專利名稱：一種重組病毒及利用該病毒生產(chǎn)l-天冬酰胺酶ⅱ的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組質(zhì)粒，屬于生物科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
L-天冬酰胺酶II，能專一性地催化L-天冬酞胺水解生成L-天冬氨酸和氨。它是一種重要的蛋白類抗腫瘤藥物，在臨床上廣泛用于淋巴瘤和兒童急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL )的治療，還可用于黑素肉瘤、霍金森病、胰腺癌等疾病的治療。目前，L-天冬酰胺酶II 的生產(chǎn)大多采用以大腸桿菌為宿主的基因工程菌，在生產(chǎn)上存在著生產(chǎn)水平低和分離純化步驟繁多兩方面問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的提供一種重組病毒，該病毒具有多角體基因和L-天冬酰胺酶II基因，因此可通過將該重組病毒轉(zhuǎn)移到家蠶中生產(chǎn)出以共價鍵連接多角體蛋白的L-天冬酰胺酶II，再通過多角體進(jìn)行分離純化L-天冬酰胺酶II，該重組病毒在家蠶體內(nèi)具有表達(dá)水平高的特點，通過多角體進(jìn)行分離純化得到的L-天冬酰胺酶II具有純度高的特點。本發(fā)明的上述技術(shù)目的是通過以下技術(shù)方案得以實現(xiàn)的 一種重組病毒，它是通過以下方法制備的
①以家蠶桿狀病毒DNA為模板，以SEQID No. 1和SEQ ID No. 2分別為上下游引物，通過PCR擴(kuò)增反應(yīng)，制得具有BamH I酶切位點和Ecor I酶切位點的擴(kuò)增產(chǎn)物polh ；以大腸桿菌JM109基因組DNA為模板，以SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4分別為上下游引物，通過PCR 擴(kuò)增反應(yīng)，制得具有BamH I酶切位點和Hind III的擴(kuò)增產(chǎn)物asp ；
②將polh通過BamHI和Ecor I倆酶切位點雙酶切克隆至pFastbacl質(zhì)粒，制得重組質(zhì)粒pFastbacl-polh ；將asp通過BamH I和Hind III倆酶切位點雙酶切克隆至 PFastBacHTB 質(zhì)粒，制得重組質(zhì)粒 pFastBacHTB-asp ；
③以重組質(zhì)粒pFastBacHTB-asp為模板，以SEQID No. 4和SEQ ID No. 5分別為上下游引物，通過PCR擴(kuò)增反應(yīng)，制得具有EcoR I酶切位點和Hind III酶切位點的擴(kuò)增產(chǎn)物 tev-asp ；
④將tev-asp通過EcoRI和Hind III倆酶切位點克隆至pFastbacl-polh質(zhì)粒，制得重組質(zhì)粒 pFastbacl-polh-asp ；
⑤將重組質(zhì)粒pFastbacl-polh-asp在大腸桿菌toDHlOBac中轉(zhuǎn)化，并在含有抗生素的環(huán)境中培養(yǎng)，然后通過藍(lán)白斑篩選獲得陽性菌斑，再從該陽性菌斑中抽提質(zhì)粒DNA;再將該質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞BmN細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后分離培養(yǎng)基上清液，獲得含有家蠶桿狀病毒的多角體蛋白基因和大腸桿菌的L-天冬酰胺酶II基因的重組病毒；
SEQ ID No. 1 AGGGATCCatgccgaattattcatac ； SEQ ID No. 2 :CCGAATTCatacgccggaccagtgaa ； SEQ ID No. 3 :GAGGGATCCGAAAACCTGTATTTTCAG ；SEQ ID No. 4 :GGAAGCTTTTAGTACTGATTGAAGATCTGCT ； SEQ ID No. 5 :GAGGAATTCGAAAACCTGTATTTTCAG。本發(fā)明的另一個目的在于提供一種利用上述病毒生產(chǎn)和提純L-天冬酰胺酶II的方法。一種利用上述病毒生產(chǎn)和提純L-天冬酰胺酶II的方法用上述病毒感染家蠶，在該家蠶的BmN細(xì)胞中，分離得到以共價鍵連接多角體蛋白的L-天冬酰胺酶II，然后通過純化所述多角體蛋白來純化所述以共價鍵連接多角體蛋白的L-天冬酰胺酶II，再通過TEV酶酶切去除以共價鍵連接多角體蛋白的L-天冬酰胺酶II的多角體蛋白，制得純凈的L-天冬酰胺酶II。本發(fā)明所實現(xiàn)的技術(shù)效果如下
