專利名稱：一種提取糜胰蛋白酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，更具體地說(shuō)涉及一種提取糜胰蛋白酶的方法。
背景技術(shù)：
糜蛋白酶和胰蛋白酶都是典型的絲氨酸蛋白酶，二者的性質(zhì)極為相似，不易分開， 但是對(duì)蛋白質(zhì)水解的專一性卻各異。胰蛋白酶只作用于由堿性氨基酸L-精氨酸或賴氨酸的羧基所構(gòu)成的C-末端肽鍵，而糜蛋白酶則選擇性地水解由芳族或脂族氨基酸(如苯丙氨酸、酪氨酸)所組成的肽鍵。因此，它們二者具有協(xié)同水解蛋白質(zhì)肽鍵的作用，比單獨(dú)使用一種酶的效果好，適用范圍更廣。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)它們作了大量的研究，并已作為一種抗炎消腫的藥物，應(yīng)用于臨床。其他用途例如皮革工業(yè)脫去動(dòng)物皮上的毛，紡織工業(yè)脫絲膠和水解酪蛋白制水解乳蛋白等。一般將它們從胰臟提取分離方法是采用鹽析多重結(jié)晶結(jié)合透析和乙醇及丙酮等的有機(jī)溶劑法。先將它們制備成糜胰蛋白酶的粗制品，然后再通過(guò)CM-纖維素柱層析和親和層析等純化，凍干獲得純度較高的糜胰蛋白酶，但是由于其制備工藝流程復(fù)雜，技術(shù)要求高，成本昂貴，不易廣泛使用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種提取糜胰蛋白酶的方法，采用CaCl2激活糜胰蛋白酶原成為糜胰蛋白酶，在成為糜胰蛋白酶的同時(shí)加入飽和度的(NH4)2SO4，使其生成 CaSO4沉淀吸附糜胰蛋白酶，以簡(jiǎn)化其生產(chǎn)工藝流程，縮短后續(xù)純化的周期和降低成本。本發(fā)明有下述順序步驟a、以新鮮牛胰臟或豬胰臟或冷凍牛胰臟或冷凍豬胰臟為原料，除去脂肪和結(jié)締組織，用清水洗凈，再用絞肉機(jī)絞碎。b、將絞碎的胰臟移入不銹鋼桶中，加入自來(lái)水，其比例為1 4，用15% H2SO4溶液將其調(diào)節(jié)至PH值為3. 0，在室溫下不斷攪拌M小時(shí)，然后用4000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心30 分鐘，獲得浸取液I和胰臟殘?jiān)恋砦颕。C、將獲得的浸取液I倒入浸取液桶內(nèi)備用，將胰臟殘?jiān)恋砦颕用1 2的比例加入PH值為3. 0的自來(lái)水進(jìn)行攪拌洗滌20分鐘，然后用4000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心30分鐘，獲得浸取液II和胰臟殘?jiān)恋砦颕I。d、將浸取液II倒入浸取液桶內(nèi)；將胰臟殘?jiān)恋砦颕I用1 2的比例加入PH值為 3. 0的自來(lái)水進(jìn)行攪拌洗滌20分鐘，然后用4000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心30分鐘，獲得浸取液 III和胰臟殘?jiān)恋砦颕II ；最后將浸取液III倒入浸取液桶中與浸取液I、II合并，棄去胰臟殘?jiān)恋砦颕II。e、在浸取液桶中，加入25% 33%飽和度的(NH4)2SO4,攪拌均勻，靜置2小時(shí)，然后用4000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心30分鐘，棄去雜蛋白沉淀，獲得了清的浸取液。f、將獲得清的浸取液中再加入65% 75%飽和度的(NH4)2SO4，攪拌均勻，靜置 8 10小時(shí)，用4000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心30分鐘，沉降后棄去浸取液，獲得了糜胰蛋白酶原的沉淀。g、將獲得的糜胰蛋白酶原的沉淀用PH值為3.0的去離子水溶解后，加入5% 7% CaCl2,攪拌均勻，在4°C 5°C下，靜置10小時(shí)，使Ca++離子激活糜胰蛋白酶原成為糜胰蛋白酶；然后在糜胰蛋白酶溶液中加入20%飽和度的(NH4)2SO4，攪拌均勻，加溫至37°C，使
溶液中 Ca++離子生成 CaSO4 沉淀(CaCl2+(NH4)2S04 t 2NH4C1 + CaSO41 )，吸附
