專利名稱：沙門氏菌微量mpn檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用微量培養(yǎng)基培養(yǎng)和鑒別沙門氏菌，并根據(jù)MPN方法進(jìn)行樣品中沙門氏菌快速定量檢測，屬微生物培養(yǎng)與檢測領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
1885年沙門氏等在霍亂流行時分離 到豬霍亂沙門氏菌，故定名為沙門氏菌屬，沙門氏菌屬腸道細(xì)菌科，包括那些引起食物中毒，導(dǎo)致胃腸炎、傷寒和副傷寒的細(xì)菌，它們有的專對人類致病，有的只對動物致病，也有對人和動物都致病。沙門氏菌病則是指由各種類型沙門氏菌所引起的對人類、家畜以及野生禽獸不同形式的總稱，它是公共衛(wèi)生學(xué)上具有重要意義的人畜共患病之一，人畜感染后可呈無癥狀帶菌狀態(tài)，也可表現(xiàn)為有臨床癥狀的致死疾，它可能加重病態(tài)或死亡率，或者降低動物的繁殖生產(chǎn)力。據(jù)統(tǒng)計在世界各國的種類細(xì)菌性食物中毒中，沙門氏菌引起的食物中毒常列榜首。我國內(nèi)陸地區(qū)也以沙門氏菌為首位。自19世紀(jì)后期，沙門氏菌首次被鑒定為人類的一種病原以來，檢測方法學(xué)都是建立在采取感染病人的糞便或血液作為臨床病料的基礎(chǔ)上。此后的60年間，用于從食品中分離沙門氏菌的方法實(shí)質(zhì)上與那些用于臨床病料的方法是相同的。但至少有三個因素限制了用于臨床病料的方法應(yīng)用在食品分析上。第一，通常，沙門氏菌的含量水平在污染食品中比有感染病人的病料中要低很多；第二，食品本身的性質(zhì)會干擾病原的檢測，例如，某些食品中固有菌群可能處在一個很高的水平，從而影響特定細(xì)菌的選擇性分離和鑒定；第三，與臨床病料不同的是，經(jīng)過加工的食品，由于加熱、干燥、高含鹽量、酸和冷凍等因素的作用，其中的沙門氏菌受到了尚不致命的損傷或稱“致傷”。這就形成了一個具有不同生長特性的細(xì)菌群。這種現(xiàn)象對那些希望從食物樣品中分離出沙門氏菌的食品分析家來說有很大影響，因?yàn)樵谶x擇培養(yǎng)基上直接培養(yǎng)“致傷”的沙門氏菌通常是以細(xì)菌死亡和試驗(yàn)失敗而告終。為克服這些困難，人們建立了一種簡單的微生物增殖步驟，專門針對以食品為傳播載體的病原。雖然這些方法本身證明是可靠的，但卻很費(fèi)力、耗時，需要3 5天才能完成。用于沙門氏菌分析的傳統(tǒng)方法是食物樣品分步增菌，以增加病原的可檢出率，這種培養(yǎng)方法總體可分4個不同階段或步驟。第一步(預(yù)增菌)，將樣品加到一種高營養(yǎng)、無選擇性的培養(yǎng)基中，溫度37°C，使那些“致傷”的細(xì)菌復(fù)蘇及使所有微生物生長。雖然緩沖胨水被建議常規(guī)使用(由于其可保持溶液PH值穩(wěn)定)，但對培養(yǎng)基的選擇仍存有爭論。第二，是選擇性增菌步驟，它使沙門氏菌生長而使肉湯中同時存在的微生物數(shù)量減少，與預(yù)增菌培養(yǎng)基相似，對選擇性培養(yǎng)基的選擇，也存在許多不同的觀點(diǎn)。目前應(yīng)用的主要有如下3種類型連四硫基鹽肉湯(Tetrathionate broth)、硒酸鹽胱氨酸肉湯(Selenitecystinebroth)和RV(Rappaport-Vassiliadis)培養(yǎng)基。由于沒有任何一種培養(yǎng)基可以全面地保持所有食品基質(zhì)或各種沙門氏菌血清型，所以，較適當(dāng)?shù)淖龇ň褪鞘褂脙煞N培養(yǎng)基平行地進(jìn)行試驗(yàn)。第三步是分離步驟，即選擇性培養(yǎng)物在含一種或多種抑制非沙門氏菌生長制劑的瓊脂平板上劃線培養(yǎng)，然后對平板上肉眼可見的特征性菌落進(jìn)行確認(rèn)，并對該菌落分離物進(jìn)行一系列生化和血清學(xué)檢測，以作出鑒定。傳統(tǒng)沙門氏菌檢測法全過程需時至少7 10天，才能得出明確的診斷結(jié)果。以上傳統(tǒng)的檢測方法即為GB4789. 