專利名稱：一種短肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物科學(xué)和藥物載體領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
基因治療以及其他藥物治療目前一個重要的困難是缺乏安全有效的載體能把藥物靶向運輸?shù)教囟ㄎ恢貌⑦M(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部發(fā)揮作用。為了達(dá)到這個目的，以基因治療為例，研究者開發(fā)了多種運輸載體。由于病毒載體存在的安全性以及操作復(fù)雜性等問題，非病毒載體的研究也受到了較大重視。常見的非病毒載體包括脂質(zhì)體和陽離子多聚物等。脂質(zhì)體是目前運載效率最高的基因載體之一，對血清的穩(wěn)定性也較好，使用方便。 但是其毒性較大，在活體研究中發(fā)現(xiàn)其會在肺部聚集并造成炎癥，并且與DNA包裹形成的顆粒粒徑較大(>500nm),不利于進(jìn)入腫瘤組織發(fā)揮作用。典型高效的陽離子多聚物比如聚乙烯亞胺(PEI)等，效率和毒性均較脂質(zhì)體低。研究表明PEI連接上PEG或經(jīng)其他一些修飾后毒性會顯著下降或者效率有所增強(qiáng)，但是毒性依然不能忽略。陽離子多聚物與DNA包裹形成的顆粒粒徑也一般在IOOnm以上，同樣不利于進(jìn)入腫瘤組織發(fā)揮作用。與脂質(zhì)體一樣，陽離子多聚物同樣不具有靶向性。為了解決這一問題，研究者在脂質(zhì)體以及陽離子多聚物等表面加入了一些具有靶向性的分子對其進(jìn)行修飾。與前面所敘述的大分子相比，小分子肽在生物組織中的穿透性更佳，毒性較低，合成上也更為容易。靶向肽已經(jīng)被研究可以被特定細(xì)胞識別，由受體介導(dǎo)的方式進(jìn)入細(xì)胞，并且可以共價連接上其他藥物分子將其運輸?shù)教囟?xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用。細(xì)胞穿膜肽(cell-penetrating peptides, CPP)也稱蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域發(fā)源于人免疫缺損病毒HIV-I編碼的TAT蛋白衍生物和果蠅觸角同源異型的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白 (Antennapedia)，目前已經(jīng)發(fā)展有各種形式，包括多聚精氨酸，非天然肽，擬肽，胍基端聚合物等，主要特征是側(cè)鏈有著一定數(shù)目陽離子。據(jù)研究表明細(xì)胞穿膜肽可以攜帶多種物質(zhì)，包括親水性蛋白、多肽、DNA等物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞，但是主要以共價連接為主，本身鮮有直接包裹藥物進(jìn)入細(xì)胞的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是解決上述問題而提供了一種可靶向轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞的短肽，該短肽可以對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行靶向性的轉(zhuǎn)染。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是
一種短肽，其氨基酸殘基序列為序列表中SEQ ID NO. 1所述。該短肽能對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行靶向性的轉(zhuǎn)染。本發(fā)明具有以下優(yōu)點
