專利名稱：：Pcr產(chǎn)物定性及半定量檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種PCR產(chǎn)物定性及半定量檢測(cè)試劑盒(彩色PCR試劑盒)。
背景技術(shù)：
：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)產(chǎn)物的檢測(cè)方法有定性和定量(包括半定量法)兩種，定性法通常通過(guò)凝膠電泳來(lái)完成，定量(半定量)法通過(guò)實(shí)時(shí)(realtime)熒光標(biāo)記PCR法來(lái)完成PCR產(chǎn)物的測(cè)定。兩種方法的測(cè)定對(duì)象都是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)產(chǎn)物的核酸部分?，F(xiàn)在技術(shù)可參考以下文獻(xiàn)(1)Tagiri-EndoM，Acolorimetricassayforinorganicpyrophosphatethatisalsousefulformeasuringproductaccumulationinpolymerasechainreactions.Anal.Biochem.,2003,315(2):170-4.(2)R.Hisada,T.Yagi,l-Methoxy-5-MethylphenaziniumMethylSulfateAPhotochemicalIyStableElectronMediatorbetweenNADHandVariousElectronAcceptors,J.Biochem.，1977，82(5)，1469-1473.(3)八木達(dá)彥，1-乂卜今〉PMS,DojinNews，1979，14，1.(4)S.Nakamura,K.Arimura,K.Ogawa,T.Yagi，Useofl-Methoxy-5-methyIphenaziniumMethylSulfate(I-Methoxypms)intheAssayofSomeEnzymesofDiagnosticimportance，Clin.Chim.Acta，1980，101，321-323.(5)R.Hisada，W.Shinkai，T.Yagi，PhotochemicalStabilitiesandBiochemicalReactivitiesofSomeDerivativesof5~MethylphenaziniumMethylSulfate(PhenazineMethosulfate)，J.App1.Biochem.，1981，3，535-538.(6)C.J.F.V.Noorden，J.Tas，TheRoleofExogenousElectronCarriersinNAD(P)-dependentDehydrogenaseCytochemistryStudiedinvitroandwithaModelSystemofPolyacrylamideFilms,J.Histochem.Cytochem.,1982,30,12-15.(7)H.Tsuge,Y.Kuroda,A.Iwamoto,K.Ohashi,PartialPurificationandPropertyofPyridoxine(Pyridoxamine)-5'-phosphateOxidaseIsozymesfromWheatSeedlings，Arch.Biochem.Biophys.，1982，217，479—483.(8)Μ.Rabinovitch,J-P.Dedet，A.Ryter,R.Robineaux,G.Topper,E.Brunet,DestructionofLeishmaniaMexicanaAmazonensisAmastigotesWithinMacrophagesinCulturebyPhenazineMethosulfateandOtherElectronCarriers，J.Exp.Med.，155,1982.415-416.(9)田部一弘，河崎孝男，前田昌子，辻章夫，藪內(nèi)正彥，1-乂卜今〉7二f乂卜寸卟7工一卜及y^/一卟奩用卜冬還元型二-子夕了笑卜、了r二夕夕又夕卜才千卜、ο化學(xué)発光分析法i生體成分ο分析ο応用，分析化學(xué)，1987，36,82-84.(10)須藤幸夫，石澤春生，前田昌子，辻章夫，I-^卜#、〉7工f夕卜寸義7工一卜及t/4yJi</^mzxξ>還元型二2手父了笑卜·’了r二父夕5夕才手卜·’Q化學(xué)発光全用0317α-tK口*/口yζ歹口>CO化學(xué)発光酵素，分析化學(xué)，1988，37，185-187.