專利名稱：一種利用糞腸球菌發(fā)酵從甲殼類動物外骨骼中制備甲殼素的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及甲殼素的制備方法，尤其設計一種利用糞腸球菌發(fā)酵從甲殼類動物外骨骼中制備甲殼素的方法。
背景技術：
甲殼素又稱幾丁質、甲殼質，是以β-1，4_N-乙酰-D-氨基葡萄糖為基本單位的直鏈多聚物。幾丁質廣泛存在于甲殼綱動物蝦蟹、昆蟲的甲殼以及真菌(酵母，霉菌)、藻類、 植物的細胞壁中，是地球上蘊藏最豐富的有機物之一，在蝦蟹殼中的含量高達15% -30%。幾丁質及其降解產物幾丁寡糖、殼聚糖和N-乙酰氨基葡萄糖具有抗癌、抗菌、調節(jié)免疫和植物生長等作用，在醫(yī)藥、農業(yè)和食品工業(yè)等方面具有廣闊的應用前景和經濟價值。目前幾丁質主要是從蝦蟹殼中提取。由于蝦蟹殼中的甲殼質與蛋白質共價結合，以蛋白聚糖形式存在，同時伴生碳酸鈣，所以，雖然制備甲殼質的方法很多，但都大同小異， 主要操作方法是脫鈣和脫蛋白，如Hackman法、Whistler和Bemiller法、Broussignac 法、Peniston法等。由于目前人們所利用的甲殼質主要通過化學的方法來制取，在制備過程中需用大量的酸堿，產生大量的廢水廢料，嚴重污染了環(huán)境[3]。為減少對環(huán)境的污染，人們尋找各種替代的方法。一種途徑是采用添加蛋白酶和有機酸的方法，通過蛋白酶降解蝦蟹殼中的蛋白質，利用有機酸脫鈣的工藝方法使蛋白質及鈣與甲殼素分離，比如中國專禾Ij 200810159615. 3,201010217608. 1 (申請?zhí)?,02122565. 6 等。另一種途徑是利用乳酸菌發(fā)酵將蝦殼等原料中的蛋白質水解液化分離出來，發(fā)酵產生的乳酸將殼中的無機鈣鹽溶解，轉移到發(fā)酵液中，剩余的殘渣經脫色處理即可得到甲殼素。比如中國專利 201010181224. 9 (申請?zhí)?,201010181245. 0,200910040121. 8 等。涉及的乳酸菌包括嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種、植物乳桿菌、乳酸片球菌等。利用糞腸球菌發(fā)酵法生產甲殼素的報道則還未見到。

發(fā)明內容
為了克服上述現(xiàn)有技術的缺點，本發(fā)明的目的在于提供一種利用糞腸球菌發(fā)酵從甲殼類動物外骨骼中制備甲殼素的方法，該方法的各種最終產物都能得到有效利用，減少了污染。為了達到上述目的，本發(fā)明采用的技術方案為一種利用糞腸球菌發(fā)酵從甲殼類動物外骨骼中制備甲殼素的方法，包括以下步驟第一步，將甲殼類動物外骨骼粉碎，加入粉碎物質量1 3倍的水和粉碎物質量 10 20%的葡萄糖或蔗糖，混合攪拌；第二步，將糞腸球菌接入活化培養(yǎng)基活化，然后在37°C下恒溫培養(yǎng)M 36小時， 接著按10 20%的接種量，接入第一步的混合液中；
第三步，將接入糞腸球菌的混合液在27 45°C下恒溫發(fā)酵48小時以上；第四步，將發(fā)酵液與發(fā)酵殘渣過濾分離后，發(fā)酵殘渣經濃度為0. 5 5mol/L的稀鹽酸浸泡2小時以上，再用雙氧水脫色，得到甲殼素。所述活化培養(yǎng)基為液體乳酸細菌培養(yǎng)基。所述脫色也可以采用日光暴曬的方式。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于一、同化學方法相比，大大減少了對強酸堿的使用，降低了污染。二、各種最終產物都得到有效利用，降低了污染，發(fā)酵液殘渣用于制備甲殼素，發(fā)酵液離心后所得沉淀主要是糞腸球菌菌體，可用于生產益生菌制劑或噴霧干燥后得到單細胞蛋白，上清液富含乳酸鈣，可用于制備鈣片等補鈣制品。
