專利名稱：抗葡聚糖單鏈抗體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗葡聚糖的抗體，特別涉及抗葡聚糖單鏈抗體及其制備方法。
背景技術(shù)：
葡聚糖，又名右旋糖酐，由多個(gè)葡萄糖分子聚合而成，具有較高的分子量，葡萄糖殘基之間主要以0-1，6鍵連接，支鏈主要有1，2鍵，1，3鍵，1，4鍵等。葡聚糖可由蔗糖溶液中污染的細(xì)菌葡聚糖蔗糖酶催化產(chǎn)生，葡聚糖從結(jié)構(gòu)上可以分為α型和β型。α型葡聚糖通常由細(xì)菌分解蔗糖產(chǎn)生，β型葡聚糖具有生理活性，存在于真菌細(xì)胞壁中(1、范瑞梅， 范家恒.葡聚糖的免疫作用及研究進(jìn)展.甘蔗糖業(yè)，2006，(6) :38-41)。單鏈抗體(Single chain antibody，ScFv)是一個(gè)重要的基因工程抗體，是將重鏈可變區(qū)基因與輕鏈可變區(qū)基因用寡聚核甘酸連接，在大腸桿菌中表達(dá)成單鏈多肽，并在細(xì)菌體內(nèi)折疊成只由重鏈和輕鏈可變區(qū)構(gòu)成的一種新型的抗體(2、沈倍奮，陳志南，劉民培.重組抗體[M].北京北京科學(xué)出版社，2005，21-2 。單鏈抗體的大小僅為完整抗體的 1/6，與抗體分子相比，^Fv在藥代動(dòng)力學(xué)上表現(xiàn)出了更好的組織穿透力，在用于治療時(shí)可進(jìn)入一般抗體不能達(dá)到的部位。同時(shí)，由于抗原結(jié)合面不變，因此單鏈抗體擁有抗體的全部結(jié)合特異性。單鏈抗體的多肽接頭可設(shè)計(jì)為具有特殊功能的位點(diǎn)，如金屬螯合、連接毒素或藥物等，以用于影像和臨床治療。單鏈抗體可通過包涵體大量表達(dá)，易于基因工程操作，尤其易于構(gòu)建抗體融合蛋白，是目前研究最多的小分子抗體(3、王銳.基于雜交瘤細(xì)胞單鏈抗體制備技術(shù)的應(yīng)用，抗GPV-NSl和GoIFN-Y單鏈抗體的構(gòu)建[D]，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009， 1-2)
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一-目的在于提供抗葡聚_單鏈抗體。
本發(fā)明的另一-目的在于提供抗葡聚_單鏈抗體的制備方法。
所述抗葡聚賴■單鏈抗體的氨基麵■序列為
MetGluValGlnLeuGlnGlnSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGly
151015
GlySerMetLysLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerAsp
202530
AlaTrpMetAspTrpValArgGlnSerProGluLysGlyLeuGluTrp
354045
ValAlaGluIleArgSerLysAlaAsnAsnHisGluThrTyrTyrAla
505560
GluSerValLysGlyArgPheThrIleSerArgAspAspSerLysSer
65707580
SerValTyrLeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrGlylie
60
Tyr Tyr Cys
His 100 Val
85
Tyr Asp Val Ala
Ser Ser Gly
Thr Val Thr 115
Gly Gly Ser Asp
Gly
Ser 145 Ser
Gly 130 Val
Gly 120 Glu
90
Met Asp 105
Gly Gly Ser Gly
Ser Pro Gly
lie Gly Thr
Pro Arg Leu Ser Arg
Asn
Ser 210 Ser
Phe 195 Val
Leu 180
Ser
Ser 165 lie
Glu 150
lie
lie 135
Arg Val Ser Phe
95
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 110
Gly Gly Gly Ser 125
Pro Ala lie Leu
Leu Thr Gln Ser 140
Cys Arg Ala Ser
His Trp Tyr
Gln 170 Glu
Ser 155
Gln Arg Thr Asn
Ser lie Ser
Lys Tyr Ala Ser 185
Gly Thr Asp Phe
Gly Ser Gly
Ser 200
lie Ala
Gly 190 Leu
Gly 175 lie
Gln 160
Ser
Pro
Ser lie
Asn 225
Arg Leu Glu His
Glu Ser Glu Asp 215
Phe Gly Gly
Thr 205
Cys Gln Gln Ser
Trp Pro Trp
His 245
Thr 230 His
