專利名稱：纖維素材料的處理和用于其中的酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從纖維素材料生產(chǎn)糖水解物。更精確地說，本發(fā)明涉及從木質(zhì)纖維素材料利用酶轉(zhuǎn)換生產(chǎn)可發(fā)酵糖。可發(fā)酵糖可用于例如生產(chǎn)生物乙醇或其它用途。本發(fā)明特別涉及以纖維二糖水解酶(cellobiohydrolase)、內(nèi)切葡聚糖酶(endoglucanase)、β-葡萄糖苷酶(beta-glucosidase)及任選的木聚糖酶(Xylanase)處理纖維素材料的方法，并涉及酶制劑及其用途。本發(fā)明進(jìn)一步涉及新穎的纖維素分解多肽、編碼該多肽的多核苷酸， 并涉及包含該多核苷酸的載體及宿主細(xì)胞。本發(fā)明更進(jìn)一步涉及該多肽的用途以及制備該多肽的方法。
背景技術(shù)：
糖水解物可用于微生物生產(chǎn)多種多樣的精細(xì)化學(xué)品或生物聚合物，諸如有機(jī)酸， 例如乳酸，或乙醇或其它醇，例如正丁醇、1，3_丙二醇或聚羥基鏈烷酸酯(PHA)。糖水解物亦可作為其它例如用于富集、分離及純化高價(jià)值糖的非微生物方法或許多聚合方法的原料。糖水解物的主要用途之一是生產(chǎn)生物燃料。生物乙醇和/或其它化學(xué)品的生產(chǎn)可能發(fā)生于生物煉制的一體化工藝中(Wyman 2001)。化石燃料的資源有限，及其所釋放的二氧化碳量增加并導(dǎo)致溫室現(xiàn)象，喚起了使用生物質(zhì)作為可再生和清潔的能源來源的需求。從纖維素材料生產(chǎn)生物燃料即乙醇是一種有前景替代技術(shù)。生物燃料是目前運(yùn)輸業(yè)的唯一選擇，其可以數(shù)量級(jí)減少二氧化碳的排放。 乙醇可用于現(xiàn)行的交通工具及配送系統(tǒng)，因此毋須昂貴的基礎(chǔ)設(shè)施投資。源自木質(zhì)纖維素再生性原料的糖亦可用作各種各樣可取代油基化學(xué)品的化學(xué)產(chǎn)品的原料。植物中大部分碳水化合物是木質(zhì)纖維素的形式，木基本上由纖維素(cellulose)、 半纖維素(hemicellulose)、果膠(pectin)及木質(zhì)素(Iignin)組成。在木質(zhì)纖維素到乙醇的方法中，木質(zhì)纖維素材料首先經(jīng)化學(xué)或物理預(yù)處理，使纖維素成分更容易水解。接著纖維素部分被水解以得到可經(jīng)酵母菌發(fā)酵成為乙醇的糖。木質(zhì)素是得到的主要副產(chǎn)品，其可用作固體燃料。生物乙醇的生產(chǎn)成本高且其能量輸出低，是該方法更經(jīng)濟(jì)的研究仍在持續(xù)進(jìn)行中。酶法水解被認(rèn)為是將纖維素生物質(zhì)轉(zhuǎn)換成可發(fā)酵糖的最有前景的技術(shù)。然而，酶法水解在工業(yè)規(guī)模中僅被有限地被利用，特別是當(dāng)利用高度木質(zhì)化的材料如木材或農(nóng)業(yè)廢棄物時(shí)，該項(xiàng)技術(shù)不令人滿意。酶法步驟的成本是該方法的主要經(jīng)濟(jì)因素的一。已經(jīng)作出許多努力以改善纖維素材料酶法水解的效率(Badger 2002)。US2002/0192774A1描述用于轉(zhuǎn)換固體木質(zhì)纖維素生物質(zhì)成為可燃燒的燃料產(chǎn)物的連續(xù)方法。經(jīng)濕式氧化或汽爆的預(yù)處理后，該生物質(zhì)被部份分離成為纖維素、半纖維素及木質(zhì)素，然后利用一或多種碳水化合酶(EC3. 2)進(jìn)行部份水解。CelluClastTM，N0V0 NordiskA/S公司的商品，含有纖維素酶及木聚糖酶活性，被提供作為范例。US2004/0005674A1描述可直接用于木質(zhì)纖維素底物上的新穎酶混合物，從而可以避免預(yù)處理過程中形成的毒性廢棄物并可以節(jié)省能源。該增效的酶混合物包含纖維素酶及輔助酶如纖維素酶、木聚糖酶、木質(zhì)素酶、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶或葡萄糖醛酸酶或其任何組合物?？紤]的纖維素酶包含內(nèi)切葡聚糖酶(EG)、β-葡萄糖苷酶(BG)及纖維二糖水解酶 (CBH)。該實(shí)施例說明木霉木聚糖酶及纖維素酶制劑的混合物的用途。Kurabi等人^00 研究了以新穎及商品化的真菌纖維素酶來酶法水解經(jīng)汽爆及乙醇有機(jī)溶劑預(yù)處理的花旗松。他們測(cè)試了兩種商品化的里氏木霉(Trichoderma reesei) 纖維素酶制劑及兩種由木霉屬(Trichoderma sp.)及青霉屬(Penicillium sp.)的突變菌株產(chǎn)生的新穎制劑。木霉屬制劑相較于其它制劑顯示顯著更好的表現(xiàn)。更好的表現(xiàn)至少有部分被認(rèn)為是由于顯著較高的葡萄糖苷酶活性所致，其減輕纖維二糖水解酶及內(nèi)切葡聚糖酶的產(chǎn)物抑制。US2004/0053373A1是關(guān)于一種將纖維素轉(zhuǎn)換成葡萄糖的方法，通過以包含纖維素酶及經(jīng)修飾的纖維二糖水解酶I (CBHI)的酶混合物處理經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素底物。該 CBHI已通過滅活其纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)加以修飾。CBHI修飾的優(yōu)點(diǎn)為例如高底物濃度下較好的回收及較高的水解率。纖維素酶選自EG、CBH及BG。優(yōu)選CBHI得自木霉菌。US2005/0164355A1描述了在至少一種表面活性劑存在時(shí)，以一或多種纖維分解酶分解木質(zhì)纖維素材料的方法。其它的酶諸如半纖維素酶、酯酶、過氧化物酶、蛋白酶、漆酶 (Iaccase)或其混合物亦可以使用。表面活性劑存在相較于表面活性劑不存在，可增加木質(zhì)纖維素材料的分解。纖維分解酶可以是任何參與木質(zhì)纖維素分解的酶，包括CBH、EG及BG。有大量文獻(xiàn)公開了各種纖維素酶及半纖維素酶。纖維二糖水解酶(CBHs)公開于例如W003/000941，其涉及得自各種真菌的CBHI 酶。未提供所述酶的生理特性，亦未提供其用途的任何實(shí)施例。Hong等人(2003b)表征了產(chǎn)生于酵母菌中的金黃色嗜熱子囊菌(Thermoascus aurantiacus) CBHI的特征。該酶的應(yīng)用未描述。Tuohy等人Q002)描述了得自埃莫森籃狀菌(Talaromyces emersonii)的3種形式的纖維二糖水解酶。Cel5家族的內(nèi)切葡聚糖酶(E(is fam 5)被描述于例如W003/062409，其涉及用于飼料應(yīng)用的包含至少2種熱穩(wěn)定性酶的組成物。Hong等人(2003a)描述于酵母菌中生產(chǎn)來自金黃色嗜熱子囊菌的熱穩(wěn)定性β_1，4-內(nèi)切葡聚糖酶。其應(yīng)用未解釋。W001/70998涉及得自籃狀菌的葡聚糖酶。它們還描述了得自埃莫森籃狀菌的葡聚糖酶。討論了食物、飼料、飲料、釀造及清潔劑應(yīng)用。并未提及木質(zhì)纖維素水解。W098/06858描述了得自黑曲霉菌(Aspergillus niger)的β _1，4-內(nèi)切葡聚糖酶，且討論了該酶于飼料及食物上的應(yīng)用。W097/13853描述了在cDNA文庫中篩檢編碼酶的DNA片段的方法。該cDNA文庫是酵母菌或真菌源的，優(yōu)選來自曲霉菌。該酶優(yōu)選為纖維素酶。VanPetegem等人^00 描述了來自金黃色嗜熱子囊菌的Cel5家族內(nèi)切葡聚糖酶的三維結(jié)構(gòu)。Parry等人^00 描述了來自金黃色嗜熱子囊菌的Cel5家族內(nèi)切葡聚糖酶的作用模式。Cel7家族的內(nèi)切葡聚糖酶(E(is fam 7)被披露于例如US5，912，157，其關(guān)于毀絲霉屬(Myceliophthora)內(nèi)切葡聚糖酶及其同源物及其于清潔劑、紡織及紙漿上的應(yīng)用。 US6, 071，735描述于堿性條件下展現(xiàn)高度內(nèi)切葡聚糖酶活性的纖維素酶。討論了作為清潔