(Il)K.Yanoetal,FormazanMetalcomplexes,USPatent6,2003,645,595.現(xiàn)有的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)產(chǎn)物定性檢測(cè)方法需要凝膠電泳或?qū)崟r(shí)熒光PCR法。通過(guò)凝膠電泳方法只可檢測(cè)少量樣品，優(yōu)點(diǎn)是測(cè)定準(zhǔn)確。但是，對(duì)于檢測(cè)大量樣品，凝膠電泳比較麻煩，耗時(shí)耗力耗經(jīng)費(fèi)。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法進(jìn)行定量檢測(cè)，要求使用的儀器比較貴重、操作復(fù)雜、并且受到場(chǎng)地等條件的限制，應(yīng)用普及性差。
發(fā)明內(nèi)容為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種PCR產(chǎn)物定性及半定量檢測(cè)試劑盒(彩色PCR試劑盒)及其用途。本發(fā)明提供的PCR產(chǎn)物定性及半定量檢測(cè)方法，測(cè)定的對(duì)象是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的副產(chǎn)物焦磷酸(PPi)。利用試劑盒中的試劑與焦磷酸(PPi)反應(yīng)，最終生成物為甲暨，英文名為formazan，是含H2N-N=CH-N=NH結(jié)構(gòu)的化合物的總稱，呈紅色。通過(guò)顯色現(xiàn)象(紅色)判斷聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的陽(yáng)性結(jié)果，實(shí)現(xiàn)PCR反應(yīng)的定性檢測(cè)；或通過(guò)測(cè)定490nm處的吸光度值半定量檢測(cè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)過(guò)程中生成的副產(chǎn)物焦磷酸(PPi)的含量，間接半定量檢測(cè)PCR產(chǎn)物的生成量，因?yàn)樵赑CR反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的焦磷酸(PPi)和PCR產(chǎn)物的核酸部分比例恒定。本發(fā)明涉及的化學(xué)反應(yīng)結(jié)構(gòu)式和化學(xué)反應(yīng)方程式如圖1和圖2所示。為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案一種用于PCR產(chǎn)物定性及半定量檢測(cè)試劑盒，包含組分A、組分B、組分C和組分D，其中組分A含有次黃嘌呤核苷單磷酸和黃嘌呤氧化酶，組分B含有氯化碘硝基四唑和次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶，組分C含有焦磷酸，組分D為水。上述的試劑盒中，各組分優(yōu)選按以下比例配置組分yU2ml)包含次黃嘌呤核苷單磷酸Hmg；黃嘌呤氧化酶0.8U，用滅菌水補(bǔ)充到2ml；組分B(8ml)包含氯化碘硝基四唑IOmg；次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶8U，用滅菌水補(bǔ)充到anl；組分C(IOOml)包含焦磷酸10mg，滅菌水補(bǔ)充到IOOml；組分D(IOOml)滅菌水。本發(fā)明還進(jìn)一步提供了上述試劑盒用于定性檢測(cè)PCR產(chǎn)物的用途，包括如下步驟取組分A與PCR反應(yīng)產(chǎn)物混合，置于60°C下10分鐘，然后加入組分B和組分D，其中對(duì)照加組分D，其余加組分B，置于60°C下20分鐘，觀察終產(chǎn)物的顏色，若呈紅色即說(shuō)明存在PCR產(chǎn)物。