Asp Tyr Tyr 220
Gly Thr Lys Leu Glu lie 235
Lys 240
His His His
所述抗葡聚糖單鏈抗體的基因序列為
atggaggtgc aactgcagca gtctggagga ggcttggtgc aacctggagg atccatgaaactctcttgtgctgcctctggattcacttttagtgacgcctggatggactgggtccgccag120
tctccagagaaggggcttgagtgggttgctgaaattagaagcaaagctaataatcatgaa180
acatactatgctgagtctgtgaaagggaggttcaccatctcaagagatgattccaaaagt240
agtgtctacctgcaaatgaacagcttaagagctgaagacactggcatttattactgtcat300
tacgacgtggctatggactactggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcaggaggc360
ggtggttctggaggcggtggttctggaggcggtggttctgacattgagctcacccagtct420
ccagccatcctgtctgtgagtccaggagaaagagtcagtttctcctgcagggccagtcag480
agcattggcacaagcatacactggtatcagcaaagaacaaatggttctccaaggcttctc540
ataaagtatgcttctgagtctatctctgggatcccttccaggtttagtggcagtggatca600
gggacagattttactcttagcatcaacagtgtggagtctgaagatattgcagattattac660
tgtcaacaaagtaatagctggccgtggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaa720
cggctcgagcaccaccacca ‘ccaccac747 其中第1 3M位核苷酸為抗葡聚糖單鏈抗體的重鏈可變區(qū)基因，全長(zhǎng)為354bp ； 第355 399位核苷酸為連接肽Linker，全長(zhǎng)45bp ；第400 723位核苷酸為為抗葡聚糖單鏈抗體的輕鏈可變區(qū)基因，全長(zhǎng)為324bp。
所述抗葡聚糖單鏈抗體的制備方法包括以下步驟1)克隆抗葡聚糖單鏈抗體基因，并將其導(dǎo)入載體，構(gòu)建重組載體；2)將重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)菌，構(gòu)建表達(dá)抗葡聚糖單鏈抗體的重組工程菌；3)將重組工程菌發(fā)酵培養(yǎng)，分離純化發(fā)酵液，即得抗葡聚糖單鏈抗體。在步驟1)中，所述克隆抗葡聚糖單鏈抗體基因的模板來自抗葡聚糖單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株D9，所述雜交瘤細(xì)胞株D9于2010年12月7日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏中心地址中國.武漢.武漢大學(xué)，保藏中心保藏編號(hào)為CCTCC NO C2010107。所述克隆抗葡聚糖單鏈抗體基因可分別克隆抗葡聚糖單鏈抗體重鏈可變區(qū)基因和抗葡聚糖單鏈抗體輕鏈可變區(qū)基因，再通過連接肽Linker將兩者連接。所述克隆抗葡聚糖單鏈抗體重鏈可變區(qū)基因的引物為5'端引物5' -CAT GCCATG GAG GTS MAR CTG CAG SAG TCff GG—3'；3'端引物5' GCC TCC AGA ACC ACC GCC TCC TGA GGA GAC GGT GAC CGT GG-3'。所述克隆抗葡聚糖單鏈抗體輕鏈可變區(qū)基因的引物為5'端引物5' GGT GGT TCT GGA GGC GGT GGT TCT GAC ATT GAG CTC ACC-3‘；3'端引物5' -CCGCTCGAG CCG TTT GAT TTC CAG CTT GGT GCC-3‘。所述載體可為pET_22b (+)質(zhì)粒。在步驟2)中，所述宿主細(xì)菌可為E. coli BL21(DE3)。在步驟幻中，所述純化可采用親和層析。本發(fā)明利用抗葡聚糖單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株D9，通過RT-PCR技術(shù)，獲得了該抗體的重、輕鏈可變區(qū)序列，進(jìn)一步組裝成抗葡聚糖單鏈抗體基因，并構(gòu)建重組表達(dá)載體 pET-22(b+)-SCFv，進(jìn)行抗葡聚糖單鏈抗體的表達(dá)、純化與鑒定。在基因工程技術(shù)的大背景下，抗葡聚糖單鏈抗體的獲得將有助于未來該抗體的進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用。