6劑在紙漿和造紙及紡織應(yīng)用上的用途。未提及生物乙醇。US5，763，2M公開了分解纖維素 /半纖維素且于CBD中具有保守的氨基酸殘基的酶。Cel45家族的內(nèi)切葡聚糖酶(E(is fam 45)被描述于例如US6，001，639，其涉及具有內(nèi)切葡聚糖酶活性且具有2個(gè)保守氨基酸序列的酶。一般性討論了在紡織、清潔劑及紙漿和造紙應(yīng)用上的用途，并提及木質(zhì)纖維素材料的處理，但未提供實(shí)施例。W02004/053039 涉及內(nèi)切葡聚糖酶的清潔劑應(yīng)用。US5，958，082公開了內(nèi)切葡聚糖酶、特別是得自太瑞斯梭孢殼霉(Thielavia terrestris)者于紡織應(yīng)用上的用途。EP0495258涉及包含腐質(zhì)霉 (Humicola)纖維素酶的清潔劑組合物。US5，948，672描述了包含內(nèi)切葡聚糖酶、特別是得自腐質(zhì)霉者的纖維素酶制劑及其于紡織及紙漿應(yīng)用上的用途。木質(zhì)纖維素水解未被提及。小量的β -葡萄糖苷酶(BG)通過水解由纖維二糖水解酶所產(chǎn)生的纖維二糖，增強(qiáng)了生物質(zhì)水解成葡萄糖。纖維二糖轉(zhuǎn)換成葡萄糖通常是主要的限速步驟。葡萄糖苷酶被公開于例如US2005/0214920，其涉及得自煙曲霉菌(Aspergillus fumigatus)的BG。該酶已于米曲霉菌(Aspergillus oryzae)及里氏木霉中生產(chǎn)。該酶于分解生物質(zhì)或清潔劑應(yīng)用上的用途被一般性討論，但未舉例說明。W002/095014描述了具有纖維二糖酶活性的米曲霉菌酶。從生物質(zhì)生產(chǎn)乙醇的用途被一般性討論但未舉例說明。W02005/074656公開了源自例如金黃色嗜熱子囊菌；煙曲霉菌；太瑞斯梭孢殼霉及金黃色嗜熱子囊菌的具有增強(qiáng)纖維素分解活性的多肽。W002/26979公開了植物物質(zhì)的酶法處理。US6，022，725描述了克隆及擴(kuò)增里氏木霉的β -葡萄糖苷酶基因，及US6，103，464描述用于編碼來自絲狀真菌的 β -葡萄糖苷酶的DNA的檢測(cè)方法。未提供應(yīng)用實(shí)施例。木聚糖酶被描述于例如FR2786784，其有關(guān)可用于例如處理動(dòng)物飼料及面包制作的熱穩(wěn)定性木聚糖酶。該酶源自嗜熱性真菌，特別是嗜熱子囊菌屬。US6，197，564描述了具有木聚糖酶活性且得自棘孢曲霉菌(Aspergillus aculeatus)的酶。舉例說明了該酶于烘培上的應(yīng)用。W002/24^6涉及籃狀菌木聚糖酶。提供了飼料及烘培的實(shí)施例。W001/4M33公開了用于食品及飼料應(yīng)用的來自埃莫森籃狀菌的熱穩(wěn)定性木聚糖酶。研究最透徹且應(yīng)用最廣泛的真菌來源的纖維素分解酶已經(jīng)源自里氏木霉(紅褐肉座菌(Hypocrea jecorina)的無性型)。因此大多數(shù)商業(yè)化的真菌纖維素酶亦源自里氏木霉。然而，大部分來自較不知名真菌的纖維素酶尚未被應(yīng)用于具有實(shí)際意義的方法，諸如分解纖維素材料，包括木質(zhì)纖維素。對(duì)于用于分解纖維素底物、特別是木質(zhì)纖維素底物的新方法，及增強(qiáng)分解效率的新穎酶及酶混合物，有持續(xù)的需求。還需要在高溫下工作的方法及酶，如此可使用高黏稠度的生物質(zhì)并導(dǎo)致高濃度的糖及乙醇。這種方法可能引起顯著節(jié)省能源及投資成本。高溫還可降低水解過程中污染的風(fēng)險(xiǎn)。本發(fā)明的目標(biāo)在于達(dá)到至少部分這些需求。發(fā)明簡述目前意外發(fā)現(xiàn)纖維素分解酶，特別是得自金黃色嗜熱子囊菌、嗜熱枝頂孢菌 (Acremonium thermophilum)或嗜熱毛殼菌(Chaetomiumthermophilum)的纖維二糖水角軍酶，對(duì)于水解纖維素材料特別有用。除了纖維二糖水解酶之外，這些真菌還具有非常適合用于分解纖維素材料的內(nèi)切葡聚糖酶、葡萄糖苷酶及木聚糖酶。這些酶在寬溫度范圍內(nèi)呈現(xiàn)非常有效的動(dòng)力學(xué)，并且雖然它們?cè)诟邷叵掠懈叨然钚裕跇?biāo)準(zhǔn)水解溫度下亦非常有效。這使它們極度適合各種在常規(guī)溫度及升高的溫度下進(jìn)行的纖維素底物水解方法。本發(fā)明提供一種以纖維二糖水解酶、內(nèi)切葡聚糖酶及β-葡萄糖苷酶處理纖維素材料的方法，其中所述纖維二糖水解酶包含與SEQ IDNO :2、4、6或8、或與其酶活性片段具有至少80%同一性的氨基酸序列。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種酶制劑，其包含纖維二糖水解酶、內(nèi)切葡聚糖酶及β -葡萄糖苷酶，其中所述纖維二糖水解酶包含與SEQ ID Ν0:2、4、6或8、或與其酶活性片段具有至少80%同一性的氨基酸序列。還提供了所述酶制劑分解纖維素材料的用途，以及所述方法在從纖維素材料制備乙醇的過程中的用途。本發(fā)明還涉及一種多肽，其包含具有纖維素分解活性的片段且選自a)包含的氨基酸序列至少與SEQ ID NO :4具有66%同一性、與SEQ ID N0:6具有 79%同一性、與SEQ ID NO: 12具有78%同一性、與SEQ ID NO 14具有68%同一性、與SEQ ID NO 16 具有 72% 同一性、與 SEQ ID NO :20 具有 68% 同一性、與 SEQ ID NO :22 或 M 具有74%同一性或與SEQ ID NO 26具有78%同一性的多肽；b)包含具有纖維素分解活性片段的a)的變異體；及c)具有纖維素分解活性的a)或b)的片段。本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是一種選自下列的分離的多核苷酸a) SEQ ID NO :3、5、11、13、15、19、21、23或25的核苷酸序列，或編碼權(quán)利要求35的多肽的序列；b) a)的互補(bǔ)鏈；c)包含至少20個(gè)核苷酸的a)或b)的片段 ’及d)由于基因密碼而與a)、b)或c)所定義的任一序列簡并的序列。本發(fā)明還另外提供一種載體，其包含作為異源性序列的所述多核苷酸，以及一種包含所述載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還包括登錄號(hào)為DSM16728、DSM 16729、DSM 17324、 DSM 17323、DSM 17729、DSM 16726、DSM 16725、DSM 17325 或 DSM 17667 的大腸桿菌 (Escherichia coli)菌株。本發(fā)明的其它目標(biāo)為包含至少一種新穎多肽的酶制劑，以及所述多肽或酶制劑于燃料、紡織、清潔劑、紙漿和造紙、食品、飼料或飲料工業(yè)上的用途。還提供了一種制備多肽的方法，該多肽包含具有纖維素分解活性的片段且選自a)包含的氨基酸序列至少與SEQ ID NO :4具有66%同一性、與SEQ ID N0:6具有 79%同一性、與SEQ ID NO: 12具有78%同一性、與SEQ ID NO 14具有68%同一性、與SEQ ID NO 16 具有 72% 同一性、與 SEQ ID NO :20 具有 68% 同一性、與 SEQ ID NO :22 或 M 具有74%同一性或與SEQ ID NO 26具有78%同一性的多肽；b)包含具有纖維素分解活性片段的a)的變異體；及c)具有纖維素分解活性的a)或b)的片段，所述方法包括用編碼所述多肽的載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并于能夠表達(dá)所述多肽的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，和任選回收并純化所產(chǎn)生的多肽。還進(jìn)一步提供一種以至少一種能夠產(chǎn)生上述多肽的微生物的耗盡培養(yǎng)基處理纖維素材料的方法，其中該方法包括令纖維素材料與耗盡培養(yǎng)基反應(yīng)以得到經(jīng)水解的纖維素材料。本發(fā)明的特定實(shí)施方案于從屬權(quán)利要求中提及。本發(fā)明的其它目標(biāo)、細(xì)節(jié)及優(yōu)點(diǎn)可自下列附圖、詳細(xì)說明及實(shí)施例中變得明了。