本發(fā)明將多角體蛋白基因和大腸桿菌L-天冬酰胺酶II基因中間以TEV酶酶切位點對應(yīng)的核苷酸連接構(gòu)建成融合基因，通過轉(zhuǎn)移載體在to DHlOBac中與BmBacmid同源重組形成含有多角體蛋白基因和大腸桿菌L-天冬酰胺酶II基因的重組BmBacmid，通過轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞BmN所獲得的重組病毒恢復(fù)了多角體基因，因而在觀察病毒感染的細(xì)胞時，會看到多角體。這種表達(dá)系統(tǒng)不僅可以獲得更多的融合大腸桿菌L-天冬酰胺酶II，而且蛋白可以通過多角體來純化，簡化了純化的流程。通過TEV酶酶切去除多角體蛋白，獲得純的大腸桿菌 L-天冬酰胺酶II。利用本發(fā)明提供的含有多角體蛋白基因和大腸桿菌L-天冬酰胺酶II基因的重組桿狀病毒可以把家蠶做為生物反應(yīng)器，大量地生產(chǎn)大腸桿菌L-天冬酰胺酶II。家蠶生物反應(yīng)器有以下幾個優(yōu)點①高效表達(dá)多角體基因和PlO基因有非常強(qiáng)大的啟動子能驅(qū)動靶基因的高水平表達(dá)，可以達(dá)到細(xì)胞總蛋白的25%左右，家蠶幼蟲體內(nèi)表達(dá)外源基因，表達(dá)效率可高于培養(yǎng)細(xì)胞10 - 100倍，每頭蠶的表達(dá)量可達(dá)毫克級。②表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定蠶體中有多種天然蛋白質(zhì)保護(hù)劑，對表達(dá)產(chǎn)物有保護(hù)作用，使基因表達(dá)產(chǎn)物十分穩(wěn)定。③安全性好 桿狀病毒僅是昆蟲或節(jié)肢動物的病毒，對人畜無毒無害。利用本發(fā)明提供的含有多角體蛋白基因和大腸桿菌L-天冬酰胺酶II基因的重組桿狀病毒可以更簡便地純化大腸桿菌L-天冬酰胺酶II。
具體實施例方式本具體實施例僅僅是對本發(fā)明的解釋，其并不是對本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀完本說明書后可以根據(jù)需要對本實施例做出沒有創(chuàng)造性貢獻(xiàn)的修改，但只要在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍內(nèi)都受到專利法的保護(hù)。①.根據(jù)家蠶桿狀病毒多角體基因序列，設(shè)計POlh引物，引物設(shè)計如下上游引物 polh-F: AGGGATCCatgccgaattattcatac ( Tr;^茲表示 BamH I 酶切位點)SEQ ID No. 1 ；下游弓I物polh-R CcGAATTCatacRccRRaccaRtRaa (下劃線表示EcoR I 酶切位點)SEQ ID No. 2 ；
根據(jù)大腸桿菌JM109基因組DNA序列，設(shè)計大腸桿菌JM109 L-天冬酰胺酶II基因 (asp)引物，引物設(shè)計如下上游引物asp-F: CGGGATCCATGTTACCCAATATCACCAT (下劃線表示 BamH I 酶切位點)SEQ ID No. 3 下游引物 asp-R:GGAAGCTTTTAGTACTGATTGAAGATCTGCT (下劃線表示Hind III酶切位點)SEQ ID No. 4 ； ②.PCR擴(kuò)增以家蠶桿狀病毒DNA為模板，以SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2分別為上下游引物，通過 PCR擴(kuò)增反應(yīng)，制取具有BamH I酶切位點和Ecor I酶切位點的擴(kuò)增產(chǎn)物polh ；具體的PCR 反應(yīng)參數(shù)設(shè)計為94°C預(yù)變性5min，94°C變性lmin，60°C復(fù)性40s，72°C延伸lmin，30個循環(huán)；
以大腸桿菌JM109基因組DNA為模板，以SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4分別為上下游引物，通過PCR擴(kuò)增反應(yīng)，制取具有BamH I酶切位點和Hind III的擴(kuò)增產(chǎn)物asp ；具體的PCR 反應(yīng)參數(shù)設(shè)計為94°C預(yù)變性5min，94°C變性lmin，56°C復(fù)性40s，72°C延伸lmin，30個循環(huán)；