本發(fā)明還進(jìn)一步提供了上述試劑盒用于半定量檢測(cè)PCR產(chǎn)物的用途，包括如下步驟1)繪制焦磷酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線用組分D把組分C分別稀釋若干倍，形成一定濃度梯度的焦磷酸稀釋液；取20μ1組分A與100μ1焦磷酸稀釋液混合，置于60°C下10分鐘，然后加入80μ1組分B和組分D，其中對(duì)照加組分D，其余加組分B，置于60°C下20分鐘，取150μ1反應(yīng)液在紫外分光光度計(jì)上測(cè)490nm處的吸光度值，分別以ΔOD=OD49tl-OD作縱坐標(biāo)，焦磷酸濃度(常用對(duì)數(shù)值)為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；2)測(cè)定樣品取20μ1組分A與100μ1PCR產(chǎn)物混合，置于60°C下10分鐘，然后加入80μ1組分B和組分D，其中對(duì)照加組分D，其余加組分B，置于60°C下20分鐘，取150μ1反應(yīng)液在紫外分光光度計(jì)上測(cè)490nm處的吸光度值，分別求ΔOD=OD49tl-ODs自值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線方程算出焦磷酸濃度，進(jìn)而算出PCR產(chǎn)物濃度。本發(fā)明具有如下技術(shù)效果本發(fā)明的PCR產(chǎn)物定性及半定量檢測(cè)試劑盒用于定性檢測(cè)PCR反應(yīng)產(chǎn)物或半定量檢測(cè)PCR產(chǎn)物生成量，操作簡(jiǎn)單。定性檢測(cè)PCR反應(yīng)產(chǎn)物不需要進(jìn)行凝膠電泳，半定量檢測(cè)PCR產(chǎn)物生成量實(shí)驗(yàn)操作要求的條件低，有一臺(tái)分光光度計(jì)就能完成吸光度的測(cè)定，不受實(shí)驗(yàn)場(chǎng)地等的限制，應(yīng)用普及性高。此試劑盒更適合高通量定性篩選，一次測(cè)定樣品越多越能顯示出應(yīng)用此試劑盒的優(yōu)越性。應(yīng)用此試劑盒定性檢測(cè)不需要制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，半定量檢測(cè)需要制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。彩色PCR試劑盒法檢測(cè)PCR產(chǎn)物的敏感度(2.5ng)與凝膠電泳法檢測(cè)PCR產(chǎn)物的敏感度(4ng)相當(dāng)。圖1本發(fā)明涉及的化學(xué)反應(yīng)結(jié)構(gòu)式圖2本發(fā)明涉及的化學(xué)反應(yīng)方程式圖3焦磷酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖4瓊脂糖凝膠電泳5彩色PCR檢測(cè)效果圖圖6彩色PCR試劑盒-定量檢測(cè)T4DNA連接酶(3個(gè)批次)活性結(jié)果7彩色PCR試劑盒定量檢測(cè)DNA聚合酶I活性結(jié)果8彩色PCR試劑盒用于檢測(cè)終端脫氧核糖轉(zhuǎn)移酶活性收集范圍的結(jié)果圖具體實(shí)施例方式以下實(shí)驗(yàn)操作化學(xué)試劑主要購(gòu)于Sigma公司，焦磷酸鹽購(gòu)于和光(Wako)公司，使用的脫氧核糖核酸(DNA)聚合酶、DNA連接酶等，如無(wú)特別說(shuō)明均購(gòu)于Takara公司，所有實(shí)驗(yàn)均按生物化學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的常規(guī)操作。以下僅示例性的說(shuō)明本發(fā)明的試劑盒及用途，但不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。本發(fā)明提供的檢測(cè)試劑盒包括(100次反應(yīng)量)組分M2ml)包含次黃嘌呤核苷單磷酸Gnosine5’-monophosphate,IMP；分子量為；348.20)(Sigma,CodeNo.1沘79)14mg；黃嘌呤氧化酶(Xanthineoxydase，XOD；規(guī)格為0.4U/ml)(Sigma,CodeNo.=X2252)0.8U(1U定義為在25°C、pH7.5的條件下，每分鐘把1.0μmol的黃嘌呤轉(zhuǎn)化成尿酸)。用滅菌水補(bǔ)充到ani.組分B(8ml)包含氯化碘硝基四唑((Iodonitrotetrazoliumchloride,INT)；分子量為505.70)(Sigma,CodeNo.18377)IOmg；次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(hypoxanthine-guaninephosphoribosyltransferase,HGPRT；濃度為5U/ml)(Sigma,CodeNo.:3389)8U(1U定義為在37°C、pH7.5的條件下，每分鐘催化鳥(niǎo)苷酸(guanine)和磷酸核Il基焦舞酸(phosphoribosylpyrophosphate,PRPP)生成Inmol鳥(niǎo)1g1單憐酸(guanosine5，-monophosphate,GMP))。