溶液中的糜胰蛋白酶，靜置10小時(shí)后，用4000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心30分鐘，沉降后棄去上清液，收集CaSO4沉淀。h、用去離子水對(duì)CaSO4沉淀反復(fù)洗脫三次，洗脫液合并在一起，然后在洗脫液中加入65% 75%飽和度的(NH4)2SO4,攪拌均勻，在4°C下靜置10小時(shí)，再用4000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心30分鐘，棄去上清液，得糜胰蛋白酶沉淀；最后用去離子水溶解后超濾，冷凍干燥，獲得了白色的糜胰蛋白酶凍干粉末。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是提取分離方法簡(jiǎn)便可行，適于工業(yè)化生產(chǎn)，在用CaCl2激活糜胰蛋白酶原成為糜胰蛋白酶的同時(shí)，加入飽和度的(NH4)2SO4H其生成CaSO4沉淀吸附糜胰蛋白酶，與彈性蛋白酶和胰酶等分開，不需要先采用鹽析多重結(jié)晶結(jié)合透析和乙醇及丙酮等有機(jī)溶劑法制備成糜胰蛋白酶的粗制品，再通過(guò)CM-纖維素柱層析和親和層析等復(fù)雜步驟，而直接經(jīng)過(guò)洗脫，鹽析、超濾和凍干步驟即可。如果需要進(jìn)一步分離糜胰蛋白酶的話，則可采用CM-纖維素將它們分離為糜蛋白酶和胰蛋白酶，這樣既節(jié)省了成本又縮短了時(shí)間， 由原來(lái)約需7 8天時(shí)間縮短到3 4天。每公斤胰臟可獲得凍干糜胰蛋白酶粉4. 0 4. 5克，其中糜蛋白酶的比活力為360U. /mg蛋白(氮)，胰蛋白酶的比活力為1380U. /mg蛋白(氮)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1本發(fā)明有下述順序步驟a、取新鮮牛胰臟為原料，除去脂肪和結(jié)締組織，用清水洗凈，再用絞肉機(jī)絞碎。b、取1公斤絞碎的牛胰臟移入不銹鋼桶中，加入4000毫升的自來(lái)水，用15% H2SO4 溶液將其調(diào)節(jié)至PH值為3.0，在室溫下不斷攪拌M小時(shí)，然后用4000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心 30分鐘，獲得浸取液I和胰臟殘?jiān)恋砦颕。C、將獲得的4000毫升浸取液I倒入浸取液桶內(nèi)備用，將胰臟殘?jiān)恋砦颕用PH 值為3. 0的自來(lái)水2000毫升進(jìn)行攪拌洗滌20分鐘，然后用4000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心30 分鐘，獲得浸取液II和胰臟殘?jiān)恋砦颕I。d、將浸取液II倒入浸取液桶內(nèi)，將胰臟殘?jiān)恋砦颕I用PH值為3. 0的自來(lái)水2000 毫升進(jìn)行攪拌洗滌20分鐘，然后用4000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心30分鐘，獲得浸取液III和胰臟殘?jiān)恋砦颕II，最后將浸取液III倒入浸取液桶中與浸取液I、II合并，棄去胰臟殘?jiān)恋砦颕II，另作他用，以免污染環(huán)境。e、在浸取液桶中，加入25%飽和度的(NH4)2SO4,即量浸取液總體積，每1升溶液加入144克固體硫酸銨，攪拌均勻，靜置2小時(shí)，用4000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心30分鐘，棄去雜蛋白沉淀，獲得了清的浸取液。
f、在獲得清的浸取液中加入70%飽和度的(NH4)2SO4,即再量清的浸取液體積，每 1升溶液加入307克固體硫酸銨，攪拌均勻，靜置8小時(shí)，用4000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心30分鐘，沉降后棄去浸取液，獲得了糜胰蛋白酶原的沉淀。g、將獲得的糜胰蛋白酶原沉淀用PH值為3. 0的去離子水200毫升溶解后加入5% CaCl2,攪拌均勻，在4°C 5°C下，靜置10小時(shí)，使Ca++離子激活糜胰蛋白酶原成為糜胰蛋白酶；然后在糜胰蛋白酶溶液中加入20%飽和度的(NH4)2SO4,即量糜胰蛋白酶溶液體積，每1 升溶液中加入114克固體硫酸銨，攪拌均勻，加溫至37°C，使浸取液中Ca++離子生成CaSO4
沉淀
權(quán)利要求