圖1.纖維素酶及β -葡萄糖苷酶活性于6種測(cè)試真菌菌株上清液中的溫度依賴性。給定溫度下分析中的孵育時(shí)間為60分鐘，分析ρΗ值為5. 0 (MUL活性)或4. 8 (CMCase 或B⑶)。于60°C得到的活性被設(shè)定為100%的相對(duì)活性。A)金黃色嗜熱子囊菌ALK04239， B)金黃色嗜熱子囊菌ALK04M2，C)嗜熱枝頂孢菌ALK04M5，D)嗜熱籃狀菌(Talaromyces thermophilus)ALK04246, Ε)嗜熱毛殼菌 ALKO似61，F(xiàn))嗜熱毛殼菌 ALK04265。圖2.用于轉(zhuǎn)化里氏木霉原生質(zhì)體以產(chǎn)生重組真菌蛋白質(zhì)的表達(dá)盒的示意圖。該重組基因處于里氏木霉cbhl(Cel7A)啟動(dòng)子(cWilprom)控制下且通過使用里氏木霉cbhl 終止子(cWil term)來確保轉(zhuǎn)錄終止。包含amdS基因作為轉(zhuǎn)化標(biāo)記。圖3A).測(cè)定得自金黃色嗜熱子囊菌ALK04M2、嗜熱毛殼菌ALK04265及嗜熱枝頂孢菌六0(04245的重組08!1/(^17蛋白制劑在4-甲基傘形酮基-0-0-乳糖苷(MUL)上50°C 下10分鐘時(shí)的最適ρΗ。結(jié)果以三次單獨(dú)測(cè)量的平均值(士標(biāo)準(zhǔn)差)表示。B)測(cè)量得自金黃色嗜熱子囊菌ALK04M2、嗜熱毛殼菌ALK04265及嗜熱枝頂孢菌ALK04M5的重組CBH/ Cel7蛋白制劑在4-甲基傘形酮基-β-D-乳糖苷糖(MUL)上最佳ρΗ下60分鐘時(shí)的熱穩(wěn)定性。結(jié)果以三次單獨(dú)測(cè)量的平均值(士標(biāo)準(zhǔn)差)表示。這二個(gè)反應(yīng)皆包含BSA(100微克/ 毫升)以作為穩(wěn)定劑。圖4.以純化的重組纖維二糖水解酶于45°C下水解結(jié)晶纖維素(Avicel)。底物濃度1 % (重量/體積)，pH5. 0，酶濃度1. 4微摩爾。A)具有CBD的纖維二糖水解酶，B)沒有 CBD的纖維二糖水解酶(核心)。圖5.以純化的重組纖維二糖水解酶于70°C下水解結(jié)晶纖維素(Avicel)。底物濃度1 % (重量/體積)，pH5. 0，酶濃度1. 4微摩爾。A)包含CBD的纖維二糖水解酶，B)沒有 CBD的纖維二糖水解酶(核心)。圖6A).在50°C下與CMC底物反應(yīng)10分鐘，測(cè)定異源生產(chǎn)的枝頂孢菌EG_40/ Cel45A、EG_40_like/Cel45B及嗜熱子囊菌EG_28/Cel5A活性的ρΗ依賴性。B)分別于pH5. 5、4. 8及6. 0處測(cè)量枝頂孢菌EG_40/Cel45A、EG_40_like/Cel45B及嗜熱子囊菌 EG_28/Cel5A的最適溫度。除了 EGJ8/Cel5A為10分鐘，該包含CMC作為底物的反應(yīng)進(jìn)行 60分鐘。添加BSA(100微克/毫升)作為穩(wěn)定劑。圖7A).在50°C與4-硝基苯基-β -D-吡喃葡糖苷底物反應(yīng)10分鐘，測(cè)定異源生產(chǎn)的枝頂孢菌BG_101/Cel3A、毛殼菌BG_76/Cel3A及嗜熱子囊菌BG_81/Cel3A活性的ρΗ依賴性。B)分別于ρΗ4· 5、5· 5及4. 5下測(cè)量枝頂孢菌β G_101/Cel3A、毛殼菌β G_76/Cel3A 及嗜熱子囊菌0G_81/Cel3A的最適溫度。該包含4-硝基苯基-β-D-吡喃葡糖苷作為底物的反應(yīng)進(jìn)行達(dá)60分鐘，并添加BSA(100微克/毫升)作為穩(wěn)定劑。圖8Α).與樺木木聚糖(birch xylan)底物50°C反應(yīng)10分鐘，測(cè)定異源生產(chǎn)的嗜熱子囊菌XYN_30/Xynl0A木聚糖酶活性的ρΗ依賴性。B)在pH5. 3的60分鐘反應(yīng)中測(cè)量 XYN_30/Xynl0A的最適溫度，并添加BSA(100微克/毫升)作為穩(wěn)定劑。
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圖9.于55及60°C下以嗜熱性酶的混合物(混合物1)與里氏木霉酶水解經(jīng)清洗的汽爆的云杉纖維(10毫克/毫升)。酶劑量以FPU/克底物干物質(zhì)的劑量給予，F(xiàn)PU于 50°C、pH5下分析。于pH5下攪拌水解達(dá)72小時(shí)。結(jié)果以三次單獨(dú)測(cè)量的平均值(士標(biāo)準(zhǔn)差)表不。圖10.于45、55及57. 5°C下以嗜熱性酶的混合物(混合物2)及里氏木霉酶水解經(jīng)汽爆的玉米桿(10毫克/毫升)。用于“混合物2”的酶劑量為5FPU/克的底物干物質(zhì)， 及里氏木霉酶的酶劑量為5FPU/克Celluclast干物質(zhì)添加IOOnkat/克Novozym 188干物質(zhì)(濾紙活性于50°C、pH5下測(cè)定)。于pH5下伴隨攪拌進(jìn)行水解達(dá)72小時(shí)。結(jié)果以三次單獨(dú)測(cè)量的平均值(士標(biāo)準(zhǔn)差)表示。該底物包含可溶性還原糖(約0. 7毫克/毫升)。 此背景糖含量從水解過程中形成的還原糖中減去。圖11.于45、55及60°C下以包含得自金黃色嗜熱子囊菌的新穎嗜熱性木聚糖酶的嗜熱性酶混合物(混合物幻及里氏木霉酶水解經(jīng)汽爆的玉米桿(10毫克/毫升)?！盎旌衔?”的酶劑量為5FPU/克底物干物質(zhì)，里氏木霉酶的酶劑量為5FPU/克Celluclast干物質(zhì)添加IOOnkat/克Novozym 188干物質(zhì)(濾紙活性于50°C、pH5下測(cè)定)。于pH5下伴隨攪拌進(jìn)行水解達(dá)72小時(shí)。結(jié)果以三次單獨(dú)測(cè)量的平均值(士標(biāo)準(zhǔn)差)表示。該底物包含可溶性還原糖(約0. 7毫克/毫升)。此背景糖含量從水解期間所形成的還原糖中減去。圖12.于45、55及60°C下以包含得自金黃色嗜熱子囊菌的新穎嗜熱性木聚糖酶 XYN_30/Xynl0A的嗜熱性酶混合物(混合物幻及里氏木霉酶水解經(jīng)汽爆的云杉纖維(10 毫克/毫升)?！盎旌衔?”的酶劑量為5FPU/克底物干物質(zhì)，里氏木霉酶的酶劑量為5FPU/ 克Celluclast干物質(zhì)添加IOOnkat/克Novozym 188干物質(zhì)(濾紙活性于50°C、pH5下測(cè)定)。于pH5下伴隨攪拌進(jìn)行水解達(dá)72小時(shí)。結(jié)果以三次單獨(dú)測(cè)量的平均值(士標(biāo)準(zhǔn)差) 表不。圖13.葡萄糖對(duì)于不同β-葡萄糖苷酶制劑活性的影響。使用對(duì)硝基苯基-β -D-吡喃葡糖苷為底物的標(biāo)準(zhǔn)分析于分析混合物中存在葡萄糖時(shí)進(jìn)行。該活性以沒有葡萄糖時(shí)所得到的活性的百分比表示。圖14.從50至70°C的溫度下酶混合物的FPU活性，以標(biāo)準(zhǔn)條件下(50°C，1小時(shí)) 的活性的百分比表示。圖15.兩種不同里氏木霉菌株的相對(duì)纖維素酶活性，該菌株生長于含未處理的 Nutriose (NO)或經(jīng)BG_81/Cel3A預(yù)處理的Nutriose (NBG81)作為碳源的培養(yǎng)基中。本發(fā)明的詳細(xì)說明纖維素是高等植物的主要結(jié)構(gòu)成分。其提供植物細(xì)胞高抗張強(qiáng)度，幫助它們抵抗機(jī)械應(yīng)力及滲透壓。纖維素是一種β_1，4-葡聚糖，其由通過β-1，4-糖苷鍵連接的葡萄糖殘基直鏈組成。纖維二糖是纖維素最小的重復(fù)單位。在細(xì)胞壁中纖維素被堆疊成不同方向的板層，其包埋于半纖維素及木質(zhì)素的基質(zhì)中。半纖維素是碳水化合物聚合物的異質(zhì)性類型，其主要包含不同的葡聚糖、木聚糖及甘露聚糖。半纖維素由線性骨架組成，其中β-1， 4-連接殘基被通常包含乙酰基、葡萄糖醛酸基、阿拉伯糖基及半乳糖基的短側(cè)鏈取代。半纖維素可以化學(xué)方式與木質(zhì)素交聯(lián)。木質(zhì)素是各種取代的對(duì)羥苯基丙烷單位的復(fù)雜交聯(lián)聚合物，其提供細(xì)胞壁強(qiáng)度以承受機(jī)械應(yīng)力，同時(shí)可保護(hù)纖維素不受酶水解。木質(zhì)纖維素是纖維素和半纖維素與苯酚丙醇單位的聚合物和木質(zhì)素的組合物。其物理性質(zhì)堅(jiān)硬、密實(shí)且不易受影響，為生物圈中含量最豐富的生化材料。含木質(zhì)纖維素的材料的實(shí)例為硬木及軟木屑、木漿、鋸屑及林木業(yè)廢棄物；農(nóng)業(yè)生物質(zhì)如谷類禾桿、甜菜渣、 玉米桿及穗軸、甘蔗渣、莖、葉、皮、殼等；廢棄物品如都市固體廢棄物、報(bào)紙及辦公室廢紙、 例如谷粒的研磨廢料；專用能源作物(例如柳木、楊木、柳枝稷(switchgrass)或草蘆等)。 優(yōu)選實(shí)例為玉米桿、柳枝稷、谷類禾桿、甘蔗渣及木材衍生材料。本文所使用的“纖維素材料”涉及任何包含纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)纖維素以為重要成分的材料?！澳举|(zhì)纖維素材料”是指任何包含木質(zhì)纖維素的材料。這類材料是例如植物材料如包括軟木及硬木的木材、草本作物、農(nóng)業(yè)殘余物、紙漿及造紙殘余物、廢紙、食物及飼料業(yè)廢棄物等。紡織纖維諸如棉、源自棉、亞麻、大麻、黃麻的纖維及人造纖維素纖維如木代爾(modal)、黏膠(viscose)、天絲(lyocell)是纖維素材料的特定例子。