本發(fā)明的短肽可以對腫瘤細(xì)胞以及惡性腫瘤細(xì)胞靶向性的轉(zhuǎn)染，解決了脂質(zhì)體和陽離子多聚物等手段的靶向性問題以及毒性較大的問題，彌補(bǔ)了細(xì)胞穿膜肽或者靶向肽作為載體時一般需要與藥物分子共價連接的缺陷。該短肽包裹質(zhì)粒DNA進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后，質(zhì)粒DNA 能在腫瘤中穩(wěn)定表達(dá)。該短肽雖然在效率上較目前市面效率最好的載體之一脂質(zhì)體弱，但是在毒性上有明顯減弱、選擇性上有顯著增強(qiáng)。另外此短肽合成簡單，成本低廉，適合商業(yè)普及，具有競爭力的性價比。同時該短肽具有血清穩(wěn)定性以及較低的納米粒徑，為基因或者藥物在活體內(nèi)的靶向性提供了便利。在系統(tǒng)給藥的科學(xué)研究中，很多藥物被細(xì)胞攝取后被限制在了囊泡中而不能發(fā)揮全部的作用，此短肽中的rRrRrRrRr序列被證明可以攜帶貨物分子突破囊泡限制進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中使其發(fā)揮更好的作用。綜上，此短肽也可作為在體基因治療以及靶向性給藥的良好研究工具。


下面結(jié)合附圖和實施方式對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。圖1為不同N/P比的p20包裹質(zhì)粒DNA進(jìn)行瓊脂糖電泳圖2為不同N/P比的p20包裹質(zhì)粒DNA形成顆粒的kta電位測量圖； 圖3為混合物顆粒的粒徑測量圖4為p20在不同N/P比下轉(zhuǎn)染5-8F細(xì)胞結(jié)果的顯微鏡圖； 圖5為p20在不同N/P比下轉(zhuǎn)染SK0V-3細(xì)胞結(jié)果的顯微鏡圖； 圖6為p20在N/P比為6:1條件下包裹pEGFP-Nl進(jìn)入5-8F、SK0V-3、MCF_7和HeLa細(xì)胞并表達(dá)的激光共聚焦成像圖7為利用流式細(xì)胞儀檢測p20在N/P比為6:1條件下包裹pEGFP-Nl進(jìn)入5-8F、 SK0V-3、MCF-7和HeLa細(xì)胞并表達(dá)的檢測顯示圖8為MTT檢測p20以及脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞毒性實驗的結(jié)果顯示圖。
具體實施例方式本發(fā)明的短肽由陽離子細(xì)胞穿膜肽，連接序列和靶向肽序列組成的短肽，并利用固相化學(xué)合成，該短肽的氨基酸序列為rRrRrRrRrHHHHLTVSPWY(簡稱p20)，其中rRrRrRrRr 為陽離子細(xì)胞穿膜肽，起到包裹質(zhì)粒DNA或者其他藥物的作用，HHHH為連接序列，起連接以及消除空間位阻作用，LTVSPffY為靶向肽，起富集到靶向細(xì)胞并被其攝取的作用。觀察p20對質(zhì)粒DNA的包裹
首先用P20對質(zhì)粒DNA進(jìn)行包裹，N代表肽鏈的正電荷，P代DNA的負(fù)電荷。圖1為是不同N/P比混合p20以及質(zhì)粒DNA瓊脂糖凝膠電泳圖，從圖中可見從N/P比為3:1開始， DNA已經(jīng)基本完全被結(jié)合。圖2為以不同N/P比混合p20以及質(zhì)粒DNA形成的混合物顆粒的kta電位測量圖，當(dāng)N/P比約為5以上時，p20和質(zhì)粒DNA形成的混合顆粒的kta電位已經(jīng)基本穩(wěn)定成為了 +25mV左右。圖3為混合物顆粒的粒徑測量圖，當(dāng)N/P比約為5以上時，p20和質(zhì)粒DNA形成的混合顆粒的直徑已經(jīng)基本穩(wěn)定在了 SOnm左右。結(jié)果顯示p20能與質(zhì)粒DNA形成粒徑更小的顆粒，有利于被腫瘤組織吸收。kta電位以及粒徑測量儀器 Malvern Zetasizer0
p20轉(zhuǎn)染細(xì)胞后激光共聚焦成像
從四種細(xì)胞(5-8F、SK0V-3、MCF-7和HeLa)接種相同數(shù)目Qxl04 cells/well)的細(xì)胞于Lab-Tek 8孔板。37°C、5% C02環(huán)境下培養(yǎng)過夜，使細(xì)胞重新貼壁。使用p20按N/P比 3 1，6 1，9 1，12 1和15 1混合在正常含血清培養(yǎng)基環(huán)境下攜帶pEGFP-Nl進(jìn)入細(xì)胞，4小時后換上新鮮培養(yǎng)基二4小時后使用激光共聚焦顯微鏡觀察。成像條件所有細(xì)胞樣品通過共聚焦顯微鏡FV1000觀察。pEGFP-Nl所表達(dá)的綠色熒光蛋白由Ar激光器在488 nm處激發(fā)，在495-555 nm接收。共聚焦顯微鏡型號FV1000 (Olympus, Japan)。其孵育細(xì)胞后激光共聚焦成像的顯示圖見附圖4、圖5和圖6。其中圖4表示p20 在不同N/P比下轉(zhuǎn)染5-8F細(xì)胞的結(jié)果，圖5表示p20在不同N/P比下轉(zhuǎn)染SK0V-3細(xì)胞的結(jié)果，圖6表示p20在N/P比為6:1的條件下轉(zhuǎn)染4種不同細(xì)胞的結(jié)果。從圖4至圖6可知，當(dāng)N/P比為6:1，5-8F細(xì)胞和SK0V-3細(xì)胞都有一定量的綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)。