1. 一種提取糜胰蛋白酶的方法，該方法有以下順序步驟a、以新鮮牛胰臟或豬胰臟或冷凍牛胰臟或冷凍豬胰臟為原料，除去脂肪和結(jié)締組織， 用清水洗凈，再用絞肉機(jī)絞碎；b、將絞碎的胰臟移入不銹鋼桶中，加入自來(lái)水，其比例為1 4，用15%壓504溶液將其調(diào)節(jié)至PH值為3. 0，在室溫下不斷攪拌M小時(shí)，然后用4000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心30分鐘， 獲得浸取液I和胰臟殘?jiān)恋砦颕；c、將獲得的浸取液I倒入浸取液桶內(nèi)備用，將胰臟殘?jiān)恋砦颕用1 2的比例加入 PH值為3. 0的自來(lái)水進(jìn)行攪拌洗滌20分鐘，然后用4000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心30分鐘，獲得浸取液II和胰臟殘?jiān)恋砦颕I ；d、將浸取液II倒入浸取液桶內(nèi)；將胰臟殘?jiān)恋砦颕I用1 2的比例加入PH值為3.0 的自來(lái)水進(jìn)行攪拌洗滌20分鐘，然后用4000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心30分鐘，獲得浸取液III 和胰臟殘?jiān)恋砦颕II ；最后將浸取液III倒入浸取液桶中與浸取液I、II合并，棄去胰臟殘?jiān)恋砦颕II ；e、在浸取液桶中，加入25% 33%飽和度的(NH4)#04攪拌均勻，靜置2小時(shí)，然后用 4000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心30分鐘，棄去雜蛋白沉淀，獲得了清的浸取液；f、將獲得清的浸取液中再加入65% 75%飽和度的(NH4)2SO4,攪拌均勻，靜置8 10 小時(shí)，用4000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心30分鐘，沉降后棄去浸取液，獲得了糜胰蛋白酶原的沉淀；g、將獲得的糜胰蛋白酶原的沉淀用PH值為3.0的去離子水溶解后，加入5% 7% CaCl2,攪拌均勻，在4°C 5°C下，靜置10小時(shí)，使Ca++離子激活糜胰蛋白酶原成為糜胰蛋白酶；然后在糜胰蛋白酶溶液中加入20%飽和度的(NH4)2SO4，攪拌均勻，加溫至37°C，使溶液中 Ca++離子生成 CaS(U)m(CaCl2+ (ΝΗ4)23ο4 1 2NH4C1+CaSO4 1 )，吸附溶液中的糜胰蛋白酶，靜置10小時(shí)后，用4000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心30分鐘，沉降后棄去上清液，收集CaSO4沉淀；h、用去離子水對(duì)CaSO4沉淀反復(fù)洗脫三次，洗脫液合并在一起，然后在洗脫液中加入 65% 75%飽和度的(NH4)2SO4,攪拌均勻，在4°C下靜置10小時(shí)，再用4000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心30分鐘，棄去上清液，得糜胰蛋白酶沉淀；最后用去離子水溶解后超濾，冷凍干燥， 獲得了白色的糜胰蛋白酶凍干粉末。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，更具體地說(shuō)涉及一種提取糜胰蛋白酶的方法。本發(fā)明采用CaCl2激活糜胰蛋白酶原成為糜胰蛋白酶的同時(shí)加入飽和度的(NH4)2SO4，使其生成CaSO4沉淀吸附糜胰蛋白酶，不需要先采用鹽析多重結(jié)晶結(jié)合透析和乙醇及丙酮等的有機(jī)溶劑法制備成糜胰蛋白酶粗制品，再通過(guò)CM-纖維素柱層析和親和層析等復(fù)雜步驟，進(jìn)行純化制備，而直接經(jīng)過(guò)洗脫，鹽析、超濾和凍干步驟即可獲得白色的凍干粉末。本發(fā)明提取方法簡(jiǎn)便可行，適于工業(yè)化生產(chǎn)，這樣既節(jié)省了成本又縮短了時(shí)間，由原來(lái)約需7～8天時(shí)間縮短到3～4天。每公斤胰臟可獲得凍干糜胰蛋白酶粉4.0～4.5克，其中糜蛋白酶的比活力為360U./mg蛋白(氮)，胰蛋白酶的比活力為1380U./mg蛋白(氮)。
文檔編號(hào)C12N9/76GK102174495SQ20111002493
公開日2011年9月7日 申請(qǐng)日期2011年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月20日
發(fā)明者喬自林, 馮玉萍, 馮若飛, 印明善, 李明生, 蔡翠萍, 阮小華, 馬忠仁 申請(qǐng)人:印明善, 馬忠仁