纖維素材料在自然界中會(huì)被很多不同的生物體包括細(xì)菌及真菌分解。纖維素通常由不同纖維素酶相繼或同時(shí)作用分解。纖維素經(jīng)生物轉(zhuǎn)換成葡萄糖通常需要三種類型的水解酶(1)切斷內(nèi)部β-1，4-糖苷鍵的內(nèi)切葡聚糖酶；(2)從纖維素聚合物鏈末端切割雙糖纖維二糖的外切型纖維二糖水解酶；C3)水解纖維二糖及其它短纖維寡糖成為葡萄糖的 β-葡萄糖苷酶。換句話說，三種主要類型的纖維素酶為纖維二糖水解酶(CBH)、內(nèi)切葡聚糖酶(EG)及β -葡萄糖苷酶(BG)。包含底物的更復(fù)雜纖維素的分解需要廣泛的各種酶。舉例來說，木質(zhì)纖維素是由半纖維素酶如木聚糖酶及甘露聚糖酶分解。半纖維素酶是一種水解半纖維素的酶?！袄w維素分解酶”為具有“纖維素分解活性”的酶，這表示它們能夠?qū)⒗w維素底物或其衍生物水解成較小的糖。因此纖維素分解酶包括纖維素酶及半纖維素酶。本文所使用的纖維素酶包括纖維二糖水解酶、內(nèi)切葡聚糖酶及β -葡萄糖苷酶。里氏木霉具有著名且有效的纖維素酶系統(tǒng)，其包含兩個(gè)CBH、兩個(gè)主要及一些次要的EG及BG。里氏木霉CBHI(Cel7A)自纖維素鏈的還原端切割糖，并具有C端纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)且可能構(gòu)成多達(dá)60%的總分泌蛋白質(zhì)。里氏木霉CBHII(Cel6A)自纖維素鏈的非還原端切割糖，并具有N端纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域且可能構(gòu)成多達(dá)20%的總分泌蛋白質(zhì)。 內(nèi)切葡聚糖酶EGI(Cel7B)及EGV(Cel45A)于C端具有CBD，EGII (Cel5A)具有N端CBD而 EGIII (Ce 112A)根本沒有纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域。CBHI、CBHII、EGI及EGII也稱為木霉菌的“主要纖維素酶”，共占總分泌蛋白質(zhì)的80至90%。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解，一種酶可能對(duì)幾種底物有活性且酶活性可利用不同底物、方法及條件測(cè)定。鑒別不同的纖維素分解活性討論于例如 van Tilbeurgh 等人 1988。除了表達(dá)纖維素分解活性的催化結(jié)構(gòu)域/核心之外，纖維素分解酶可能包含一或多種纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)，亦稱為碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域/組件(CBD/CBM)，其可位于催化結(jié)構(gòu)域的N或C端。CBD具有碳水化合物結(jié)合活性且介導(dǎo)纖維素酶與結(jié)晶纖維素結(jié)合， 但是對(duì)該酶對(duì)于可溶性底物的纖維素酶水解活性的影響很少或沒有。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域通常通過柔性且高度糖基化的接頭區(qū)域連接。本文使用的“纖維二糖水解酶”或“CBH”是指自葡萄糖鏈末端切割纖維素且主要產(chǎn)生纖維二糖的酶。它們也稱為l，4-i3-D-葡聚糖纖維二糖水解酶或纖維素-1，4-β-纖維二糖酶。它們從包含1，4-β-D-糖苷鍵的聚合物如纖維素的還原或非還原端水解該鍵， 從而釋出纖維二糖。從里氏木霉已分離出兩種不同的CBH，CBHI和CBHII。它們具有由連
11接纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)的催化結(jié)構(gòu)域所組成的模塊結(jié)構(gòu)。自然界中亦有缺乏CBD的纖維二糖水解酶?！皟?nèi)切葡聚糖酶”或“EG”是指切斷纖維素鏈內(nèi)部糖苷鍵的酶。它們被分類為 EC3.2. 1.4。它們是1，4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶且催化葡萄糖聚合物如纖維素及其衍生物中l(wèi)，4-i3-D-糖苷鍵的內(nèi)切水解。有些天然存在的內(nèi)切葡聚糖酶具有纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其它則沒有。有些內(nèi)切葡聚糖酶也具有木聚糖酶活性(Bailey等人，1993)?！?β -葡萄糖苷酶”或“BG”或“ β G”是指將小的可溶性寡糖包括纖維二糖分解成葡萄糖的酶。它們分類為EC3. 2. 1. 21。它們是β -D-葡糖苷葡萄糖水解酶，通常催化末端非還原的β-D-葡萄糖殘基的水解。這些酶識(shí)別葡萄糖的寡糖。典型的底物為纖維二糖及纖維三糖。纖維二糖為纖維二糖水解酶的抑制劑，因此分解纖維二糖對(duì)于克服纖維二糖水解酶的終產(chǎn)物抑制而言很重要。木聚糖酶是能識(shí)別及水解半纖維素的酶，它們包括外切水解及內(nèi)切水解的酶。它們通常具有將半纖維素分解成木糖的內(nèi)切-1，4-β-木聚糖酶(EC3. 2. 1.8)或β-D-木糖苷酶(EC3. 2. 1. 37)活性。與本發(fā)明有關(guān)的“木聚糖酶”或“Xyn”特別是指分類為EC3. 2. 1. 8 的、水解木質(zhì)纖維素基體或純化木聚糖的木糖聚合物的酶。除此之外，纖維素酶可根據(jù)它們的主要序列分類為各種糖基水解酶家族，由家族一些成員的三維結(jié)構(gòu)分析得到支持(Henrissatl991, Henrissat和Bairoch 1993,1996)。 某些糖基水解酶為多功能性酶，其包含屬于不同糖基水解酶家族的催化結(jié)構(gòu)域。家族3由 β-葡萄糖苷酶(EC3.2. 1.21)組成，諸如本文所述的Ta BG_81、At BG_101及CtBG_76。家族5(過去稱為celA)主要由內(nèi)切葡聚糖酶(EC3. 2. 1. 4)組成，諸如本文所述的Ta EG_280 家族7(過去稱為纖維素酶家族celC)包含內(nèi)切葡聚糖酶(EC3. 2.1.4)及纖維二糖水解酶(EC3. 2. 1. 91)，諸如本文所述的 Ct EG_54、Ta CBH、At CBH_A、At CBH_C 及 Ct CBH。家族10(過去稱為celF)主要由木聚糖酶(EC3. 2. 1. 8)組成，諸如本文所述的Ta XYN_30及 At XYN_60。家族45(過去稱為celK)包含內(nèi)切葡聚糖酶(EC3. 2. 1. 4)，諸如本文所述的At EG_40 及 AtEG_40_like。用于水解纖維素材料的纖維素分解酶可得自金黃色嗜熱子囊菌、嗜熱枝頂孢菌或嗜熱毛殼菌?！翱傻米浴笔侵杆鼈兛梢詮乃鑫锓N得到，但是不排除從其它來源得到的可能性。換句話說，它們可能源自任何有機(jī)體，包括植物。優(yōu)選它們?cè)醋晕⑸锢缂?xì)菌或真菌。該細(xì)菌可能例如來自選自芽胞桿菌屬(Bacillus)、固氮螺菌屬(Azospirillum) 及鏈霉菌屬(Streptomyces)的類屬。更優(yōu)選該酶源自真菌(包括絲狀真菌及酵母菌)， 例如來自選自嗜熱子囊菌屬、枝頂孢菌屬、毛殼菌屬、無毛毛殼菌屬(Achaetomium)、梭孢殼菌屬(Thielavia)、曲霉菌屬、葡萄孢屬(Botrytis)、金孢子菌屬(Chrysosporium)、 金錢菌屬(Collybia)、層孔菌屬(Fomes)、鐮孢屬(FUSarium)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、 肉座菌屬(Hypocrea)、香菇屬(Lentinus)、馬蘭諾菌屬(Melanocarpus)、毀絲霉屬、麥瑞菌屬(Myriococcum)、脈孢菌屬(Neurospora)、青霉菌屬(Penicillium)、毛平革菌屬 (Phanerochaete)、射脈菌屬(Phlebia)、側(cè)耳屬(PleurotUS)、柄孢殼屬(Podospora)、 絲核菌屬(Rhizoctonia)、西塔利菌屬(Scytalidium)、密孔菌屬(PycnoporUS)、栓菌屬 (Trametes)及木霉菌屬。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，酶可得自保藏為CBS 116239的金黃色嗜熱子囊菌菌株ALK04M2、目前被歸類為嗜熱枝頂孢菌的保藏為CBS 116240的菌株ALK04M5、或保藏為CBS 730. 95的嗜熱毛殼菌菌株ALKO似65。該纖維二糖水解酶優(yōu)選包含與SEQ ID NO :2、4、6或8或與其酶活性片段具有至少 80%同一性的氨基酸序列。