4-2010是目前我國規(guī)定的對食品中沙門氏菌的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法，主要是根據(jù)沙門氏菌的生化特性，進(jìn)行前增菌、選擇性增菌、分離培養(yǎng)、生化鑒定和血清分型五個步驟。步驟繁瑣，所耗時間較長，給食品檢驗(yàn)工作帶來很多不便。近年來也出現(xiàn)很多新的檢測方法分子生物學(xué)方法、免疫學(xué)檢測方法以及噬菌體裂解試驗(yàn)、葡萄球菌A蛋白協(xié)凝試驗(yàn)法、4-甲基傘形酮辛酯(MUCAP)試劑檢測方法、電阻抗法等等，但這些方法也存在成本較高、技術(shù)較難、不便于推廣等缺陷。而涉及到沙門氏菌定量檢測的就比較少了，主要就是平板計數(shù)法和傳統(tǒng)MPN法。平板計數(shù)法是利用沙門氏菌顯色培養(yǎng)基或XLD瓊脂等，取樣品液直接涂布，培養(yǎng)24-48小時后，計數(shù)典型沙門氏菌菌落，并進(jìn)行生化鑒定和血清學(xué)鑒定，主要缺點(diǎn)是對于樣品中沙門氏菌含量比較少時，無法計數(shù)或計數(shù)結(jié)果相差太大，即靈敏度太低。傳統(tǒng)沙門氏菌MPN計數(shù)法是9管法，即取三個連續(xù)樣品稀釋度，每個稀釋度三個重復(fù)，用9管TTB或SC增菌18-24小時，然后分別接種于沙門氏菌顯色培養(yǎng)基平板或XLD瓊脂平板，挑取可疑菌落鑒定后查MPN表。此法靈敏度可以，但是操作復(fù)雜繁瑣，需準(zhǔn)備大量試管、平皿等耗材，特別是樣品量大時，需要大量人力和物力。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，本發(fā)明目的在于提供一種改良的MPN檢測方法，以便快速、準(zhǔn)確地檢測出食品中沙門氏菌的污染程度。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明通過改變培養(yǎng)基成份把傳統(tǒng)的MPN檢測方法中的多個實(shí)驗(yàn)單元整合在一起，利用2塊12孔細(xì)菌培養(yǎng)板(4個梯度，3個重復(fù))進(jìn)行增菌、培養(yǎng)、檢測，舍棄了傳統(tǒng)的9管法，極大的減少了工作量，解決了傳統(tǒng)沙門氏菌定量檢測耗時長、工作量大的問題。技術(shù)方案包括如下步驟(1)在12孔細(xì)菌培養(yǎng)板中加入適量改良TSB，然后將待測樣品接入孔中進(jìn)行增菌，采用三個以上連續(xù)梯度稀釋，三次重復(fù)試驗(yàn)，利用增菌液的高營養(yǎng)，使那些“致傷”的細(xì)菌復(fù)蘇、使所有微生物生長；(2)在另一 12孔細(xì)菌培養(yǎng)板中加入適量改良MSRV，將步驟⑴增菌后的樣品液對應(yīng)接到孔中，過夜培養(yǎng)，根據(jù)樣品的顯色情況以及細(xì)菌遷移情況初步判斷樣品中是否含有沙門氏菌，之后利用顯色培養(yǎng)基和生化試驗(yàn)進(jìn)行確認(rèn)；(3)將最終確認(rèn)的陽性情況利用MPN軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，得到樣品中所含沙門氏菌的最大可能數(shù)量。具體步驟如下(I)配制改良TSB，滅菌后將其加入細(xì)菌培養(yǎng)板的12個孔中，然后取適量待測樣品分別加入Al、BI、Cl，移液槍吹打混勻，吸取其500 ii L于A2、B2、C2，移液槍吹打混勻，以此類推，各做3組平行，36°C過夜培養(yǎng)。(2)配制改良MSRV，煮沸滅菌后將其加入另一細(xì)菌培養(yǎng)板的12個孔中，待其凝固后，將步驟(I)增菌后的樣品液20yL分別對應(yīng)加入到每個孔中，42°C培養(yǎng)24h。當(dāng)顏色變?yōu)樽仙页霈F(xiàn)遷移現(xiàn)象的，視為陽性，其他視為陰性。陽性孔挑取紫色遷移菌落，接種于沙門氏菌顯色培養(yǎng)基，再進(jìn)行TSI/LIA/尿素和A-F-O血清試驗(yàn)，確認(rèn)陽性樣品。(4)利用MPN軟件對陽性情況進(jìn)行統(tǒng)計分析，得到樣品中所含沙門氏菌的最大可、能數(shù)量。改良TSB配方TSB30g/L ；土溫 80 (Tween 80)0. 5g/L ；改良MSRV配方MgCl25-8g/L ；酸水解酪蛋白4-10g/L;
