專利名稱：一種枯草芽孢桿菌菌種及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體來說涉及一種枯草芽孢桿菌菌種，同時還涉及該枯草芽孢桿菌菌種在實現(xiàn)細菌型豆豉純種發(fā)酵方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
細菌型豆豉目前主要采用傳統(tǒng)的自然發(fā)酵進行生產(chǎn)，沒有實現(xiàn)純種發(fā)酵，導(dǎo)致由濕豉調(diào)配生產(chǎn)的水豆豉常出現(xiàn)雜菌污染，產(chǎn)氣、頂蓋和二次污染現(xiàn)象嚴重，易產(chǎn)生毒素，且食鹽含量過高，這些因素都嚴重威脅人體的健康。而日本納豆和印度尼西亞天培的生產(chǎn)由于采用純種發(fā)酵技術(shù)，產(chǎn)銷產(chǎn)量都很大， 早已經(jīng)步入工業(yè)化生產(chǎn)。自然發(fā)酵的細菌型豆豉中的主要菌種有芽孢桿菌、微球菌、乳酸菌和酵母菌。前發(fā)酵時，芽孢桿菌數(shù)量占優(yōu)勢，分泌酶種類最多，產(chǎn)酶量也最多；后發(fā)酵時，由于加入食鹽，耐鹽性的微球菌、乳酸菌和酵母菌才開始生長。目前，芽孢桿菌主要應(yīng)用于工業(yè)酶制劑的生產(chǎn)。純種發(fā)酵豆豉則存在發(fā)酵風(fēng)味、色澤和質(zhì)地差等難題，很難應(yīng)用于食品工業(yè)生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述缺點而提供的一種發(fā)酵生產(chǎn)豆豉色澤與自然發(fā)酵相似，且不產(chǎn)氣、產(chǎn)酶能力較強、發(fā)酵風(fēng)味較好的適宜工業(yè)純種發(fā)酵生產(chǎn)豆豉的枯草芽孢桿菌菌種。本發(fā)明的另一目的在于提供該枯草芽孢桿菌菌種在在豆豉發(fā)酵生產(chǎn)中的用途。一種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BJ3-2，為不產(chǎn)氣菌株，其產(chǎn)蛋白酶能力 (3. 60h/c)較高。個體形態(tài)特征菌體寬0. 5 μ m，菌體長2. 6 μ m ；革蘭氏反應(yīng)為陽性；芽孢形狀為橢圓，位于菌體中間；芽孢囊無膨大；無伴孢晶體；有鞭毛。菌落形態(tài)純白色、形狀不規(guī)則、菌落中心呈同心環(huán)狀隆起、不透明、表面干燥、菌體微粘稠、易挑取。菌體大小均比 《伯杰氏鑒定手冊》中芽孢桿菌0.7-0.8Χ2-3(μπιΧ μπι)的描述偏小，芽孢中生。菌株安全、無毒。該菌種已于2010年10月22日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址中國北京中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏號CGMCC N0:4256，名稱為 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BJ3-2。(一)一種豆豉芽孢桿菌菌種(Bacillussubtilis BJ3-2)的分離步驟1.初篩將貴州畢節(jié)、遵義等主要地區(qū)的細菌型豆豉樣品采用稀釋劃線法分離獲得單菌株，純化后經(jīng)革蘭氏染色的疑似芽孢桿菌菌株，接種高壓滅菌并冷卻后的大豆，依照發(fā)酵后豆豉的色澤、粘絲、豉香、醬香、氨味、之地進行綜合評測并打分，篩選出發(fā)酵品質(zhì)較突出的菌株。2.復(fù)篩