纖維二糖基因可得自CBD核酸SEQ氨基酸SEQ水解酶ID NOID NOTa CBHTa cel7A金黃色嗜熱子囊菌-12At CBH_AAt cel7B嗜熱枝頂孢菌-34At CBH_CAt cel7A嗜熱枝頂孢菌+56Ct CBHCt cel7A嗜熱毛殼菌+78這些CBHs相較于里氏木霉CBH具有優(yōu)勢(shì)的纖維素抑制常數(shù)，且當(dāng)以不同纖維素底物測(cè)試時(shí)，它們顯示改善的水解結(jié)果。SEQ ID N0:2及4不包含CBD。當(dāng)纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域 (CBD)與本身不具有CBD的CBH連接時(shí)，則可獲得特別加強(qiáng)的水解結(jié)果。該CBD可得自例如木霉菌屬或毛殼菌屬物種，且優(yōu)選通過接頭與CBH連接。所形成的包含通過接頭與CBD連接的CBH核心區(qū)的融合蛋白可能包含與SEQ IDNO 28或30具有至少80%同一性的氨基酸序列。包含SEQ ID NO :27或四序列的多核苷酸編碼該融合蛋白。內(nèi)切葡聚糖酶可能包含與SEQ ID NO :10、12、14或16或其酶活性片段具有至少 80%同一性的氨基酸序列。這些內(nèi)切葡聚糖酶具有良好的熱穩(wěn)定性。
內(nèi)切葡聚糖酶基因可得自CBD核酸SEQ ID NO氨基酸 SEQ ID NOTa EG_28Ta cel5A金黃色嗜熱子囊菌-910At EG_40At cel45A嗜熱枝頂孢菌+1112At EG40_likeAt cel45B嗜熱枝頂孢菌-1314Ct EG_54Ct cel7B嗜熱毛殼菌+1516β-葡萄糖苷酶可能包含與SEQ ID NO :22、Μ或沈或其酶活性片段具有至少 80%同一性的氨基酸序列。這些葡萄糖苷酶對(duì)于葡萄糖抑制具有良好抗性，這有利于避免纖維素材料的酶法水解期間的終產(chǎn)物抑制。該葡萄糖苷酶可能也被用于制備槐糖 (sophorose)，一種用于里氏木霉培養(yǎng)中的纖維素酶誘導(dǎo)物。β-葡萄糖苷酶木聚糖酶可能包含與SEQ ID NO 18或20或其酶活性片段具有至少80%同一性
的氨基酸序列。
木聚糖酶基因可得自CBD核酸SEQ ID NO氨基酸SEQ ID NOXyn—30Ta xynlOA金黃色嗜熱子囊菌+1718Xyn_60AtxynlOA嗜熱枝頂孢菌-1920術(shù)語“同一性”在此是指兩個(gè)氨基酸序列之間從由對(duì)應(yīng)基因所編碼第一個(gè)氨基酸至最后一個(gè)氨基酸互相比較的整體同一性。全長序列的同一性是利用EMBOSS(歐洲分子生物學(xué)開放軟件套件；Rice等人，2000)程序包3.0.0版中的尼德曼-王氏 (Needleman-Wunsch)整體比對(duì)程序測(cè)量，參數(shù)如下EMBL0SUM62，間隔罰分10. 0，延長罰分 0.5。該算法在尼德曼-王氏(1970)中描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解這樣的事實(shí)，利用尼德曼-王氏算法所得到的結(jié)果僅在比對(duì)序列的對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)域時(shí)才是可比較的。因此例如包含 CBD或信號(hào)序列的纖維素酶序列與缺乏這些元件的序列相比較是做不到的的。根據(jù)本發(fā)明的一種實(shí)施方式，使用與SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、 22,24或沈或至少與其酶活性片段具有至少80、85、90、95或99%同一性的纖維素分解多肽。術(shù)語“酶活性片段”是指具有纖維素分解活性的定義序列的任何片段。換句話說， 酶活性片段可能是該定義序列的成熟蛋白質(zhì)部分或可能只是成熟蛋白質(zhì)部分的片段，條件是其仍具有纖維二糖水解酶、內(nèi)切葡聚糖酶、β -葡萄糖苷酶或木聚糖酶活性。優(yōu)選纖維素分解酶是重組酶，其可以用一般的已知方式生產(chǎn)。分離包含該酶基因的多核苷酸片段，將該基因插入表達(dá)載體中的強(qiáng)啟動(dòng)子下，該載體被轉(zhuǎn)移至適當(dāng)宿主細(xì)胞內(nèi)，且令該宿主細(xì)胞于激發(fā)該酶產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)。不同宿主系統(tǒng)中利用重組技術(shù)生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法是該領(lǐng)域所熟知的(Sambrook等，1989 ;Coen，2001 ；Gellissen，2005)。優(yōu)選該酶被產(chǎn)生成為分泌至培養(yǎng)基的胞外酶，這樣可方便酶的回收及分離。生產(chǎn)宿主的耗盡培養(yǎng)基可以就這樣用，或可以自其中除去宿主細(xì)胞，和/或可以濃縮、過濾或分餾該耗盡培養(yǎng)基。其也可被干燥。本文中分離的多肽可以僅表示細(xì)胞及細(xì)胞碎片已被從包含該多肽的培養(yǎng)基中除去。該多肽的分離可方便地通過例如向耗盡培養(yǎng)基中添加陰離子和/或陽離子聚合物以促進(jìn)細(xì)胞、細(xì)胞碎片及一些具有無用副作用的酶沉積。接著該培養(yǎng)基利用無機(jī)過濾劑及濾器過濾，以除去形成的沉淀物。之后濾液利用半透膜進(jìn)一步處理以去除過量的鹽、糖及代謝產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明的一種實(shí)施方案，異源性多核苷酸包含的基因類似于登錄號(hào)DSM 16723、DSM 16728、DSM 16729、DSM 16727、DSM 17326、DSM 17324、DSM 17323、DSM 17729、 DSM 16724, DSM 16726、DSM16725、DSM 17325 或 DSM 17667 的微生物所包含的基因。該生產(chǎn)宿主可以是任何能夠表達(dá)纖維素分解酶的有機(jī)體。優(yōu)選該宿主是微生物細(xì)胞，更優(yōu)選是真菌。最優(yōu)選該宿主是絲狀真菌。優(yōu)選該重組宿主被修飾以表達(dá)及分泌纖維素分解酶，作為其主要活性或主要活性之一。這可通過刪除主要的同源分泌基因例如木霉菌的四個(gè)主要纖維素酶和通過將異源性基因打靶到已經(jīng)修飾以確保高表達(dá)及生產(chǎn)濃度的基因座中達(dá)成。用于生產(chǎn)纖維素分解酶的優(yōu)選宿主特別是來自木霉菌屬或曲霉菌屬的菌株。可以添加酶法有效量的根據(jù)本發(fā)明水解纖維素材料所需的酶，或同時(shí)，例如以酶混合物的形式，或相繼，或作為同步糖化及發(fā)酵(SSF)的一部分。任何包含與SEQ ID NO 2, 4、6或8或與其酶活性片段具有至少80%同一性的氨基酸序列的纖維二糖水解酶組合物可以與內(nèi)切葡聚糖酶及β-葡萄糖苷酶的任何組合物一起使用。如果該纖維素材料包含半纖維素，將額外使用半纖維素酶，優(yōu)選木聚糖酶以供分解。內(nèi)切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶及木聚糖酶可能選自本文所描述者，但不限于此。它們也可以是例如商品化的酶制劑。除了纖維素酶及任選的半纖維素酶之外，還可以使用一或多種其它酶，例如蛋白酶、淀粉酶、漆酶、 脂肪酶、果膠酶、酯酶和/或過氧化物酶。其它酶處理可以在纖維素酶處理之前、之中或之后進(jìn)行。術(shù)語“酶制劑”表示包含至少一種所需酶的組合物。該制劑可包含至少為部分純化和分離形式的酶。其可以甚至基本上由所需的酶組成?；蛘咴撝苿┛梢詾榘换蚨喾N纖維素分解酶的耗盡培養(yǎng)基或?yàn)V液。除纖維素分解活性之外，該制劑可包含添加物，諸如媒介物、穩(wěn)定劑、緩沖劑、防腐劑、表面活性劑和/或培養(yǎng)基成分。優(yōu)選的添加劑為該些通常用于供特定應(yīng)用的酶制劑中者。該酶制劑可以是液體、粉末或顆粒的形式。該酶制劑優(yōu)選為耗盡培養(yǎng)基?！昂谋M培養(yǎng)基”是指包含所產(chǎn)生的酶的宿主的培養(yǎng)基。優(yōu)選該宿主細(xì)胞于生產(chǎn)后與所述培養(yǎng)基分離。根據(jù)本發(fā)明的一種實(shí)施方案，酶制劑包含CBH、EG及BG的混合物，任選加上木聚糖酶和/或其它酶。CBH包含與SEQ ID NO :2、4、6或8或與其酶活性片段具有至少80%同一性的氨基酸序列，且其可得自金黃色嗜熱子囊菌、嗜熱枝頂孢菌或嗜熱毛殼菌，然而EG、BG 及木聚糖酶可能來自任何來源包括來自所述有機(jī)物?？赡艽嬖谟谥苿┑钠渌笧槔绲鞍酌浮⒌矸勖?、漆酶、脂肪酶、果膠酶、酯酶和/或過氧化物酶。不同的酶混合物及組合物可用來配合不同的處理?xiàng)l件。舉例來說，如果分解過程是在高溫下進(jìn)行，則選擇熱穩(wěn)定性酶。家族7的CBH與家族45的內(nèi)切葡聚糖酶的組合物， 任選與家族3的BG和/或家族10的木聚糖酶組合，于45°C及升高的溫度下均具有出色的水解性能。里氏木霉的纖維素分解酶于水解時(shí)常規(guī)用于約40至50°C的溫度范圍內(nèi)，且于SSF 時(shí)為30至40°C?？傻米越瘘S色嗜熱子囊菌、嗜熱枝頂孢菌或嗜熱毛殼菌的CBH、EG、BG及