圖1為抗葡聚糖單鏈抗體重鏈可變區(qū)基因(Vh)和輕鏈可變區(qū)基因的PCR產(chǎn)物電泳圖。在圖1中，1、2為輕鏈可變區(qū)基因(VJ，3為DNA分子量標(biāo)記(DNAMarker)，4、5 為重鏈可變區(qū)基因(Vh)。圖2為抗葡聚糖單鏈抗體基因的PCR產(chǎn)物電泳圖。在圖2中，1為DNA分子量標(biāo)記 (DNAMarker)，2為抗葡聚糖單鏈抗體基因。1500、1000、700、500、300、100為DNA分子量標(biāo)記的大小。圖3為純化后的抗葡聚糖單鏈抗體的電泳圖。在圖3中，1為蛋白分子量標(biāo)記 (Marker)，116. 0,45. 0,35. 0,25. 0,18. 4、14. 4為蛋白分子量大小，2、3為純化后的抗葡聚
糖單鏈抗體。圖4為抗葡聚糖單鏈抗體原核表達(dá)后的電泳圖。在圖4中，1為未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的空載體菌蛋白，2為經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的菌蛋白，3為經(jīng)IPTG誘導(dǎo)菌的超聲波上清液，4為經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)菌的超聲波沉淀，5是蛋白分子量標(biāo)記(Marker)，97. 4,66. 0,42. 7,31. 0,14. 4為蛋白分子量大小。
圖5為抗葡聚糖單鏈抗體鑒定圖。在圖5中，橫坐標(biāo)為稀釋度，縱坐標(biāo)為0D490nm。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1抗葡聚糖單鏈抗體重鏈可變區(qū)基因(Vh)和輕鏈可變區(qū)基因的克隆1)所用細(xì)胞和鼠源性抗葡聚糖單克隆抗體抗葡聚糖單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株D9由廈門大學(xué)和廣州甘蔗糖業(yè)研究所共同研制，于2010年12月7日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏中心保藏編號(hào)為 CCTCCNO :C2010107o雜交瘤細(xì)胞株D9常規(guī)培養(yǎng)在10 %胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，于37°C，5 % CO2培養(yǎng)。2)引物設(shè)計(jì)要擴(kuò)增的抗體可變區(qū)基因序列，其可變區(qū)基因序列是未知的，故本發(fā)明使用的引物采用國際上推廣的弓丨物序列。 在Vh引物的5 ‘端加入酶切位點(diǎn)Nco I CATGCCATGG (含保護(hù)性堿基CATG)， 在八引物的3 ‘端加入酶切位點(diǎn))(ho I :CCGCTCGAG (含保護(hù)性堿基CCG)。將連接肽 Linker (Gly4Ser)3設(shè)計(jì)在Vh3'端和八5'端，加下劃線表示。擴(kuò)增重鏈可變區(qū)的引物為Vh 5'端引物5' -CAT GCCATG GAG GTS MAR CTG CAG SAG TCff GG-3'；(注S =G, C ;M = A, C ;R = A, G ;ff = A, T)；Vh 3'端引物5' GCC TCC AGAACC ACC GCC TCC TGA GGA GAC GGT GAC CGT GG-3'。擴(kuò)增輕鏈可變區(qū)的引物為Vl 5 ‘端引物5 , GGT GGT TCT GGA GGC GGT GGT TCT GAC ATT GAG CTC ACC-3‘；Vl 3'端引物5' -CCGCTCGAG CCG TTT GAT TTC CAG CTT GGT GCC-3‘。3) V1^P八基因的克隆取狀態(tài)良好的雜交瘤細(xì)胞株D9，采用Trizol (購自^witrogen公司)試劑，按照說明書上的方法提取總RNA，以總RNA為模板，以O(shè)ligo (dT) 20 (購自Τ0Υ0Β0)為隨機(jī)引物， 逆轉(zhuǎn)成cDNA。以O(shè)ligo (dT) 20為隨機(jī)引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄方案如下RT-PCR 反應(yīng)體系:5XAMV 緩沖液 4. 0 μ L ； dNTP (10mmol/L) l.OyL ；Oligo (dT) 20 隨機(jī)引物(20ymol/L)2. Ομ L ；RNase 抑制劑 0· 5 μ L ；總 RNA 5. O μ L ；AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶 1. O μ L ； DEPC /K 6. 