用滅菌7jC補(bǔ)充至1J8ml.組分C(IOOml)包含焦磷酸(PPi，分子量為330.34)(Wako，CodeNo.:349-01503)IOmg0滅菌水補(bǔ)充到IOOml.組分D(IOOml)滅菌水·試劑盒的運(yùn)輸、保存及注意事項(xiàng)本試劑盒在_20°C條件下運(yùn)輸，在4°C條件下保存，組分A必須避光保存；試劑盒中各組分穩(wěn)定性在6個(gè)月以上；試劑允許在室溫條件下開(kāi)蓋。利用試劑盒中的試劑反應(yīng)結(jié)束后應(yīng)迅速測(cè)定吸光度值。本發(fā)明提供的試劑盒的使用1、繪制焦磷酸(PPi)的標(biāo)準(zhǔn)曲線用組分D把組分C分別稀釋300倍、150倍、60倍、30倍、15倍、10倍，用組分D定容到100μ1，焦磷酸的終濃度分別為lOymol/L、20μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、300μmol/L,供繪制焦磷酸(PPi)的標(biāo)準(zhǔn)曲線用。取20μ1組分A與100μ1焦磷酸稀釋液混合，置于60°C下10分鐘，然后加入80μ1組分B或組分D(對(duì)照加組分D，其余加組分B)，置于60°C下20分鐘，取150μ1反應(yīng)液在紫外分光光度計(jì)上測(cè)490nm處的吸光度值，分別求ΔOD=OD49tl-ODse作縱坐標(biāo)，Ig(PPiμmol/L)為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)該如圖3所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)方差(R2)不應(yīng)小于0.980.2、測(cè)定樣品取20μ1組分A與100μ1PCR產(chǎn)物混合，置于60°C下10分鐘，然后加入80μ1組分B或組分D(對(duì)照加組分D，其余加組分B)，置于60°C下20分鐘，取150μ1反應(yīng)液在紫外分光光度計(jì)上測(cè)490nm處的吸光度值，分別求ΔOD=OD49tl-ODse值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線方程算出lg(PPiμmol/L)值，算出PPi濃度，進(jìn)而算出PCR產(chǎn)物濃度。實(shí)施例1彩色PCR試劑盒定性檢測(cè)效果實(shí)驗(yàn)，確定檢測(cè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物的最低值以lambdaDNA為模板為例，進(jìn)行500bp目的片段PCR擴(kuò)增，但并不限于此。PCR體系為10XPCR緩沖液10μ1，15mMMgCl24μ1,2.5mMdNTPmix8μ1，20μΜlambdalprimer>lambda2primer#1μ1，11DNA20200pg,TaqDNA^^g|(5U/μ1)0.5μ1，補(bǔ)水至100μ1。反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性30秒；94°C變性30秒，55°C退火30秒，72°C伸長(zhǎng)反應(yīng)30秒；25個(gè)循環(huán)。1、瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物量為lOOng/uL，稀釋100倍，濃度為Ing/uL，瓊脂糖凝膠電泳(1.0%)，上樣量分別為100uL、50uL、20uL、15uL、10uL、8uL、6uL、4uL、2uL、luL、0.5uL、0.luL。電泳結(jié)果如圖4所示，由圖4可以看出，標(biāo)記為^g的孔道微微能看到DNA條帶，說(shuō)明如gPCR的產(chǎn)物能夠被瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)出來(lái)。瓊脂糖凝膠電泳難以檢測(cè)低于^gPCR的產(chǎn)物。2、彩色PCR試劑盒檢測(cè)PCR產(chǎn)物量為IOOng/μL，稀釋不同濃度(1000，750，500，250，125，25，12.5，2.5，1.25，0.25ng/100wL)，各濃度產(chǎn)物樣品100μ1，分別加入組分A20μ1，震蕩混勻，60°C，10分鐘，加入組分B80μ1，震蕩混勻，60°C，20分鐘，結(jié)果如圖5所示。