15Xyn在這些溫度下也有效，但除此之外它們大部分在介于50至75°C、或甚至高達(dá)80和85°C 的溫度下亦非常有效，諸如介于陽至70°C，例如介于60至65°C。對(duì)于短暫孵育時(shí)間而言， 酶混合物在甚至高達(dá)85°C仍有作用，至于完全水解通常使用較低溫度。以CBH、EG、BG及Xyn處理纖維素材料的方法特別適用于自木質(zhì)纖維素材料生產(chǎn)可發(fā)酵糖。該可發(fā)酵糖接著利用酵母菌發(fā)酵成為乙醇，并且作為燃料使用。它們亦可作為用于化工過程例如所謂生物煉制中生產(chǎn)各種化學(xué)物質(zhì)或結(jié)構(gòu)單元的中間物或原料。木質(zhì)纖維素材料在酶法水解之前可預(yù)處理以破壞纖維素底物的纖維結(jié)構(gòu)，并使纖維素成分更容易接觸纖維素分解酶。目前的預(yù)處理包括機(jī)械性、化學(xué)性或熱處理方法及其組合。該材料可以例如通過汽爆或酸水解預(yù)處理。很多新穎的纖維素分解多肽可見于金黃色嗜熱子囊菌、嗜熱枝頂孢菌及嗜熱毛殼菌。該新穎的多肽可包含具有纖維素分解活性且選自包含氨基酸序列的多肽的片段，所述氨基酸序列至少與SEQ ID NO :4具有66%、優(yōu)選為70%或75%的同一性，與SEQ ID NO 6 具有79%同一性，與SEQ ID NO: 12具有78%同一性，與SEQ ID NO 14具有68%、優(yōu)選為 70%或75%同一性，與SEQ ID NO :16具有72%、優(yōu)選為75%的同一性，與SEQ ID NO 20 具有68%、優(yōu)選為70%或75%同一性，與SEQ ID NO :22或M具有74%同一性或與SEQ ID NO 26具有78%同一性。該新穎多肽也可以使所述多肽的變異體。“變異體”可以是同菌株、種或?qū)僦刑烊话l(fā)生成為例如等位變異體的多肽，或可以通過突變產(chǎn)生。其可包含氨基酸取代、刪除或插入，但仍與上述定義的酶以基本上類似的方式發(fā)揮作用，也就是包含具有纖維素分解活性的片段。該纖維素分解多肽通常作為包含信號(hào)序列的不成熟多肽于細(xì)胞中產(chǎn)生，該信號(hào)序列于蛋白質(zhì)分泌過程中被切割。它們的N端和/或C端都可能于分泌時(shí)被進(jìn)一步處理以得到成熟、具有酶活性的蛋白質(zhì)。因此“包含具有纖維素分解活性的片段”的多肽是指該多肽可以是不成熟或成熟形式，優(yōu)選為成熟形式，也就是經(jīng)過處理。該新穎多肽可進(jìn)一步為上述“多肽或變異體的片段”。該片段可以是上述蛋白質(zhì)的成熟形式，或其可以只是該成熟蛋白質(zhì)的酶活性部分。根據(jù)本發(fā)明的一種實(shí)施方案，該多肽具有與SEQ ID而4、6、12、14、16、20、22、對(duì)或沈或與其纖維素分解活性片段具有至少 80、85、90、95或99%同一性的氨基酸序列。其亦可以為變異體，或其具有纖維二糖水解酶、 內(nèi)切葡聚糖酶、木聚糖酶或β-葡萄糖苷酶活性的片段。根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，該多肽基本由SEQ ID NO :4、6、12、14、16、20、22、對(duì)或沈序列的纖維素分解活性片段組成。該新穎的多核苷酸可以包含SEQ ID NO :3、5、11、13、15、19、21、23或25的核苷酸序列或編碼上述新穎多肽的序列，包括其互補(bǔ)鏈。本文所使用的多核苷酸是指RNA及DNA， 且其可以為單鏈或雙鏈。該多核苷酸也可以是包含至少20個(gè)核苷酸、例如至少25、30或40 個(gè)核苷酸的所述多核苷酸的片段。根據(jù)本發(fā)明的一種實(shí)施方案，其長度至少為100、200或 300個(gè)核苷酸。另外該多核苷酸可以因基因密碼而與上述定義的任一序列簡并。這表示不同的密碼子可以編碼相同的氨基酸。根據(jù)本發(fā)明的一種實(shí)施例方案，多核苷酸“包含于”SEQ ID N0:3、5、ll、13、15、19、 21、23或25中，這表示該序列具有上述序列的至少部分。根據(jù)本發(fā)明的另一種實(shí)施方案， 該多核苷酸包含的基因類似于登錄號(hào)DSM 16728、DSM 16729、DSM 17324、DSM 17323、DSM17729, DSM 16726, DSM 16725, DSM 17325 或 DSM 17667 的微生物所包含的基因。該新穎蛋白質(zhì)/多肽可以如上述制備。該新穎多核苷酸被插入載體中，其能夠表達(dá)由異源性序列編碼的多肽，且該載體可以被插入能夠表達(dá)所述多肽的宿主細(xì)胞中。該宿主細(xì)胞優(yōu)選為木霉菌屬或曲霉菌屬。編碼該新穎多肽的異源性基因被導(dǎo)入登錄號(hào)為DSM 16728,DSM16729,DSM 17324、 DSM 17323,DSM 17729,DSM 16726,DSM 16725,DSM 17325 或 DSM 17667 的大腸桿菌菌株中
的質(zhì)粒上。該新穎的酶可以是酶制劑的成分。該酶制劑可以包含一或多種新穎的多肽，且其可以例如耗盡培養(yǎng)基、粉末、顆?；蛞后w的形式。根據(jù)本發(fā)明的一種實(shí)施方案，其包含纖維二糖水解酶、內(nèi)切葡聚糖酶、β -葡萄糖苷酶及任選的木聚糖酶活性和/或其它酶活性。其可以進(jìn)一步包含任何常規(guī)添加劑。該新穎的酶可被用于任何與纖維素分解酶有關(guān)的工藝，諸如于燃料、紡織、清潔劑、紙漿和造紙、食品、飼料或飲料工業(yè)上，特別是用于水解纖維素材料以供生產(chǎn)包含乙醇的生物燃料。在紙漿和造紙工業(yè)上，它們可被用于修飾纖維素纖維例如處理牛皮紙漿、機(jī)械紙漿或回收紙。本發(fā)明由下列非限制性實(shí)施例說明。然而應(yīng)了解的是，上述說明及實(shí)施例中給出的實(shí)施方案僅供說明之用，且在本發(fā)明的范圍內(nèi)各種改變及修飾皆是有可能的。
實(shí)施例實(shí)施例1.篩選表達(dá)纖維素分解活性的菌株及其培養(yǎng)供純化測(cè)試約25個(gè)來自羅爾(Roal Oy)菌種保藏中心的真菌菌株的纖維素分解活性包括β-葡萄糖苷酶。經(jīng)過初步篩選，選出6個(gè)菌株供進(jìn)一步試驗(yàn)。它們是金黃色嗜熱子囊菌ALK04239及ALK04M2、嗜熱枝頂孢菌ALK04M5、嗜熱籃狀菌ALK04246及嗜熱毛殼菌 ALK04261及 ALK04265。菌株ALK04239、ALK04242及ALK04246于搖瓶中以3ΧΒ培養(yǎng)基42°C培養(yǎng)7天，包含(克/升)=Solka Floc纖維素18、酒糟18、斯佩爾特燕麥木聚糖9、碳酸鈣2、豆粉4. 5、 (NH4)HP044. 5、小麥麩皮3. O、磷酸二氫鉀1. 5、水合硫酸鎂1. 5、氯化鈉0. 5、硝酸鉀0. 9、刺槐豆膠9. O、微量元素溶液#10. 5、微量元素溶液#20. 5及Mruktol (Stow, OH, USA)消泡劑 0. 5毫升；pH調(diào)至6. 5。微量元素溶液#1含(克/升)硫酸錳1. 6、七水硫酸鋅3. 45及六水氯化鈷2. O ；微量元素溶液#2含(克/升)七水硫酸鐵5. O及兩滴濃硫酸。菌株ALK04261于搖瓶中以IXB培養(yǎng)基培養(yǎng)，其具有3XB培養(yǎng)基(上述)各成分的 1/3，但碳酸鈣、氯化鈉及微量元素的濃度相同。該菌株于45°C下培養(yǎng)7天。菌株ALKO似65于搖瓶中以下列培養(yǎng)基培養(yǎng)，克/升Solka Floc纖維素40、 Pharmamedia (Traders Protein,Memphis, TN, USA) 10、玉米漿粉 5、硫酸銨 5 及磷酸二氫鉀 15;pH調(diào)至6. 5。該菌株于45°C下培養(yǎng)7天。培養(yǎng)后的細(xì)胞及其它固體經(jīng)離心收集且回收上清液。為了搖瓶培養(yǎng)，分別添加蛋白酶抑制劑PMSF(苯甲基磺酰氟)及抑胃肽至1毫摩爾和10微克/毫升。若非立即使用， 將該制劑分裝儲(chǔ)存于-20°C下。為了評(píng)估該酶的熱活性，在作為穩(wěn)定劑的100微克牛血清白蛋白(BSA)/毫升存在下，于501、601、651、701及75°C下對(duì)該搖瓶培養(yǎng)的制備物進(jìn)行1小時(shí)的分析。