具體實施例方式下面結合實施例對本發(fā)明作進一步說明。實施例一一種利用糞腸球菌發(fā)酵從甲殼類動物外骨骼中制備甲殼素的方法，包括以下步驟第一步，將IOOg蝦殼粉碎，加入IOOg水和IOg葡萄糖，混合攪拌；第二步，將糞腸球菌接入活化培養(yǎng)基活化，然后在37°C下恒溫培養(yǎng)M小時，接著按10%的接種量，接入第一步的混合液中；第三步，將接入糞腸球菌的混合液在27°C下恒溫發(fā)酵48小時；第四步，將發(fā)酵液與發(fā)酵殘渣過濾分離后，發(fā)酵殘渣經濃度為0. 5mol/L的稀鹽酸浸泡6小時，再用雙氧水脫色，得到甲殼素。實施例二一種利用糞腸球菌發(fā)酵從甲殼類動物外骨骼中制備甲殼素的方法，包括以下步驟第一步，將IOOg蟹殼粉碎，加入300g水和20g蔗糖，混合攪拌；第二步，將糞腸球菌接入活化培養(yǎng)基活化，然后在37°C下恒溫培養(yǎng)36小時，接著按20%的接種量，接入第一步的混合液中；第三步，將接入糞腸球菌的混合液在45°C下恒溫發(fā)酵48小時以上；第四步，將發(fā)酵液與發(fā)酵殘渣過濾分離后，發(fā)酵殘渣經濃度為5mol/L的稀鹽酸浸泡4小時，再用雙氧水脫色，得到甲殼素。實施例三一種利用糞腸球菌發(fā)酵從甲殼類動物外骨骼中制備甲殼素的方法，包括以下步驟第一步，將總重為IOOg的蝦殼和蟹殼混合物粉碎，加入200g水和15g葡萄糖，混合攪拌；第二步，將糞腸球菌接入活化培養(yǎng)基活化，然后在37°C下恒溫培養(yǎng)30小時，接著按15%的接種量，接入第一步的混合液中；第三步，將接入糞腸球菌的混合液在35°C下恒溫發(fā)酵48小時以上；
第四步，將發(fā)酵液與發(fā)酵殘渣過濾分離后，發(fā)酵殘渣經濃度為2mol/L以上的稀鹽酸浸泡2小時，再用雙氧水脫色，得到甲殼素。以上各實施例中，都可以采用日光暴曬脫色來代替雙氧水脫色，更加經濟實惠，所述的活化培養(yǎng)基可以采用液體乳酸細菌(MRQ培養(yǎng)基。各實施例的發(fā)酵液經離心所得的菌體沉淀可加工后作為SCP，用作飼料添加劑或益生菌制劑原料，上清液中含有乳酸鈣，可提取獲得。本發(fā)明的原理為蝦蟹殼等甲殼類動物的外骨骼的成分主要是碳酸鈣、甲殼素和蛋白質，同時還含有少量色素和其他物質，乳酸菌在生長過程中能夠產生乳酸，乳酸可以將不溶于水的碳酸鈣轉化為可溶性的乳酸鈣；乳酸菌生長過程中分泌的蛋白酶可以將蝦蟹殼中的蛋白質水解。因此經過乳酸菌處理的蝦蟹殼殘渣主要成分就只有甲殼素，經過稀酸脫除殘余礦物質和脫色處理就可以得到所需的甲殼素。截止目前，利用蝦蟹殼制備甲殼素都是用的化學方法，主要原因是成本較低。利用微生物降解法制備甲殼素的研究并不多，選用糞腸球菌主要是因為它可以作為生產甲殼素的副產品生產益生菌制劑，它作為益生菌制劑，具有一定的優(yōu)越性，具體表現(xiàn)在1、同其他益生性乳酸菌相比，糞腸球菌是人體腸道的正常菌群，因此可在體內長期生存，而其他多數(shù)乳酸菌屬于過路菌，不能在體內長期生存，一旦停止服用益生菌制劑， 就會在體內逐步減少。2、同其他常用的益生菌相比，對酸和膽鹽的耐受性高，因此在人體或動物食道的存活能力更強。3、耐高溫能力強，可常溫保存。
權利要求
1.一種利用糞腸球菌發(fā)酵從甲殼類動物外骨骼中制備甲殼素的方法，其特征在于，包括以下步驟第一步，將甲殼類動物外骨骼粉碎，加入粉碎物質量1 3倍的水和粉碎物質量10 20%的葡萄糖或蔗糖，混合攪拌；第二步，將糞腸球菌接入活化培養(yǎng)基活化，然后在37°C下恒溫培養(yǎng)M 36小時，接著按10 20%的接種量，接入第一步的混合液中；第三步，將接入糞腸球菌的混合液在27 45°C下恒溫發(fā)酵48小時以上； 第四步，將發(fā)酵液與發(fā)酵殘渣過濾分離后，發(fā)酵殘渣經濃度為0. 5 5mol/L的稀鹽酸浸泡2小時以上，再用雙氧水脫色，得到甲殼素。