5 μ L ；總體積 20 μ L0RT-PCR 反應(yīng)條件50°C，60min ;75°C，15min。反應(yīng)產(chǎn)物保存 _20°C備用。以RT-PCR擴(kuò)增的cDNA為模板，擴(kuò)增重鏈和輕鏈可變區(qū)基因。PCR 擴(kuò)增體系為10 X PCR 緩沖液 2. 5 μ L ； dNTP (10mmol/L) 0. 5μ L ；5 ‘端引物 (20ymol/L)1.0yL;3'端 QO μ mol/L) 1. O μ L ;cDNA 1· 0 μ L ;Taq 聚合酶 0· 5 μ L ；雙蒸水 18. 5μ L ；總體積 25. 0μ L。PCR 反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性 5min，94°C變性 30s，58°C退火 45s，72°C延伸 lmin， 擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。產(chǎn)物經(jīng)1. 5%瓊脂糖凝膠電泳觀察分析結(jié)果(參見
7圖1)，并用膠純化回收試劑盒(OMEGA)回收V1^nt基因產(chǎn)物。實(shí)施例2抗葡聚糖單鏈抗體基因的克隆及其表達(dá)載體的構(gòu)建以回收的V1^nt基因產(chǎn)物混合液為模板，通過乂力‘和VJ'引物擴(kuò)增加入連接肽 Linker片段的抗葡聚糖單鏈抗體基因(VH-Linker-\)(參見圖2)，其序列為atggaggtgcaactgcagcagtctggaggaggcttggtgcaacctggaggatccatgaaa60
ctctcttgtgctgcctctggattcacttttagtgacgcctggatggactgggtccgccag120
tctccagagaaggggcttgagtgggttgctgaaattagaagcaaagctaataatcatgaa180
acatactatgctgagtctgtgaaagggaggttcaccatctcaagagatgattccaaaagt240
agtgtctacctgcaaatgaacagcttaagagctgaagacactggcatttattactgtcat300
tacgacgtggctatggactactggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcaggaggc360
ggtggttctggaggcggtggttctggaggcggtggttctgacattgagctcacccagtct420
ccagccatcctgtctgtgagtccaggagaaagagtcagtttctcctgcagggccagtcag480
agcattggcacaagcatacactggtatcagcaaagaacaaatggttctccaaggcttctc540
ataaagtatgcttctgagtctatctctgggatcccttccaggtttagtggcagtggatca600
gggacagattttactcttagcatcaacagtgtggagtctgaagatattgcagattattac660
tgtcaacaaagtaatagctggccgtggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaa720
cggctcgagcaccaccacca ιccaccac747
其中第1 354位核苷畫I為抗葡聚糖單鏈抗體的· 鏈可變區(qū)基因，全長(zhǎng)為354bp ；第 355 ‘ 399位核苷I酸為連接肽Linker，全長(zhǎng)45bp ；第400 7 位核苷酸為為抗葡聚糖
單鏈抗體的輕鏈可變區(qū)基因，全長(zhǎng)為324bp。PCR 應(yīng)體系為10XPCR 緩沖液 2. 5μ L ;dNTP(10mmol/L)0. 5μ L ;VH5 ‘引物 (20ymol/L) l.OyL ； VL3'引物(20ymol/L) l.OyL ；Vh 禾口 Vl 基因產(chǎn)物各 1 μ L ；Taq 聚合酶 0. 5 μ L ；雙蒸水 18. 5 μ L ；總體積 25. 0μ L0PCR 反應(yīng)條件94°C預(yù)變性 5min，94°C變性 40s，58°C退火 45s，72°C延伸 lmin，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，72°C延伸IOmin0抗葡聚糖單鏈抗體基因產(chǎn)物及pET_22b(+)質(zhì)粒(購自Novagen公司)分別用限制性內(nèi)切酶Nco I和Bio I (NEB)進(jìn)行酶切，膠回收酶切后的產(chǎn)物。在T4DNA連接酶的催化下，將抗葡聚糖單鏈抗體基因克隆至質(zhì)粒pET-22b (+)中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-22b (+) -scFv, 轉(zhuǎn)化Ε. coliBL21 (DE3)，篩選陽性克隆并送上海英俊生物技術(shù)有限公司測(cè)序。