初步分析于50°C及65°C下以兩種不同的pH值(4. 8/5. 0或6. 0)進(jìn)行，以確認(rèn)哪一個(gè)pH更適合熱活性分析。所有搖瓶上清液進(jìn)行下列活性的分析類纖維二糖水解酶I活性(“CBHI”)及類內(nèi)切葡聚糖酶I活性(“EGI”)這些在50毫摩爾的乙酸鈉緩沖液中測(cè)量，以0.5毫摩爾的MUL(4_甲基傘形酮基-β-D-乳糖苷糖)作為底物。添加葡萄糖(100毫摩爾)以抑制任何干擾性葡萄糖苷酶活性。于370納米處測(cè)定釋出的4-甲基傘形酮基。通過測(cè)量纖維二糖(5毫摩爾)存在及不存在時(shí)的活性來區(qū)分“CBHI”及“EGI”活性。未被纖維二糖抑制的活性代表“EGI” 活性，其余的MUL活性代表“CBHI”活性(van Tilbeurgh等，1988)。該分析于pH5. 0或6. 0 進(jìn)行(見下述)。內(nèi)切葡聚糖酶(CMCase)活性基本上按照Bailey 和 Nevalainen 1981 ;Haakana 等 2004 所述，以 2% (重量 / 體積)的羧甲基纖維素(CMC)作為底物于50毫摩爾檸檬酸鹽緩沖液中分析。還原糖以DNS 試劑測(cè)定。分析于PH4. 8或6. 0進(jìn)行(見下述)。β -葡萄糖苷酶(B⑶)活性如Bailey和Nevalainen 1981所述，以4_硝基苯基- β -D-吡喃葡糖苷(1毫摩爾)于50毫摩爾檸檬酸鹽緩沖液中分析。于400納米處測(cè)定釋出的4-硝苯苯酚。該分析于ρΗ4· 8或6. 0進(jìn)行(見下述)。酶的相對(duì)活性如圖1所示。該相對(duì)活性的表示是以60°C的活性設(shè)定為100% (圖 1)。所有菌株皆產(chǎn)生酶，所述酶于高溫下(65°C至75°C )具有高活性。在蛋白質(zhì)純化方面，ALK04242亦于2升生物反應(yīng)器中(Braun Biostat B，Braun， Melsungen，德國)生長于下列培養(yǎng)基(克/升)中=S0IkaFl0c纖維素40、豆粉10、硝酸銨5、磷酸二氫鉀5、七水硫酸鎂0. 5、二水氯化鈣0. 05、微量元素溶液#10. 5、微量元素溶液 #20. 5。通氣量為lvvm，以Mruktol控制消泡，攪拌200至800rpm及溫度為47°C。運(yùn)行二個(gè)批次，一批的PH值為4. 7士0.2(氨氣/硫酸)，另一批的初始pH為4. 5。培養(yǎng)時(shí)間為7天。培養(yǎng)后的細(xì)胞及其它固體經(jīng)離心去除。菌株ALK04245于2升生物反應(yīng)器中(Braun Biostat B，Braun, Melsungen，德國)生長于下列培養(yǎng)基中，克/升Solka Floc纖維素40、玉米漿粉15、酒糟5、斯佩爾特燕麥木聚糖3、刺槐豆膠3、硫酸銨5及磷酸二氫鉀5。pH的范圍為 5. 2士0. 2 (氨氣/硫酸)，通氣量lvvm,以300至600rpm攪拌，以Struktol控制消泡及溫度為42°C。培養(yǎng)時(shí)間為4天。培養(yǎng)后的細(xì)胞及其它固體經(jīng)離心去除。在酶純化方面，ALK04261于10升的生物反應(yīng)器中(Braun Biostat ED, Braun, Melsungen，德國)生長于下列培養(yǎng)基中，克/升Solka Floc纖維素30、酒糟10、斯佩爾特燕麥木聚糖5、碳酸鈣2、豆粉10、小麥麩皮3. 0、硫酸銨5、磷酸二氫鉀5、七水硫酸鎂0. 5、氯化鈉0. 5、硝酸鉀0. 3、微量元素溶液#10. 5及微量元素溶液#20. 5。pH值范圍為5. 2士0. 2(氨氣/硫酸)，通氣量lvvm，以200至600rpm攪拌，以Mruktol控制消泡及溫度為42°C。培養(yǎng)時(shí)間為5天。第二批以類似條件生長，除了 Solka Floc添加至40 克/升及酒糟加至15克/升。上清液經(jīng)離心回收，且通過kitz-K150及EK濾紙0^11 SeitzSchenkFiltersystems GmbH,Bad Kreuznach, ) iliit。tMilififUffl Pellicon微細(xì)超過濾系統(tǒng)(濾紙 NMWL IOkDa ；Millipore, Billerica, MA, USA)濃縮約 10 倍。在酶純化方面，ALK04265亦于10升的生物反應(yīng)器中(Braun Biostat ED，Braun， Me 1 simgen，德國)在與上述相同的培養(yǎng)基中生長，除了磷酸二氫鉀添加至2. 5克/升。pH值范圍為5. 3士0. 3(氨氣/磷酸)，通氣量0. 6vvm,以500rpm攪拌，以Struktol控制消泡及溫度為43°C。培養(yǎng)時(shí)間為7天。上清液經(jīng)離心回收，且通過kitz-K150及EK濾紙過濾0^11 SeitzSchenk Filtersystems GmbH,Bad Kreuznach，德國)。之后上清液利用 Pellicon 微細(xì)超過濾系統(tǒng)(濾紙 NMWL IOkDa ；Millipore, Billerica, MA, USA)濃縮約 20 倍。實(shí)施例2.純化及表征來自嗜熱枝頂孢菌ALK04245及嗜熱毛殼菌ALKO似65的纖維二糖水解酶嗜熱枝頂孢菌ALK04245及嗜熱毛殼菌ALK04265按實(shí)施例1所述生長。主要的纖維二糖水解酶利用對(duì)氨基芐基1-硫基-β -纖維二糖苷-基親和柱純化，按Tomme等.， 1988所述制備。培養(yǎng)上清液先緩沖成50毫摩爾的乙酸鈉緩沖液ρΗ5. 0，含1毫摩爾δ -葡萄糖酸內(nèi)酯及0.1摩爾葡萄糖以阻止β-葡萄糖苷酶存在時(shí)配體水解。纖維二糖水解酶以0.1 摩爾乳糖洗脫，且最后利用 AKTA 系統(tǒng) Amersham Pharmacia Biotech)的 Superdex 200HR 10/30柱(，以凝膠過濾色譜法純化。凝膠過濾法中所使用的緩沖液為50毫摩爾磷酸鈉 pH7. 0，其包含0. 15摩爾氯化鈉。純化的纖維二糖水解酶以SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，且根據(jù)分子量標(biāo)準(zhǔn) (低分子量校正試劑盒，Amersham Biosciences)評(píng)估的兩個(gè)蛋白質(zhì)的分子量均被確定為約70kDa。純化的枝頂孢菌及毛殼菌纖維二糖水解酶遵照Henrissat等人的方案(1998) (Henrissat, 1991 ；Henrissat 和 Bairoch，1993)，分別被命名為 At Cel7A 及 Ct Cel7A。該制劑的比活度利用4-甲基傘形酮基-β-D-乳糖苷(MUL)、4_甲基傘形酮基-β-D-纖維二糖苷(MUG》或4-甲基傘形酮基-β-D-纖維三糖苷(MUG!3)作為底物 (van Tilbeurgh等，1988)，于0. 05摩爾檸檬酸鈉緩沖液pH5中于50°CT 10分鐘測(cè)定的。 內(nèi)切葡聚糖酶及木聚糖酶活性利用羧甲基纖維素(CMC)及樺木葡糖醛酸木聚糖(Bailey 等.，199 作為底物，以標(biāo)準(zhǔn)程序(根據(jù)IUPAC，1987)測(cè)定。根據(jù)與底物及0. 25微摩爾酶劑量于50°C、pH5.0進(jìn)行M小時(shí)反應(yīng)所形成的還原糖，計(jì)算對(duì)Avicel的比活度。根據(jù) Lowry等，1951所述測(cè)量純化酶制劑的蛋白質(zhì)含量。為了表征水解的終產(chǎn)物，以高效液相色譜(Dionex)分析如上述于M小時(shí)水解試驗(yàn)中釋出的可溶性糖。里氏木霉經(jīng)純化的纖維二糖水解酶I (CBHI/Cel7A)被當(dāng)作參比。該純化的酶及里氏木霉CBHI/Cel7A的比活度列于表1。與里氏木霉CBHI/Cel7A 比較，純化的At Cel7A及Ct Cel7A纖維二糖水解酶對(duì)于小的合成性底物具有較高的比活度。本文所公開的酶對(duì)Avicel明顯具有較高的比活度。純化的酶制劑對(duì)木聚糖及CMC的低活性可以是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)本身的性質(zhì)，或至少部分是因?yàn)闅堄嗟纳倭课廴拘悦?。所有純化的酶水解纖維素的主要終產(chǎn)物為纖維二糖，其對(duì)纖維二糖水解酶是典型的。表1.純化的纖維二糖水解酶及里氏木霉的參比酶的比活度(nkat/毫克)(50°C， ρΗ5· 0二4 小時(shí))
19
權(quán)利要求