待反應(yīng)結(jié)束后，瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增片段，同時切膠回收目的片段；
③.將polh通過BamHI和Ecor I倆酶切位點雙酶切克隆至pFastbacl質(zhì)粒，制得重組質(zhì)粒pFastbacl-polh;將asp通過BamH I和Hind III倆酶切位點雙酶切克隆至 PFastBacHTB 質(zhì)粒，制得重組質(zhì)粒 pFastBacHTB-asp ；
④.以重組質(zhì)粒pFastBacHTB-asp為模板，以SEQID No. 4和SEQ ID No. 5分別為上下游引物，通過PCR擴(kuò)增反應(yīng)，制得具有EcoR I酶切位點和Hind III酶切位點的擴(kuò)增產(chǎn)物tev-asp ；具體的PCR反應(yīng)參數(shù)設(shè)計為94°C預(yù)變性5min，94°C變性lmin，55°C復(fù)性40s， 72°C延伸lmin，30個循環(huán);
⑤.將tev-asp通過EcoRI和Hind III倆酶切位點克隆至pFastbacl-polh質(zhì)粒，制得重組質(zhì)粒 pFastbacl-polh-asp。⑥.將重組轉(zhuǎn)移載體pFastbacl-polh-asp轉(zhuǎn)化to DHlOBac,在含有卡那霉素 50 μ g/mL，慶大霉素 7 μ g/mL，四環(huán)素 10 μ g/mL，IPTG 40 μ g/mL，X 一 gal 100 μ g/mL 的培養(yǎng)板上培養(yǎng)過夜，翌日通過藍(lán)白斑篩選獲得陽性菌斑，隨后從陽性菌斑從抽提桿粒DNA，該桿粒DNA即為重組病毒的基因組。將此DNA轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞BmN。準(zhǔn)備桿粒DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物，溶液A:取重組Bacmid(S-IOyg),加入無血清to細(xì)胞培養(yǎng)基補(bǔ)充體積至IOOyL;溶液B 取脂質(zhì)體8 μ L，加入92 μ L無血清to細(xì)胞培養(yǎng)基。將溶液A和溶液B混勻，室溫靜置 15min。取生長良好的BmN細(xì)胞，用無血清昆蟲&ιι培養(yǎng)基培養(yǎng)基洗2 3次，加入800 μ L 無血清的to細(xì)胞培養(yǎng)基后，再加入準(zhǔn)備好的質(zhì)粒DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物200 μ L0 繼續(xù)培養(yǎng)4h后，加ImL含有20%血清的to細(xì)胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。繼續(xù)培養(yǎng)120小時后，在光學(xué)顯微鏡下觀察多角體的形成。分離培養(yǎng)基上清液，獲得含有多角體蛋白基因和大腸桿菌 L-天冬酰胺酶II基因的重組病毒。⑦.將獲得的重組病毒感染BmN細(xì)胞，72小時后收集感染的細(xì)胞，分離得到以共價鍵連接多角體蛋白的L-天冬酰胺酶II，然后通過純化所述多角體蛋白來純化所述以共價鍵連接多角體蛋白的L-天冬酰胺酶II，再通過TEV酶酶切去除以共價鍵連接多角體蛋白的 L-天冬酰胺酶II的多角體蛋白，制得純凈的L-天冬酰胺酶II。L-天冬酰胺酶II活性分析
L-天冬酰胺酶II 一個單位的酶活性定義為能使底物每分鐘釋放切1 μ mol氨的酶量。相關(guān)蛋白質(zhì)濃度的測定方法采用BCA法?；钚允褂媚问显噭?the Nessler reagent)來檢測L-天冬酰胺酶II的活性。標(biāo)準(zhǔn)濃度樣品為己知濃度的硫酸銨。為排除桿狀病毒自身的影響，以BmBacPAK6為對照。具體步驟如下將上述收集的細(xì)胞懸浮在2mL PBS中，與冰上超聲波破碎。破碎條件為強(qiáng)度70，每超聲15s，于冰中靜置15s，如此反復(fù)20次。超聲完畢后于4°C條件下，12000rpm,離心15min，收集上清于冰上備用。將100 μ L的上清與終濃度為0. 25%的底物L(fēng)-Asn (溶于 IOOmM PBS, PH 8. 0)混合，在37°C的水浴中孵育15min，立即用終濃度5%的三氯醋酸溶液終止反應(yīng)。加入奈氏試劑，室溫反應(yīng)15min后于450nm波長下讀取吸收值以檢測酶反應(yīng)釋放出的氨。經(jīng)計算在家蠶細(xì)胞BmN中表達(dá)的重組大腸桿菌L-天冬酰胺酶II活性為5940U/ mg。這比在大腸桿菌中的表達(dá)量高。由于家蠶幼蟲體內(nèi)表達(dá)外源基因表達(dá)效率可高于培養(yǎng)細(xì)胞10 - 100倍，每頭蠶的表達(dá)量可達(dá)毫克級，因此它為在醫(yī)學(xué)和治療領(lǐng)域上的應(yīng)用開辟了廣闊的前景。