由圖5可以看出，標(biāo)記為2.5的EP管微微顯紅色，說(shuō)明2.5ng的PCR產(chǎn)物能夠被檢測(cè)出來(lái)。彩色PCR試劑盒檢測(cè)PCR產(chǎn)物的最低量與瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物的最低量相當(dāng)。實(shí)施例2、彩色PCR試劑盒定量檢測(cè)效果實(shí)驗(yàn)1、以T4DNA連接酶(Ligase)活性(三個(gè)批次K2900、Κ3000、Κ3100)定量檢測(cè)為例，證實(shí)彩色PCR試劑盒定量檢測(cè)效果。在EP管中加入5ηΜ的pBglIILinker15uL，10倍的緩沖液3uL，T4DNA連接酶(不同濃度)luL，用水補(bǔ)充到30uL，在16°C條件下反應(yīng)70分鐘，90°C下加熱5分鐘，加入70uL水。再加入20uL組分A，60°C下反應(yīng)10分鐘，加入80uL組分B，60°C下反應(yīng)20分鐘，測(cè)定權(quán)利要求1.一種用于PCR產(chǎn)物定性及半定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于包含組分A、組分B、組分C和組分D，其中組分A含有次黃嘌呤核苷單磷酸和黃嘌呤氧化酶，組分B含有氯化碘硝基四唑和次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶，組分C含有焦磷酸，組分D為水。2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于各組分按以下比例配置組分A包含次黃嘌呤核苷單磷酸Hmg；黃嘌呤氧化酶0.8U，用滅菌水補(bǔ)充到2ml；組分B包含氯化碘硝基四唑IOmg；次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶8U，用滅菌水補(bǔ)充到8ml；組分C包含焦磷酸10mg，滅菌水補(bǔ)充到IOOml；組分D滅菌水。3.如權(quán)利要求1或2所述試劑盒用于定性檢測(cè)PCR產(chǎn)物的用途，包括如下步驟取組分A與PCR反應(yīng)產(chǎn)物混合，置于60°C下10分鐘，然后加入組分B和組分D，其中對(duì)照加組分D，其余加組分B，置于60°C下20分鐘，觀察終產(chǎn)物的顏色，若呈紅色即說(shuō)明存在PCR產(chǎn)物。4.如權(quán)利要求1或2所述試劑盒用于半定量檢測(cè)PCR產(chǎn)物的用途，包括如下步驟1)繪制焦磷酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線用組分D把組分C分別稀釋若干倍，形成一定濃度梯度的焦磷酸稀釋液；取20μ1組分A與100μ1焦磷酸稀釋液混合，置于60°C下10分鐘，然后加入80μ1組分B和組分D，其中對(duì)照加組分D，其余加組分B，置于60°C下20分鐘，取150μ1反應(yīng)液在紫外分光光度計(jì)上測(cè)490nm處的吸光度值，分別以ΔOD=OD49tl-OD作縱坐標(biāo)，焦磷酸濃度為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；2)測(cè)定樣品取20μ1組分A與100μ1PCR產(chǎn)物混合，置于60°C下10分鐘，然后加入80μ1組分B和組分D，其中對(duì)照加組分D，其余加組分B，置于60°C下20分鐘，取150μ1反應(yīng)液在紫外分光光度計(jì)上測(cè)490nm處的吸光度值，分別求ΔOD=OD49tl-ODse值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線方程算出焦磷酸濃度，進(jìn)而算出PCR產(chǎn)物濃度。全文摘要本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種PCR產(chǎn)物定性及半定量檢測(cè)試劑盒(彩色PCR試劑盒)。該試劑盒包含多種試劑，如次黃嘌呤核苷單磷酸、黃嘌呤氧化酶、氯化碘硝基四唑、次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶和焦磷酸等?？捎糜诙ㄐ曰虬攵繖z測(cè)PCR反應(yīng)產(chǎn)物。文檔編號(hào)C12Q1/68GK102146451SQ201110025040公開(kāi)日2011年8月10日申請(qǐng)日期2011年1月24日優(yōu)先權(quán)日2011年1月24日發(fā)明者李國(guó)瑞,翟景波,陳永勝申請(qǐng)人:內(nèi)蒙古民族大學(xué)