實(shí)施例3抗葡聚糖單鏈抗體基因的原核表達(dá)和純化挑選測(cè)序正確的含有pET-22b(+)-SCFv重組質(zhì)粒的E. coli BL21(DE3)單菌落， 37°C振蕩培養(yǎng)過夜，按1 100稀釋到LB培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)至OD6tltl值約0.6 0.8時(shí)， 加入終濃度為0. 5mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4h，收集菌體進(jìn)行SDS-PAGE電泳，經(jīng)過染色、脫色，發(fā)現(xiàn)E. coliBL21 (DE3)的表達(dá)產(chǎn)物在^kD處有明顯的條帶，與預(yù)期的目的蛋白帶大小一致，表明抗葡聚糖單鏈抗體基因獲得了表達(dá)(參見圖幻。抗葡聚糖單鏈抗體的氨基酸序列為Met Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly151015Gly Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp0119]2025300120]AlaTrpMetAspTrpValArgGlnSerProGluLysGlyLeuGluTrp0121]3540450122]ValAlaGlulieArgSerLysAlaAsnAsnHisGluThrTyrTyrAla0123]5055600124]GluSerValLysGlyArgPheThrIleSerArgAspAspSerLysSer0125]657075800126]SerValTyrLeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrGlylie0127]8590950128]TyrTyrCysHisTyrAspValAlaMetAspTyrTrpGlyGlnGlyThr0129]1001051100130]ThrValThrValSerSerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer0131]1151201250132]GlyGlyGlyGlySerAsplieGluLeuThrGlnSerProAlalieLeu0133]1301351400134]SerValSerProGlyGluArgValSerPheSerCysArgAlaSerGln0135]1451501551600136]SerlieGlyThrSerlieHisTrpTyrGlnGlnArgThrAsnGlySer0137]1651701750138]ProArgLeuLeulieLysTyrAlaSerGluSerlieSerGlyliePro0139]1801851900140]SerArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuSerlie0141]1952002050142]AsnSerValGluSerGluAspIleAlaAspTyrTyrCysGlnGlnSer0143]2102152200144]AsnSerTrpProTrpThrPheGlyGlyGlyThrLysLeuGlulieLys0145]2252302352400146]ArgLeuGluHisHisHisHisHisHis0147]2450148]SDS--PAGE電泳表明，抗葡聚糖單鏈抗體基因的原核表達(dá)產(chǎn)物絕大部分出現(xiàn)
沉淀中，說明融合蛋白主要以包涵體的形式存在(參見圖4)。包涵體經(jīng)處理后，過Ni2+親和柱，用洗脫液洗下親和蛋白，膠上幾乎只出現(xiàn)1條蛋白質(zhì)條帶，說明經(jīng)親和層析純化到較高純度含6XHis的融合蛋白。經(jīng)凝膠成像(Quantity One-4. 6)分析顯示其純度達(dá)到90%。 采用逐步透析法對(duì)純化的蛋白進(jìn)行復(fù)性，復(fù)性蛋白回收率為45%，通過紫外分光光度計(jì)掃描，根據(jù)蛋白質(zhì)濃度=1. 450D280-0. 740D260公式，測(cè)得純化樣品濃度為0. 6mg/mL。實(shí)施例3抗葡聚糖單鏈抗體的鑒定采用ELISA法測(cè)定抗葡聚糖scFv抗體片段的生物學(xué)活性。將葡聚糖與雞卵血清白蛋白交聯(lián)物用碳酸鹽緩沖液稀釋至5ug/mL，包被于96孔板，IOOyL/孔，4°C過夜。用的明膠封閉池，用PBST洗96孔板5次，每孔加入倍比稀釋的蛋白100 μ L。同時(shí)以pET_22b (+)空載體誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物為陰性對(duì)照，37°C放置lh，用PBST洗滌液洗5次后，加入鼠抗6XHis 抗體，37°C放置lh，用PBST洗滌液洗3次，再加羊抗鼠IgG酶標(biāo)二抗，37°C放置45min，再用 PBST洗5次，加入OPD底物溶液，37°C避光放置15min，加終止液QM H2S04溶液)終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀490nm讀取結(jié)果(參見圖5)。 重組表達(dá)的單鏈抗體在1 1稀釋時(shí)OD49tl為2.31，在1 1 稀釋時(shí)為0.201， 隨著抗體濃度的下降，OD49tl值逐漸降低，表明單鏈抗體能與包被在板上的葡聚糖進(jìn)行特異性結(jié)合。