權(quán)利要求
1.一種重組病毒，其特征在于它是通過以下方法制備的①以家蠶桿狀病毒DNA為模板，以SEQID No. 1和SEQ ID No. 2分別為上下游引物，通過PCR擴(kuò)增反應(yīng)，制得具有BamH I酶切位點和Ecor I酶切位點的擴(kuò)增產(chǎn)物polh ；以大腸桿菌JM109基因組DNA為模板，以SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4分別為上下游引物，通過PCR 擴(kuò)增反應(yīng)，制得具有BamH I酶切位點和Hind III的擴(kuò)增產(chǎn)物asp ；②將polh通過BamHI和Ecor I倆酶切位點雙酶切克隆至pFastbacl質(zhì)粒，制得重組質(zhì)粒pFastbacl-polh ；將asp通過BamH I和Hind III倆酶切位點雙酶切克隆至 PFastBacHTB 質(zhì)粒，制得重組質(zhì)粒 pFastBacHTB-asp ；③以重組質(zhì)粒pFastBacHTB-asp為模板，以SEQID No. 4和SEQ ID No. 5分別為上下游引物，通過PCR擴(kuò)增反應(yīng)，制得具有EcoR I酶切位點和Hind III酶切位點的擴(kuò)增產(chǎn)物 tev-asp ；④將tev-asp通過EcoRI和Hind III倆酶切位點克隆至pFastbacl-polh質(zhì)粒，制得重組質(zhì)粒 pFastbacl-polh-asp ；⑤將重組質(zhì)粒pFastbacl-polh-asp在大腸桿菌toDHlOBac中轉(zhuǎn)化，并在含有抗生素的環(huán)境中培養(yǎng)，然后通過藍(lán)白斑篩選獲得陽性菌斑，再從該陽性菌斑中抽提質(zhì)粒DNA;再將該質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞BmN細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后分離培養(yǎng)基上清液，獲得含有家蠶桿狀病毒的多角體蛋白基因和大腸桿菌的L-天冬酰胺酶II基因的重組病毒；SEQ ID No. 1 AGGGATCCatgccgaattattcatac ；SEQ ID No. 2 :CCGAATTCatacgccggaccagtgaa ；SEQ ID No. 3 GAGGGATCCGAAAACCTGTATTTTCAG ；SEQ ID No. 4 :GGAAGCTTTTAGTACTGATTGAAGATCTGCT ；SEQ ID No. 5 :GAGGAATTCGAAAACCTGTATTTTCAG。
2.利用權(quán)利要求1所述病毒生產(chǎn)L-天冬酰胺酶II的方法，其特征在于用上述病毒感染家蠶，在該家蠶的BmN細(xì)胞中，分離得到以共價鍵連接多角體蛋白的L-天冬酰胺酶II，然后通過純化所述多角體蛋白來純化所述以共價鍵連接多角體蛋白的L-天冬酰胺酶II，再通過TEV酶酶切去除以共價鍵連接多角體蛋白的L-天冬酰胺酶II的多角體蛋白，制得純凈的L-天冬酰胺酶II。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種重組病毒及利用該病毒生產(chǎn)L-天冬酰胺酶Ⅱ的方法，屬于生物科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的目的是提供一種重組病毒，該病毒具有多角體基因和L-天冬酰胺酶Ⅱ基因，因此可通過將該重組病毒轉(zhuǎn)移到家蠶中生產(chǎn)出以共價鍵連接多角體蛋白的L-天冬酰胺酶Ⅱ，再通過多角體進(jìn)行分離純化L-天冬酰胺酶Ⅱ，該重組病毒在家蠶體內(nèi)具有表達(dá)水平高的特點，通過多角體進(jìn)行分離純化得到的L-天冬酰胺酶Ⅱ具有純度高的特點。
文檔編號C12R1/19GK102181405SQ201110027008
公開日2011年9月14日 申請日期2011年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月25日
發(fā)明者占鵬飛, 吳巖, 施國方, 王文兵, 費(fèi)建明 申請人:湖州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院