2.根據(jù)權利要求1所述的利用糞腸球菌發(fā)酵從甲殼類動物外骨骼中制備甲殼素的方法，其特征在于，包括以下步驟第一步，將甲殼類動物外骨骼粉碎，加入粉碎物等質量的水和粉碎物質量10%的葡萄糖，混合攪拌；第二步，將糞腸球菌接入活化培養(yǎng)基活化，然后在37°C下恒溫培養(yǎng)M小時，接著按 10%的接種量，接入第一步的混合液中；第三步，將接入糞腸球菌的混合液在27°C下恒溫發(fā)酵48小時； 第四步，將發(fā)酵液與發(fā)酵殘渣過濾分離后，發(fā)酵殘渣經濃度為0. 5mol/L的稀鹽酸浸泡 6小時，再用雙氧水脫色，得到甲殼素。
3.根據(jù)權利要求1所述的利用糞腸球菌發(fā)酵從甲殼類動物外骨骼中制備甲殼素的方法，其特征在于，包括以下步驟第一步，將甲殼類動物外骨骼粉碎，加入粉碎物質量3倍的水和粉碎物質量20%的蔗糖，混合攪拌；第二步，將糞腸球菌接入活化培養(yǎng)基活化，然后在37°C下恒溫培養(yǎng)36小時，接著按 20%的接種量，接入第一步的混合液中；第三步，將接入糞腸球菌的混合液在45°C下恒溫發(fā)酵48小時以上； 第四步，將發(fā)酵液與發(fā)酵殘渣過濾分離后，發(fā)酵殘渣經濃度為5mol/L的稀鹽酸浸泡4 小時，再用雙氧水脫色，得到甲殼素。
4.根據(jù)權利要求1所述的利用糞腸球菌發(fā)酵從甲殼類動物外骨骼中制備甲殼素的方法，其特征在于，包括以下步驟第一步，將甲殼類動物外骨骼粉碎，加入粉碎物質量2倍的水和粉碎物質量15%的葡萄糖，混合攪拌；第二步，將糞腸球菌接入活化培養(yǎng)基活化，然后在37°C下恒溫培養(yǎng)30小時，接著按 15%的接種量，接入第一步的混合液中；第三步，將接入糞腸球菌的混合液在35°C下恒溫發(fā)酵48小時以上； 第四步，將發(fā)酵液與發(fā)酵殘渣過濾分離后，發(fā)酵殘渣經濃度為2mol/L以上的稀鹽酸浸泡2小時，再用雙氧水脫色，得到甲殼素。
5.根據(jù)權利要求1至4任一權利要求所述的利用糞腸球菌發(fā)酵從甲殼類動物外骨骼中制備甲殼素的方法，其特征在于，所述活化培養(yǎng)基為液體乳酸細菌培養(yǎng)基。
6.根據(jù)權利要求1至4任一權利要求所述的利用糞腸球菌發(fā)酵從甲殼類動物外骨骼中制備甲殼素的方法，其特征在于，所述脫色也可以采用日光暴曬的方式。
7.根據(jù)權利要求1至4任一權利要求所述的利用糞腸球菌發(fā)酵從甲殼類動物外骨骼中制備甲殼素的方法，其特征在于，所述的甲殼類動物外骨骼為蝦殼、蟹殼或者兩者的混合物。
全文摘要
本發(fā)明為一種利用糞腸球菌發(fā)酵從甲殼類動物外骨骼中制備甲殼素的方法，包括以下步驟，首先，將甲殼類動物外骨骼粉碎，加入水和葡萄糖或蔗糖，混合攪拌；其次，將糞腸球菌接入活化培養(yǎng)基活化，恒溫培養(yǎng)，接入第一步的混合液中；然后，將接入糞腸球菌的混合液恒溫發(fā)酵；最后，將發(fā)酵液與發(fā)酵殘渣過濾分離后，發(fā)酵殘渣經濃稀鹽酸浸泡，再脫色，得到甲殼素，使用該方法制備甲殼素，各種最終產物都能得到有效利用，減少了污染。
文檔編號C12P19/04GK102168122SQ201110024050
公開日2011年8月31日 申請日期2011年1月21日 優(yōu)先權日2011年1月21日
發(fā)明者曾橋, 緱敬軒, 董文賓 申請人:陜西科技大學