復(fù)篩采用粗測產(chǎn)蛋白酶能力和發(fā)酵風(fēng)味感官評測相結(jié)合的方法。將初篩得到的菌株分別接種于酪蛋白瓊脂平板，依據(jù)分解酪蛋白后產(chǎn)生的透明圈直徑(h)與菌落直徑(c) 的比值，同時參考其發(fā)酵大豆風(fēng)味的風(fēng)味品質(zhì)，篩選得到BJ3-2菌株。(二)菌種的培養(yǎng)完全培養(yǎng)基胰蛋白胨10g、酵母膏5g、氯化鈉IOgdK 1000mL，pH7. 0。固體培養(yǎng)基加瓊脂20g, 121°C滅菌20min。(三)保種和傳代牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、加水至1000mL。用5N NaOH 調(diào) pH 7. 0-7. 2。LB培養(yǎng)基酵母抽提物5g，蛋白胨10g，NaCl 10g，加水至lOOOmL，5N NaOH調(diào) ρΗ7· 0-7. 2。以上為液體培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)基需按2%添加瓊脂，121 °C滅菌20min，冷卻至 45-50 V時倒入培養(yǎng)皿中即可。保存方法有三種(1)每月一次，從已生長的固體或液體培養(yǎng)基按一接種環(huán)量接種到新的平板上或斜面試管中，32°C，30h。置于4°C保存。(2)用15 X 180mm的試管，盛瓊脂培養(yǎng)基5mL，做成斜面，接種菌種，32°C，培養(yǎng)30h， 倒入約IOml滅菌石蠟油覆蓋其上，置于4°C保存。3個月轉(zhuǎn)種一次。(3)凍存法。接種LB液體培養(yǎng)基，320C，200rpm, 24h后添加20%的無菌甘油，混勻后無菌倒入凍存管中，置于-80°C保存。一年轉(zhuǎn)種一次。(四)菌種的生態(tài)特征BJ3-2菌株1 %接種牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，32°C，200rpm培養(yǎng)，0_4h為延滯期； 5-10h為對數(shù)生長期；10-14h為生長穩(wěn)定期；14-20h為衰亡期。菌落形態(tài)特征革蘭氏陽性；芽孢形狀為橢圓，位于菌體中間；芽孢囊無膨大；無伴孢晶體；有鞭毛。菌落形態(tài)為純白色、形狀不規(guī)則、菌落中心呈同心環(huán)狀隆起、不透明、表面干燥、菌體微粘稠、易挑取。菌體大小均比《伯杰氏細菌鑒定手冊》第八版中芽孢桿菌0. 7-0. 8 X 2-3( μ mX μ m)的描述偏小， 芽孢中生。(五)菌種的培養(yǎng)特性(1)培養(yǎng)溫度4°C -50°C，最適生長溫度在32°C -42°C。(2)培養(yǎng) pH6-8，最佳 pH 為 7. 0-7. 2。按照常見《細菌系統(tǒng)鑒定手冊》(東秀珠，1999)和《伯杰氏細菌鑒定手冊》提供的鑒定依據(jù)，同時對其16SrDNA的進行克隆和分析，長度為932bp，與枯草芽孢桿菌比較，序列同源性高達99 %。綜合同源性比對結(jié)果確定該菌株屬芽孢桿菌科，芽孢桿菌屬，枯草芽孢桿菌。由于該菌種是從貴州畢節(jié)地區(qū)(BJ)豆豉樣品分離獲得，特依據(jù)篩選數(shù)量命名為豆豉芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BJ3-2。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有明顯的有益效果，從以上技術(shù)方案可知從風(fēng)味優(yōu)良的細菌型豆豉樣品中，對發(fā)酵起主要作用菌種進行分離、篩選，獲得發(fā)酵風(fēng)味突出、酶系較為完整的芽孢桿菌菌株，并通過發(fā)酵產(chǎn)氣試驗，篩選前發(fā)酵不產(chǎn)氣的菌株，同時對后發(fā)酵條件進行優(yōu)化，可實現(xiàn)細菌型豆豉的純種發(fā)酵。產(chǎn)品理化及衛(wèi)生指標均達到豆豉標準DB52/524-2007,豆豉感官品質(zhì)與自然發(fā)酵豆豉相似，且品質(zhì)較好，香味突出，拉絲較長，穩(wěn)定性好，無“發(fā)臭”、“產(chǎn)氣”等現(xiàn)象出現(xiàn)。以此為原料生產(chǎn)出的水豆豉產(chǎn)品品質(zhì)顯著優(yōu)于自然發(fā)酵法，產(chǎn)品預(yù)蓋率低。豆豉中的中性蛋白酶、堿性蛋白酶、脂肪酶活力、豆豉溶纖酶活力較高，豆豉色澤與風(fēng)味較好，可以作為用于工業(yè)純種發(fā)酵生產(chǎn)候選菌株。
