框架結(jié)構(gòu)基因序列的改變，而使之不能確定，甚至?xí)诨虮磉_(dá)時(shí)引起轉(zhuǎn)錄的移位。所以有必要在克隆鵝源免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)基因的基礎(chǔ)上，探索克隆全部輕鏈基因的成熟方法，通過(guò)采用RACE克隆的策略，鵝脾臟淋巴細(xì)胞獲得一條鵝免疫球蛋白輕鏈IgX全基因序列。有報(bào)道，在進(jìn)行抗體可變區(qū)基因的克隆，會(huì)不可避免地使擴(kuò)增出的可變區(qū)的N、C 末端不能完全等同于原序列，某些氨基酸殘基的改變可影響基因工程抗體表達(dá)及其結(jié)合活性。而從前導(dǎo)序列擴(kuò)增雖然能夠得到N端的原序列，由于前導(dǎo)序列變化較大，所以引物設(shè)計(jì)的難度大，往往擴(kuò)增效果不理想。采用RACE克隆策略，引物具有通用性，能得到完全與親本抗體一致的基因序列，會(huì)提高抗體的親和力，有助于抗體的表達(dá)?；蚬こ炭贵w作為一種新型生物制劑在疫病的預(yù)防、診斷和治療方面已顯示出重要的作用。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)操作簡(jiǎn)便、成本低廉、效果優(yōu)異的擴(kuò)增鵝抗體基因序列尤其是抗體可變區(qū)的方法及產(chǎn)品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一條鵝免疫球蛋白輕鏈IgX的全基因序列。另一目的在于提供一種獲得鵝輕鏈IgX基因，所述方法操作簡(jiǎn)便，效果理想。本發(fā)明的第一方面，提供一種用于擴(kuò)增鵝抗體輕鏈IgX基因序列，所述的序列為鵝免疫球蛋白輕鏈IgX基因。第二方面，提供獲得鵝輕鏈IgX全基因序列的方法，所述方法包括1、鵝脾臟淋巴細(xì)胞全RNA的提取2、以序列1和序列2所示引物，及驗(yàn)證引物序列3和序列4以鵝脾臟淋巴細(xì)胞的全RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得的cDNA為模板，擴(kuò)增可變區(qū)基因；3、回收，表達(dá)及測(cè)序。4、利用已知鵝抗體輕鏈可變區(qū)框架結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)引物5、脾臟淋巴細(xì)胞Total RNA提取6、按 5 ‘ RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends, Version 2. 0試劑盒(Invitrogen)說(shuō)明書進(jìn)行5 ' cDNA末端快速擴(kuò)增；按SMART RACE cDNA Amplification Kit User Manual (Clontech)說(shuō)明書進(jìn)行 3' cDNA 末端快速擴(kuò)增具體的實(shí)施步驟1、引物設(shè)計(jì)運(yùn)用Primer Premier 5. 0和DNAMar 5. 01生物學(xué)軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。參照 GenBank上登錄的人、鼠等相關(guān)的抗體輕鏈基因序列。設(shè)計(jì)輕鏈引物如序列1或序列2。2、脾臟 Total RNA 提取取健康鵝新鮮脾臟，淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞，用試劑盒提取淋巴細(xì)胞Total RNA。1.2%瓊脂糖甲醛RNA變性電泳鑒定RNA的完整性。3、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA按第一鏈合成試劑盒說(shuō)明，以總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。4、Vl 的擴(kuò)增以合成的cDNA第一鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系在50ul的反應(yīng)體系中含有10X taq Buffer5ul,2mM dNTP 3ul，上下游引物序列1、序列2(均為IOmM)各2ul，模板 cDNA 5ul, taqE 0. 5ul, H2O 32. 5ul。反應(yīng)條件94_961變性41^11后，941 30s，55_65°C 30s, 72°C lmin，35 個(gè)循環(huán)，72°C IOmin0
1. 2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，進(jìn)行DL2000Marker作對(duì)照。觀察bp處有條帶出現(xiàn)，并切膠參照回收試劑盒說(shuō)明回收?；厥债a(chǎn)物克隆到PMD18-T載體中，并測(cè)序鑒定。5、利用驗(yàn)證引物進(jìn)行擴(kuò)增以合成的cDNA第一鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系在50ul的反應(yīng)體系中 含有IOX taq Buffer5ul，2mM dNTP 3ul，上下游引物序列3、序列4 (均為IOmM)各2ul， 模板 cDNA 5ul, taqE 0. 5ul, H2O 32.5ul。反應(yīng)條件94-96 °C 變性 4min 后，94 °C 30s, 55-65°C 30s, 72°C lmin，35個(gè)循環(huán)，72°C lOmin。1. 2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物， 進(jìn)行DL2000Marker作對(duì)照。