權(quán)利要求
1.抗葡聚糖單鏈抗體，其特征在于所述抗葡聚糖單鏈抗體的氨基酸序列為 Met Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 151015Gly Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp202530Ala Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp354045Val Ala Glu lie Arg Ser Lys Ala Asn Asn His Glu Thr Tyr Tyr Ala505560Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser 65707580Ser Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly lie859095Tyr Tyr Cys His Tyr Asp Val Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr100105110Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser115120125Gly Gly Gly Gly Ser Asp lie Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala lie Leu130135140Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln 145150155160Ser lie Gly Thr Ser lie His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser165170175Pro Arg Leu Leu lie Lys Tyr Ala Ser Glu Ser lie Ser Gly lie Pro180185190Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser lie195200205Asn Ser Val Glu Ser Glu Asp lie Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser210215220Asn Ser Trp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 225230235240Arg Leu Glu His His His His His His 245。
2.如權(quán)利要求1所述的抗葡聚糖單鏈抗體，其特征在于其基因序列為atggaggtgcaactgcagcagtctggaggaggcttggtgcaacctggaggatccatgaaa60ctctcttgtgctgcctctggattcacttttagtgacgcctggatggactgggtccgccag120tctccagagaaggggcttgagtgggttgctgaaattagaagcaaagctaataatcatgaa180acatactatgctgagtctgtgaaagggaggttcaccatctcaagagatgattccaaaagt240agtgtctacctgcaaatgaacagcttaagagctgaagacactggcatttattactgtcat300tacgacgtggctatggactactggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcaggaggc360ggtggttctggaggcggtggttctggaggcggtggttctgacattgagctcacccagtct420ccagccatcctgtctgtgagtccaggagaaagagtcagtttctcctgcagggccagtcag480agcattggcacaagcatacactggtatcagcaaagaacaaatggttctccaaggcttctc540ataaagtatgcttctgagtctatctctgggatcccttccaggtttagtggcagtggatca600gggacagattttactcttagcatcaacagtgtggagtctgaagatattgcagattattac660tgtcaacaaagtaatagctggccgtggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaa720cggctcgagcaccaccaccaccaccac747其中第1 3M位核苷酸為抗葡聚糖單鏈抗體的重鏈可變區(qū)基因，全長(zhǎng)為354bp ；第 355 399位核苷酸為連接肽Linker，全長(zhǎng)45bp ；第400 723位核苷酸為為抗葡聚糖單鏈抗體的輕鏈可變區(qū)基因，全長(zhǎng)為324bp。