1.一種纖維二糖水解酶多肽，其包含具有纖維素分解活性的片段，且選自a)包含至少與SEQID NO 4具有66%同一性或與SEQ ID NO 6具有79%同一性的氨基酸序列的多肽；b)包含具有纖維素分解活性片段的a)的變異體；及c)具有纖維素分解活性的a)或b)的片段。
2.權(quán)利要求1的多肽，其包含a)與SEQID NO :4或6具有至少80%同一性的氨基酸序列；b)包含具有纖維二糖水解酶活性的片段的a)的變異體；或c)具有纖維二糖水解酶活性的a)或b)的片段。
3.一種分離的多核苷酸，選自a)SEQ ID NO :3或5的核苷酸序列，或編碼權(quán)利要求1的多肽的序列；b)a)的互補(bǔ)鏈；c)包含至少20個(gè)核苷酸的a)或b)的片段；及d)由于基因密碼而與a)、b)或c)所定義的任一序列簡并的序列。
4.權(quán)利要求3的多核苷酸，其具有SEQID NO :3或5所包含的序列。
5.權(quán)利要求3的多核苷酸，其包含選自登錄號(hào)DSM167 和DSM167^的微生物所包含的基因。
6.一種載體，其包含作為異源性序列的權(quán)利要求3至5中任一項(xiàng)的多核苷酸。
7.權(quán)利要求6的載體，其能夠表達(dá)權(quán)利要求1的多肽。
8.一種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求6的載體。
9.權(quán)利要求8的宿主細(xì)胞，其能夠表達(dá)由異源性多核苷酸序列所編碼的多肽。
10.權(quán)利要求9的宿主細(xì)胞，其是木霉屬或曲霉屬的菌株。
11.一種大腸桿菌(Escherichia coli)菌株，其登錄號(hào)為DSM 167 或DSM 16729。
12.—種酶制劑，其包含權(quán)利要求1的多肽。
13.權(quán)利要求12的酶制劑，其是耗盡培養(yǎng)基、粉末、顆粒或液體的形式。
14.權(quán)利要求12或13的酶制劑，其包含纖維二糖水解酶、內(nèi)切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶及任選的木聚糖酶活性和/或其它酶活性。
15.權(quán)利要求12至14中任一項(xiàng)的酶制劑，其進(jìn)一步包含傳統(tǒng)添加劑。
16.權(quán)利要求12的酶制劑，包含纖維二糖水解酶、內(nèi)切葡聚糖酶及β-葡萄糖苷酶，其中所述纖維二糖水解酶包含與SEQ ID NO :4或6或與其酶活性片段具有至少80%同一性的氨基酸序列。
17.權(quán)利要求16的酶制劑，其中所述纖維二糖水解酶可得自嗜熱枝頂孢菌。
18.權(quán)利要求17的酶制劑，其中所述纖維二糖水解酶可得自嗜熱枝頂孢菌CBS 116240ο
19.權(quán)利要求16的酶制劑，其中所述酶是重組酶，優(yōu)選在木霉屬或曲霉屬的菌株中產(chǎn)生。
20.權(quán)利要求16的酶制劑，其中所述內(nèi)切葡聚糖酶包含與SEQIDNO 10、12、14或16或與其酶活性片段具有至少80%同一性的氨基酸序列。
21.權(quán)利要求20的酶制劑，其中所述內(nèi)切葡聚糖酶可得自金黃色嗜熱子囊菌、嗜熱枝頂孢菌或嗜熱毛殼菌，優(yōu)選得自金黃色嗜熱子囊菌CBS 116239、嗜熱枝頂孢菌CBS 116240 或嗜熱毛殼菌CBS 730.95。
22.權(quán)利要求16的酶制劑，其中所述β-葡萄糖苷酶包含與SEQ IDNO 22,24或沈或與其酶活性片段具有至少80%同一性的氨基酸序列。
23.權(quán)利要求22的酶制劑，其中所述β-葡萄糖苷酶可得自金黃色嗜熱子囊菌、嗜熱枝頂孢菌或嗜熱毛殼菌，優(yōu)選得自金黃色嗜熱子囊菌CBS 116239、嗜熱枝頂孢菌CBS 116240 或嗜熱毛殼菌CBS 730.95。
24.權(quán)利要求16-23任一項(xiàng)的酶制劑，包含至少一種其他酶，優(yōu)選為木聚糖酶，所述木聚糖酶優(yōu)選包含與SEQ ID NO: 18或20或與其酶活性片段具有至少80%同一性的氨基酸序列。
25.權(quán)利要求對(duì)的酶制劑，其中所述木聚糖酶可得自金黃色嗜熱子囊菌或嗜熱枝頂孢菌，優(yōu)選得自金黃色嗜熱子囊菌CBS 116239或嗜熱枝頂孢菌CBS 116240.
26.權(quán)利要求16-25任一項(xiàng)的酶制劑，其中至少一種酶由登錄號(hào)DSM16723、DSM 16728、DSM 16729、DSM 16727、DSM 17326、DSM17324、DSM 17323、DSM 17729、DSM 16724、 DSM 16726、DSM 16725、DSM 17325或DSM 17667的微生物中包含的基因編碼。
27.根據(jù)權(quán)利要求1的多肽或根據(jù)權(quán)利要求12的酶制劑在燃料、紡織、清潔劑、紙漿和造紙、食品、飼料或飲料工業(yè)中的用途。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的用途，其中所述酶用于處理牛皮紙漿、機(jī)械紙漿或回收紙。
29.權(quán)利要求觀的用途，其中所述酶制劑是耗盡培養(yǎng)基。
30.根據(jù)權(quán)利要求16至沈中任一項(xiàng)的酶制劑在分解纖維素材料中的用途。
31.權(quán)利要求30的用途，其中所述纖維素材料選自玉米桿、柳枝稷、谷類禾桿、甘蔗渣和木材衍生材料。
32.—種制備多肽的方法，所述多肽包含具有纖維素分解活性的片段且選自a)包含至少與SEQID NO 4具有66%同一性或與SEQ ID NO 6具有79%同一性的氨基酸序列的多肽；b)包含具有纖維素分解活性片段的a)的變異體；及c)具有纖維素分解活性的a)或b)的片段，所述方法包含用編碼所述多肽的載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并于能夠表達(dá)所述多肽的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，及任選回收并純化所生產(chǎn)的多肽。
33.一種以至少一種能夠產(chǎn)生多肽的微生物的耗盡培養(yǎng)基處理纖維素材料的方法，所述多肽包含具有纖維素分解活性的片段且選自a)包含至少與SEQID NO 4具有66%同一性或與SEQ ID NO 6具有79%同一性的氨基酸序列的多肽；b)包含具有纖維素分解活性片段的a)的變異體；及c)具有纖維素分解活性的a)或b)的片段，所述方法包含令纖維素材料與耗盡培養(yǎng)基反應(yīng)以得到水解的纖維素材料。
34.一種以纖維二糖水解酶、內(nèi)切葡聚糖酶及葡萄糖苷酶處理纖維素材料的方法， 其中所述纖維二糖水解酶包含與SEQ ID NO :4或6，或與其酶活性片段具有至少80%同一性的氨基酸序列。
35.權(quán)利要求34的方法，其中所述內(nèi)切葡聚糖酶包含與SEQIDNO :10、12、14或16或與其酶活性片段具有至少80%同一性的氨基酸序列。
36.權(quán)利要求34的方法，其中所述β-葡萄糖苷酶包含與SEQ IDNO -.22,24或沈或與其酶活性片段具有至少80%同一性的氨基酸序列。
37.權(quán)利要求34-36任一項(xiàng)的方法，其中所述纖維素材料是木質(zhì)纖維素材料。
38.權(quán)利要求34-37任一項(xiàng)的方法，包括以至少一種其他酶，優(yōu)選木聚糖酶，處理木質(zhì)纖維素，所述木聚糖酶優(yōu)選包含與SEQ ID NO: 18或20或與其酶活性片段具有至少80%同一性的氨基酸序列。
39.權(quán)利要求34-38任一項(xiàng)的方法，其中所述酶同時(shí)或相繼加入至纖維素材料。
40.權(quán)利要求34的方法，其中所述纖維素材料選自玉米桿、柳枝稷、谷類禾桿、甘蔗渣和木材衍生材料。
41.權(quán)利要求30-40任一項(xiàng)的方法在從纖維素材料制備乙醇的方法中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及纖維素材料的處理和用于其中的酶。具體涉及從纖維素材料中生產(chǎn)糖水解物。該方法可用于例如生產(chǎn)可發(fā)酵糖用于從木質(zhì)纖維素材料中生產(chǎn)生物乙醇。本發(fā)明描述了纖維素水解酶及其通過重組技術(shù)的生產(chǎn)，以及所述酶及酶制劑的用途。
文檔編號(hào)C12N9/42GK102174492SQ20111002150
公開日2011年9月7日 申請(qǐng)日期2006年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月22日
發(fā)明者亞爾諾·卡利奧, 亞里·韋赫曼佩雷, 利薩·維卡里, 啼姆·哈羅內(nèi), 桑尼·沃蒂萊內(nèi), 泰爾?！て绽瓕? 瑪麗卡·阿拉普拉內(nèi)恩, 薩圖·胡曼, 馬蒂·西伊卡-阿霍 申請(qǐng)人:羅爾公司