7、參照已測(cè)知的可變區(qū)基因序列選擇位置設(shè)計(jì)引物GGCAGTGCCCCTGTCACTGTGATCTATGTCAACACCAACAGACCCTCGGGCATCCCTTCACGATTCTCT GGTTCCAAATCTGGGTCCACAGCCACGCTAACCATCAC序列 7TGGGGTCCAAGCCGAGGACGAGGCCGTCTATTACTGTGCGAGCTACGACAGCAGTAGTGGTACTGATGT ATTTGGGGCCGGGACCACGTTGACCGTCCTGGGCCAGCCCAAGACGTCTCCCAGCATCTACCTCTTCCCGCCATCCTCCGACGAGATCAACTCGCAGAACAAGGCCA CCCTGGTGTGCCTGATGAGCGACTTCTACCCCAGCCCG序列5序列8GTGCAGGTGACCTGGAAAGTCGACGGTTCCACCCGCACCAGTGGCGTGGAGACCTCTGCGTCCCAGAGG CAGAGCAACAACCAGTACATGGCCAGCAGCTACCTGAC序列9序列6GCTGAGCGCTACAGAGTGGAAGACCGTCCAGTCCTTCAGCTGCCAGGTCACGCACGAAGGCGCTGTCAC CGAGAAGACCCTGAACAAATCCGAGTGCTCGTAA7、脾臟 Total RNA 提取取健康鵝新鮮脾臟，淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞，按RNAiso Plus提取試劑說(shuō)明書提取淋巴細(xì)胞Total RNA。1. 2%瓊脂糖甲醛RNA變性電泳鑒定RNA的完整性。8、反轉(zhuǎn)錄合成單鏈cDNA 按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行superscript II RT酶和引物序列9對(duì)總RNA進(jìn)行目的基因第一鏈cDNA的合成。使用RNase Mix對(duì)合成的cDNA進(jìn)行去RNA處理9、進(jìn)行 5' RACE 實(shí)驗(yàn)按5 ‘ RACE使用說(shuō)明書操作，利用RNase Mix對(duì)合成的cDNA進(jìn)行去RNA處理。使用 DNA PurificationSystem :GLASSMAX DNA isolation spin cartridges 對(duì)經(jīng) RNAase 處理過(guò)的cDNA進(jìn)行純化。使用TdT酶和dCTP對(duì)純化后的cDNA進(jìn)行末端加上多聚C使用引物序列8和試劑盒里面帶的橋連鉚釘引物AAP進(jìn)行PCR第一輪擴(kuò)增使用引物序列7和試劑盒里面帶的橋連通用擴(kuò)增引物AUAP進(jìn)行巢式PCR第二輪擴(kuò)增將第二輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳并對(duì)目的條帶進(jìn)行切膠回收純化。純化后的PCR產(chǎn)物與pMD18T進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化后測(cè)序。10、 3' RACE試驗(yàn)使用引物序列5和UPM，以上面合成的cDNA為模板進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增。將第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋50倍，然后用引物序列6和UPM進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增。將第二輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳并對(duì)目的條帶進(jìn)行切膠回收純化。純化后的PCR產(chǎn)物與pMD18T進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化后測(cè)序。附圖簡(jiǎn)述

圖1 :RNAiso Plus提取試劑盒提取的鵝脾臟淋巴細(xì)胞Total RNA電泳圖顯示RNA 的提取效果圖2 擴(kuò)增輕鏈可變區(qū)基因電泳凝膠圖顯示利用兼并引物擴(kuò)增輕鏈IgX部分基因序列的結(jié)果左側(cè)1道為序列1和序列2所擴(kuò)增序列；左側(cè)2道為序列3和序列4所驗(yàn)證擴(kuò)增出的序歹Ij ·右側(cè)1道為DNA marker (100-1000)圖3 用RNAiso Plus提取試劑盒提取的鵝脾臟淋巴細(xì)胞Total RNA電泳4 5 ‘ RACE克隆操作后的凝膠電泳結(jié)果，左測(cè)道1為經(jīng)引物AUAP進(jìn)行巢式PCR第二輪擴(kuò)增將第二輪PCR產(chǎn)物切膠回收純化后的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果。道2為DNA marker(100-1000,1500)圖5 :3' RACE克隆操作后的凝膠電泳結(jié)果，左測(cè)道1為經(jīng)引物序列6和UPM進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增。將第二輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳回收純化后的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果。道2為 DNA marker(100-1000，1500)。
權(quán)利要求