大豆胨2-10g/L ；蛋白胨2-10g/L;NaCl5_8g/L ；KH2PO4I. 5g/L ；孔雀綠草酸鈉0. 04g/L ；抗生素0. Olg/L ；顯色劑0. 1-0. 8g/L ；瓊脂3_5g/L ；本發(fā)明有益效果是采用兩塊12孔細(xì)菌培養(yǎng)板，兩種改良培養(yǎng)基，兩個步驟，三大時間，快速、準(zhǔn)確、簡便地檢測出食品中沙門氏菌的含量，并且當(dāng)食品中沙門氏菌含量較低時，具有很好的靈敏度。


圖I為本發(fā)明所述12孔細(xì)菌培養(yǎng)板結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為本發(fā)明所述20h時，沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌和混合菌增菌液效果照片；其中2-1為沙門氏菌三組平行增菌效果照片，2-2為鼠傷寒沙門氏菌三組平行增菌效果照片，2-3為沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌混合菌液增菌效果照片。圖3為本發(fā)明所述24h時，沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌和混合菌液增菌效果照片；其中3-1沙門氏菌三組平行增菌效果照片，3-2鼠傷寒沙門氏菌三組平行增菌效果照片，
3-3為沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌混合菌液增菌效果照片。圖4為本發(fā)明所述48h時，沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌和混合菌液增菌效果照片；其中4-1沙門氏菌三組平行增菌效果照片，4-2鼠傷寒沙門氏菌三組平行增菌效果照片，
4-3為沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌混合菌液增菌效果照片。圖5為本發(fā)明所述7 時，沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌和混合菌液增菌效果照片；其中5-1沙門氏菌三組平行增菌效果照片，5-2鼠傷寒沙門氏菌三組平行增菌效果照片，
5-3為沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌混合菌液增菌效果照片。圖6為本發(fā)明所述沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌和混合菌液在沙門氏菌顯色板上劃線，36°C培養(yǎng)60h后各菌生長情況照片。其中6-1為沙門氏菌效果照片，6-2為鼠傷寒沙門氏菌效果照片，6-3、6-4為沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌很合菌液外圍遷移效果照片，6-5、6-6為沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌混合菌液內(nèi)圈菌落效果照片，6-7為沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌混合菌液落邊緣線效果照片。
具體實(shí)施例方式采用下列實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不應(yīng)當(dāng)作對本發(fā)明的限制。實(shí)施例(I)配制改良TSB，滅菌后加入細(xì)菌培養(yǎng)板的12個孔中，Al、BI、Cl加2. 5ml，其余加 2ml。稀釋沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌至10_7，吸取100 U I分別加入上述A1、B1、C1孔中，混勻后吸取500iU于A2、B2、C2，以此類推。沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌各做3組平行。取沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌或產(chǎn)氣腸桿菌或阪崎腸桿菌或銅綠假單胞菌10211或陰溝腸桿菌的菌液各100 iil，混勻后進(jìn)行稀釋，至10_6，吸取100 分別加入上述A1、B1、Cl孔中，混勻后吸取500iil于A2、B2、C2，以此類推。做3組平行。以上均36°C培養(yǎng)16h。
取沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌的適宜梯度菌液各lOOiU，PCA傾注計數(shù)。以上36°C 培養(yǎng) 24h。 PCA傾注計數(shù)結(jié)果如下
—~菌種名！平行計數(shù)(適宜梯度取IOO(Ld)平均值
沙門氏菌
(1(廣)220243254239
194203213203.3
菌(10")(2)配制改良MSRV，煮沸滅菌后加入另一細(xì)菌培養(yǎng)板的12個孔中，每孔加2. 5ml。待其凝固后，將步驟(I)增菌后的樣品液20yL分別對應(yīng)加入到孔中，42°C培養(yǎng)24h。所述的對應(yīng)加入指兩培養(yǎng)板之間Al、BI、Cl相對應(yīng)，A2、B2、C2相對應(yīng)，以此類推。24h時，沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌有非常輕微的紫色，混合菌液紫色相對較明顯。見附圖3。MPN軟件計算得出沙門氏菌1(T6 菌液4500MPN/mL ；(沙門氏菌菌液4.5*109MPN/mL)鼠傷寒沙門氏菌1(T6菌液2200MPN/mL ；(鼠傷寒沙門氏菌菌液2.2*109MPN/mL)IO6混合菌液中沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌750MPN/mL ；(混合菌液中沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌7.5*108MPN/mL)PCA 計數(shù)沙門氏菌 1(T6 菌液2390cfu/mL ；(沙門氏菌菌液'2. 4*109cfu/mL)鼠傷寒沙門氏菌10_6菌液2033cfu/mL ；(鼠傷寒沙門氏菌菌液2.0*109cfu/mL)10_6混合菌液中沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌737MPN/mL ；(混合菌液中沙門氏菌和鼠傷寒沙門(7.4*108MPN/mL)
總體來說，MPN值與PCA計數(shù)很接近，說明配方改良較好。只是紫色邊緣情況不是很理想，繼續(xù)培養(yǎng)觀察。48h時，沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌有較明顯的紫色，混合菌液出現(xiàn)紫色邊緣，且比沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌都要更加明顯。(見圖4)72h時，沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、混合菌液的紫色均比較明顯，其中混合菌液遷移較慢，紫色更集中。(見圖5)挑取沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌和混合菌液的7個點(diǎn)，在沙門氏菌顯色板上劃線，36°C培養(yǎng)60h。(見圖6) 從上述微生物生長情況我們可以看出，在混合菌液中，沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌主要集中在外圈遷移，也就是說沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌的遷移速度是比較快的，這 跟單一純菌的遷移情況也一致。通過mini-MPN方法沙門氏菌的計數(shù)結(jié)果與加入的沙門氏菌計數(shù)結(jié)果基本一致。此發(fā)明可以用于樣品沙門氏菌計數(shù)。同時，此發(fā)明也可用副溶血性弧菌和0157菌的計數(shù)。所用改良TSB配方TSB30g/L ；土溫 80 (Tween80) 0. 5g/L ；所用改良MSRV配方MgCl28g/L ；酸水解酪蛋白 4g/L;大豆胨10g/L ；蛋白胨2g/L;NaCl8g/L ；KH2PO4I. 5g/L ；孔雀綠草酸鈉 0. 04g/L ；抗生素0. 01g/L ；顯色劑0. 8g/L ；瓊脂3g/L。所用TSB購于市品，由如下成分組成胰蛋白胨15.0g/L大豆蛋白胨3.0g/L氯化鈉5.0g/L磷酸氫二鉀2. 5g/L葡萄糖2. 5g/L。