具體實施例方式(1)豆豉芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BJ3-2菌株分離與篩選1)菌種分離和純化取2g貴州畢節(jié)、遵義等主要地區(qū)的市售的細菌型豆豉樣品于18g無菌水的三角瓶中，并加入0. 吐溫80，180rpm培養(yǎng)30min，然后梯度稀釋為10-2-10-9，每個稀釋梯度做 3個重復(fù)。靜置IOmin后取液lmL，均勻涂布于牛肉膏蛋白胨平板上，37°C培養(yǎng)Mh。革蘭氏染色和芽孢染色，將G+芽孢桿菌單菌落純化3代后保種于牛肉膏蛋白胨斜面試管，每個樣品保留4-5菌株，并記錄菌株的平板形態(tài)，歸類。2)初篩接種菌株于牛肉膏蛋白胨液體試管，30°C培養(yǎng)12h，按黃豆(g)種子菌液(mL)= 125 1的比例接種到發(fā)酵培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)72h，以納豆芽孢桿菌(CICC:1023)純種發(fā)酵豆豉和自然發(fā)酵豆豉為對照，感官評價發(fā)酵豆豉的色澤和風(fēng)味，從中篩選出與對照菌株發(fā)酵風(fēng)味相似或有特點的菌株，每個地區(qū)篩選出1-3株發(fā)酵品質(zhì)較好的菌株。3)復(fù)篩菌株產(chǎn)蛋白酶能力的測定將菌株點接于酪蛋白瓊脂平板，37°C培養(yǎng)Mh，分別測量菌落透明圈直徑(h)和菌落直徑(c)，各測3次，計算平均值，h/c值大小表示菌體產(chǎn)蛋白酶能力的高低。色澤和風(fēng)味的評測黃豆200g，接種菌株發(fā)酵。感官評定篩選菌株發(fā)酵豆豉的外觀、風(fēng)味和質(zhì)地等，評分標準見下表。以分值高低表示發(fā)酵豆豉品質(zhì)的優(yōu)劣。表1感官評價標準_項目評分標準
權(quán)利要求
1.一種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BJ3-2，其特征在于所述菌種的保藏號為 CCTCC NO :4256。
2.如權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌BJ3-2在豆豉發(fā)酵生產(chǎn)中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種枯草芽孢桿菌菌種及其用途，菌體寬0.5μm，菌體長2.6μm；革蘭氏反應(yīng)為陽性；芽孢形狀為橢圓，位于菌體中間；芽孢囊無膨大；無伴孢晶體；有鞭毛。菌落形態(tài)純白色、形狀不規(guī)則、菌落中心呈同心環(huán)狀隆起、不透明、表面干燥、菌體微粘稠、易挑取。本發(fā)明的枯草芽孢桿菌菌種發(fā)酵生產(chǎn)的豆豉色澤與自然發(fā)酵相似，且不產(chǎn)氣、產(chǎn)酶能力較強、發(fā)酵風(fēng)味較好的適宜工業(yè)純種發(fā)酵生產(chǎn)豆豉。
文檔編號C12N1/20GK102199559SQ20111002379
公開日2011年9月28日 申請日期2011年1月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月21日
發(fā)明者吳擁軍 申請人:貴州大學(xué)