1.鵝抗體輕鏈IgX的全基因序列、引物及克隆鵝抗體輕鏈IgX的全基因序列的方法 IgX全基因序列 序列14TCGGCGTGGG CGGTGCTCGC AGTCGGTGAA GCTGGTACCA AGAGACCCTC TAACCATCAC GCAGTAGTGG AGACGTCTCC AGGCCACCCT AAGTCGACGG ACAACCAGTA AGTCCTTCAG CCGAGTGCTC GTCCCTCTTGGACGCGCAGC CCACACCTCA CCCGGGAGAA GCAGAAGACC GGACATCCCT TGGGGTCCAA TACTGATGTA CAGCATCTAC GGTGTGCCTG TTCCACCCGC CATGGCCAGC CTGCCAGGTC GTAACCCAGATGGTGGGATC GGTTCCCTGG ACCGTGCAGA CCTGGCACTG TCACGATTCT GCCGAGGACG TTTGGGGCCG CTCTTCCCGC ATGAGCGACT ACCAGTGGCG AGCTACCTGA ACGCACGAAG CGGGGCACAG GTGACAGCAGTCGCCATGGC TCCACGCTGC TCACCTGCTC GCCCTGTCAC CTGGTTCCAA AGGCCGTCTA GGACCACGTT CATCCTCCGA TCTACCCCAG TGGAGACCTC CGCTGAGCGC GCGCTGTCAC CCACGAAGAC CCCCCCCTCCCTGGGCCCCT AACGACTCAG CGGGGGTGGC CGTGATCTAT ATCTGGGTCC TTACTGTGCG GACCGTCCTG CGAGATCAAC CCCGGTGCAG TGCGTCCCAG TACAGAGTGG CGAGAAGACC AGTGGCTCCT TCACCCGGATCTCCTCCTCG60CCGGCCTCGA120AGCTGGTATG180GACAACAACA240ACAGCCACGC300AGCTACGACA360GGCCAGCCCA420TCGCAGAACA480GTGACCTGGA540AGGCAGAGCA600AAGACCGTCC660CTGAACAAAT720CACCCTTCCT780GTCCCCCCTC840GCCGCTGCTGA TGCCCCTGC CATCCCCCTG TGCCTGTCCC CTGCTCCTGT CCCCCTCCGC CGGGTGTCAC900ACAAATAAAC ACCAACACTT AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAA引物序列 1 :GGAGAMACCGTSMAGATCACCTGC 序列 2 GACGGTCAGSDTKGTCCCGGCYCC 序列 3 GGCAGTGCCCCTGTCACTGTG 序列 4 TTACGAGCACTCGGATTTGTTC 序列 5 ATCTACCTCTTCCCGCCATCCTCC 序列 6 GTCCCAGAGGCAGAGCAACAACCA 序列 7 GGAACCAGAGAATCGYGAAGGG 序列 8 GAAGTCGCTCATCAGGCACACC 序列 9 GTGGAACCGTCGACTTT
1.如權(quán)利要求1.所述的全基因序列，其特征在于，鵝抗體輕鏈基因包括947bp，其第 104-369位核苷酸為輕鏈可變區(qū)(V)編碼序列，為鵝免疫球蛋白輕鏈相關(guān)基因序列。
2.如權(quán)利要求1.所述的全基因序列，其特征在于，包括輕鏈的前導(dǎo)序列、可變區(qū)(V)、 連接區(qū)(J)、保守區(qū)(C)等，可用以對(duì)相關(guān)未知抗體基因的克隆。
3.如權(quán)利要求1.所述的克隆鵝抗體輕鏈全基因序列的方法，其特征在于，以序列1和序列2作為簡(jiǎn)并引物(Μ :A或C ;S :C或G ;Y :C或T ;K :T或G ；D :T，A或G)，以鵝脾臟淋巴細(xì)胞總RNA為模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA ；在反轉(zhuǎn)錄獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物中分離獲得鵝抗體輕鏈可變區(qū)相關(guān)基因。禾Ij用序列3和序列4的驗(yàn)證引物，擴(kuò)增可變區(qū)基因。利用序列5、6、7、 8、9作為引物，通過(guò)RACE (rapid amplif icationeDNA end)克隆技術(shù)克隆鵝抗體輕鏈Ig λ 全基因序列。
4.如權(quán)利要求1.所述的克隆鵝抗體輕鏈全基因序列的方法，其特征在于，所克隆的抗體為鵝IgX，種屬于Animaiia動(dòng)物界，Phylnm Arthropoda節(jié)肢動(dòng)物門，Class Aves鳥綱， Order Anseriformes 雁形目，F(xiàn)amilyAnatidae 甲鳥禾斗，Genus anser 雁屬，Anser cygnoides 鴻雁。
5.如權(quán)利要求1.所述的克隆鵝抗體輕鏈全基因序列的方法，其特征在于，用以克隆鵝抗體輕鏈IgX相關(guān)基因，進(jìn)而從事鵝相關(guān)免疫制劑的研究和應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供克隆一條鵝免疫球蛋白輕鏈Igλ全基因序列，同時(shí)還公開了克隆鵝抗體輕鏈Igλ全基因序列的方法。本發(fā)明通過(guò)以近源物種的保守序列設(shè)計(jì)兼并引物，從鵝脾臟淋巴細(xì)胞全RNA序列進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，擴(kuò)增出鵝抗體相關(guān)序列，并且再設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物驗(yàn)證擴(kuò)增出確切的輕鏈可變區(qū)序列。進(jìn)而通過(guò)利用RACE克隆策略擴(kuò)增出整條鵝輕鏈Igλ基因。所述的引物適用于克隆和表達(dá)鵝輕鏈Igλ全基因序列。本發(fā)明公開了一種獲得鵝抗體輕鏈Igλ基因的方法。本方法具有特異性、準(zhǔn)確性。本發(fā)明為探討水禽抗體基因研究，鵝基因工程抗體研究及研究新型的抗病免疫制劑提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102161993SQ20111002139
公開日2011年8月24日 申請(qǐng)日期2011年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月19日
發(fā)明者呂雪峰 申請(qǐng)人:呂雪峰