權(quán)利要求
1.沙門氏菌微量MPN檢測方法，其特征在于，通過如下步驟(1)在12孔細(xì)菌培養(yǎng)板中分別加入改良的TSB，然后將待測樣品接入孔中進(jìn)行增菌，采用三個以上連續(xù)梯度稀釋，三次重復(fù)試驗(yàn)；(2)在另一 12孔細(xì)菌培養(yǎng)板中加入改良的MSRV，將步驟(I)增菌后的樣品液對應(yīng)接到孔中，過夜培養(yǎng)，根據(jù)樣品的顯色情況以及細(xì)菌遷移情況初步判斷樣品中是否含有沙門氏菌，之后利用顯色培養(yǎng)基和生化試驗(yàn)進(jìn)行確認(rèn)；(3)將最終確認(rèn)的陽性情況利用MPN軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，得到樣品中所含沙門氏菌的數(shù)量； 改良的TSB配方 TSB30g/L ； 土溫 800. 5g/L ； 改良的MSRV配方 MgCl25-8g/L ； 酸水解酪蛋白4-10g/L; 大豆胨2-10g/L ； 蛋白胨2-10g/L; NaCl5-8g/L ； KH2PO4I. 5g/L ； 孔雀綠草酸鈉0. 04g/L ； 抗生素0. 01g/L ； 顯色劑0. 1-0. 8g/L ； 瓊脂3-5g/L。
2.如權(quán)利要求I所述的沙門氏菌微量MPN檢測方法，其特征在于， 具體步驟如下(1)配制改良的TSB，滅菌后分別將其加入細(xì)菌培養(yǎng)板的12個孔中，然后取待測樣品分別加入到細(xì)菌培養(yǎng)板的A1、B1、C1孔中，移液槍吹打混勻，吸取其500 ii L分別加入到細(xì)菌培養(yǎng)板的A2、B2、C2孔中，移液槍吹打混勻，以此類推，各做3組平行，36°C過夜培養(yǎng)；(2)配制的改良MSRV，煮沸滅菌后將其加入另一細(xì)菌培養(yǎng)板的12個孔中，待其凝固后，將步驟(I)增菌后的樣品液20yL分別對應(yīng)加入到每個孔中，42°C培養(yǎng)24h;當(dāng)顏色變?yōu)樽仙页霈F(xiàn)遷移現(xiàn)象，視為陽性，其他視為陰性；陽性孔挑取紫色遷移菌落，接種于沙門氏菌顯色培養(yǎng)基，再進(jìn)行TSI/LIA/尿素和A-F-O血清試驗(yàn)，確認(rèn)陽性樣品； (4)利用MPN軟件對陽性情況進(jìn)行統(tǒng)計分析，得到樣品中所含沙門氏菌數(shù)量。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種沙門氏菌微量MPN檢測方法，涉及利用微量培養(yǎng)基培養(yǎng)和鑒別沙門氏菌，并根據(jù)MPN方法進(jìn)行樣品中沙門氏菌快速定量檢測，屬微生物培養(yǎng)與檢測領(lǐng)域。通過改變培養(yǎng)基成份把傳統(tǒng)的MPN檢測方法中的多個實(shí)驗(yàn)單元整合在一起，利用2塊12孔細(xì)菌培養(yǎng)板(4個梯度，3個重復(fù))進(jìn)行增菌、培養(yǎng)、檢測，舍棄了傳統(tǒng)的9管法，極大的減少了工作量，解決了傳統(tǒng)沙門氏菌定量檢測耗時長、工作量大的問題。能簡便地檢測出食品中沙門氏菌的含量，并且當(dāng)食品中沙門氏菌含量較低時，具有很好的靈敏度。
文檔編號C12Q1/06GK102732595SQ201110022319
公開日2012年10月17日 申請日期2011年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月12日
發(fā)明者廖興廣, 鄒長軍 申請人:廖興廣, 鄒長軍