流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率實驗
從四種細(xì)胞(5-8F、SK0V-3、MCF-7和HeLa)接種相同數(shù)目(1x105 cells/well)的細(xì)胞于M孔板。使用P20按N/P比6:1混合攜帶pEGFP-Nl進(jìn)入細(xì)胞，脂質(zhì)體則按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。4小時后換上新鮮培養(yǎng)基，24小時后使用流式細(xì)胞儀檢測。流式細(xì)胞儀型號EpicsXL (Beckman - Coulter)。分析軟件WinMdi。從圖7可知p20可以運載pEGFP進(jìn)入5-8F (約30%)以及SK0V-3 (約10%)細(xì)胞中有表達(dá)，但是在MCF-7以及HeLa細(xì)胞中則沒有明顯表達(dá)(約1%)，證明了 p20能對5-8F和 SK0V-3等惡性腫瘤細(xì)胞進(jìn)行靶向性的轉(zhuǎn)染。MTT檢測細(xì)胞毒性實驗
從同一批次原代5-8F細(xì)胞接種相同數(shù)目(5x103 cells/well)的細(xì)胞于96孔板。37°C、5% C02環(huán)境下培養(yǎng)過夜，使細(xì)胞重新貼壁。37°C，5% C02環(huán)境下，分別使用 p20在6 1的N/P比下以及使用脂質(zhì)體Neofectin轉(zhuǎn)染5-8F細(xì)胞，24小時后加入MTT ((3-4, 5-dimethylthiazol-2-yl) - 2, 5 - diphenyltetrazolium, 5 mg/mL) 。2
小時。丟棄所有孵育溶液，加入200 μ L DMS0。通過酶標(biāo)儀在570 nm下檢測各孔的吸收值。每組實驗重復(fù)三次。酶標(biāo)儀型號:ELISA Reader Genios Plus (Tecan, Switzland )。通過MTT檢測p20和脂質(zhì)體Neofectin的細(xì)胞毒性，如圖8所示。p20在上條件下對細(xì)胞的毒性(細(xì)胞存活率92%)比脂質(zhì)體(細(xì)胞存活率76%)顯著要低，說明p20相對脂質(zhì)體有著較低的細(xì)胞毒性。**代表p<0.01。以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。
權(quán)利要求
1.一種短肽，其特征在于，它的氨基酸殘基序列為序列表中SEQ ID NO. 1所述。
2.—種權(quán)利要求1所述的短肽應(yīng)用，其特征在于，所述短肽能對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行靶向性的轉(zhuǎn)染。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種短肽及其應(yīng)用，屬于生物科學(xué)和藥物載體領(lǐng)域。所述短肽由陽離子細(xì)胞穿膜肽連接序列和靶向肽序列組成，它的氨基酸殘基序列為序列表中SEQIDNO.1所述。該短肽可以對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行靶向性的轉(zhuǎn)染。
文檔編號C12N15/63GK102153629SQ201110022308
公開日2011年8月17日 申請日期2011年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月20日
發(fā)明者張玉慧, 駱清銘, 龔鋮 申請人:華中科技大學(xué)