3.如權(quán)利要求1所述的抗葡聚糖單鏈抗體的制備方法，其特征在于包括以下步驟1)克隆抗葡聚糖單鏈抗體基因，并將其導(dǎo)入載體，構(gòu)建重組載體；2)將重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)菌，構(gòu)建表達(dá)抗葡聚糖單鏈抗體的重組工程菌；3)將重組工程菌發(fā)酵培養(yǎng)，分離純化發(fā)酵液，即得抗葡聚糖單鏈抗體。
4.如權(quán)利要求3所述的抗葡聚糖單鏈抗體的制備方法，其特征在于在步驟1)中，所述克隆抗葡聚糖單鏈抗體基因的模板來自抗葡聚糖單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株D9，所述雜交瘤細(xì)胞株D9于2010年12月7日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏中心保藏編號(hào)為 CCTCCNO :C2010107o
5.如權(quán)利要求3所述的抗葡聚糖單鏈抗體的制備方法，其特征在于在步驟1)中，所述克隆抗葡聚糖單鏈抗體基因是分別克隆抗葡聚糖單鏈抗體重鏈可變區(qū)基因和抗葡聚糖單鏈抗體輕鏈可變區(qū)基因，再通過連接肽Linker將兩者連接。
6.如權(quán)利要求5所述的抗葡聚糖單鏈抗體的制備方法，其特征在于所述克隆抗葡聚糖單鏈抗體重鏈可變區(qū)基因的引物為5'端引物5' -CAT GCCATG GAG GTS MAR CTG CAG SAG TCff GG-3'；3'端引物5' -GCC TCC AGA ACC ACC GCC TCC TGA GGA GAC GGT GAC CGT GG-3'。
7.如權(quán)利要求5所述的抗葡聚糖單鏈抗體的制備方法，其特征在于所述克隆抗葡聚糖單鏈抗體輕鏈可變區(qū)基因的引物為5'端引物5, -GGT GGT TCT GGA GGC GGT GGT TCT GAC ATT GAG CTC ACC-3‘；3'端引物5' -CCGCTCGAG CCG TTT GAT TTC CAG CTT GGT GCC-3‘。
8.如權(quán)利要求3所述的抗葡聚糖單鏈抗體的制備方法，其特征在于在步驟1)中，所述載體為pET-22b(+)質(zhì)粒。
9.如權(quán)利要求3所述的抗葡聚糖單鏈抗體的制備方法，其特征在于在步驟幻中，所述宿主細(xì)菌為 E. coli BL21(DE3)。
10.如權(quán)利要求3所述的抗葡聚糖單鏈抗體的制備方法，其特征在于在步驟；3)中，所述純化采用親和層析。
全文摘要
抗葡聚糖單鏈抗體及其制備方法。涉及抗葡聚糖的抗體，提供抗葡聚糖單鏈抗體及其制備方法?？寺】蛊暇厶菃捂溈贵w基因，并將其導(dǎo)入載體，構(gòu)建重組載體；將重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)菌，構(gòu)建表達(dá)抗葡聚糖單鏈抗體的重組工程菌；重組工程菌發(fā)酵培養(yǎng)，分離純化發(fā)酵液，即得抗葡聚糖單鏈抗體。利用抗葡聚糖單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株D9，通過RT-PCR技術(shù)，獲得了該抗體的重、輕鏈可變區(qū)序列，進(jìn)一步組裝成抗葡聚糖單鏈抗體基因，并構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-22(b+)-scFv，進(jìn)行抗葡聚糖單鏈抗體的表達(dá)、純化與鑒定。在基因工程技術(shù)的大背景下，抗葡聚糖單鏈抗體的獲得將有助于未來該抗體的進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N15/13GK102153651SQ20111002390
公開日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2011年1月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月21日
發(fā)明者倪二茹, 曾練強(qiáng), 梁達(dá)奉, 王生育, 顏江華 申請(qǐng)人:廈門大學(xué), 廣州甘蔗糖業(yè)研究所