專利名稱：一種無(wú)標(biāo)簽結(jié)核融合蛋白TB10-Ag85B的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因工程重組蛋白，具體地說(shuō)是一種無(wú)標(biāo)簽結(jié)核融合蛋白 TB10-Ag85B,屬于疫苗制造技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
結(jié)核病是長(zhǎng)期危害人類健康的嚴(yán)重疾病之一，全世界仍有近1/3的人感染過(guò)結(jié)核分枝桿菌，大約有5%的結(jié)核感染者在2-5年內(nèi)會(huì)發(fā)展為肺結(jié)核病人，其余的有可能會(huì)形成結(jié)核病的潛伏感染者。我國(guó)是結(jié)核病高負(fù)擔(dān)的國(guó)家之一，每年約有13萬(wàn)人因結(jié)核病而死亡。目前，卡介苗(BCG)的接種是有效預(yù)防結(jié)核病的重要措施。然而，不同研究顯示， BCG在不同人群中的保護(hù)性不穩(wěn)定，尤其是對(duì)成人肺結(jié)核的保護(hù)效率介于0-80%不等。因此，研制和開(kāi)發(fā)全面高效的抗結(jié)核疫苗是控制結(jié)核病的重要途徑?？晒┭芯康目菇Y(jié)核疫苗有亞單位疫苗，重組BCG，減毒的結(jié)核分枝桿菌(MTB)活疫苗。亞單位疫苗又包括蛋白疫苗，DNA疫苗和以病毒為載體的疫苗；其中的蛋白疫苗具有成分明確，使用安全等優(yōu)點(diǎn)，相對(duì)易于被人們接受。大量研究表明，與單個(gè)抗原相比，融合抗原的免疫原性會(huì)增強(qiáng)，顯示出更好的保護(hù)效果；因此受到國(guó)內(nèi)外研究的重視。然而在以往的研究中，為了后期簡(jiǎn)便的純化方法，往往構(gòu)建成帶有各種標(biāo)簽(如His · Tag, GST · Tag, S · Tag等)形式的融合蛋白，卻未考慮這種融合蛋白所帶有的標(biāo)簽是否會(huì)影響到動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及更進(jìn)一步的臨床學(xué)試驗(yàn)的認(rèn)可。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，針對(duì)上述為了后期簡(jiǎn)便的純化方法，而構(gòu)建帶有各種標(biāo)簽形式的融合蛋白問(wèn)題，本發(fā)明通過(guò)基因重組、表達(dá)方法，提供了一種不帶有標(biāo)簽的結(jié)核分枝桿菌融合蛋白TB10. 4-Ag85B，為預(yù)防和控制結(jié)核病提供有效的亞單位疫苗?？乖璗B10. 4是早期分泌蛋白ESAT-6家族中的一員(ESAT-6，CFP-10, TB10. 4， TB10. 3，etc)，但是與ESAT-6相比，TB10. 4能在BCG接種人群中引起較強(qiáng)的免疫應(yīng)答，尤其是結(jié)核感染者中反應(yīng)更強(qiáng)。另外，Ag85復(fù)合物(Ag85A、Ag85B 和 Ag85C)是牛分枝桿菌(M. bovis)、BCG 及 MTB培養(yǎng)濾液中的主要分泌性蛋白，該復(fù)合物屬于分枝菌酸轉(zhuǎn)移酶，在結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁合成的晚期起關(guān)鍵作用。其中，Ag85B導(dǎo)致的細(xì)胞免疫反應(yīng)最強(qiáng)，可誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生特異性Thl型細(xì)胞免疫應(yīng)答，能引起較強(qiáng)的免疫的保護(hù)作用，是抗結(jié)核免疫中的主要保護(hù)性抗原，表明Ag85B是機(jī)體重要的保護(hù)性靶抗原。本發(fā)明的技術(shù)方案為
一種無(wú)標(biāo)簽結(jié)核融合蛋白TB10-Ag85B，其由以下步驟制備而成
(1)將結(jié)核分枝桿菌的基因TB10.4和Ag85B進(jìn)行重組融合，構(gòu)建重組質(zhì)粒；
(2)將上述步驟(1)中制備的質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化，挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，獲得重組基因的表達(dá)物；
(3)對(duì)上述步驟(2)中的重組基因表達(dá)物進(jìn)行純化。所述的步驟(1)的重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法為根據(jù)GenBank中H37Rv中的TB10. 4和 Ag85B的基因序列，應(yīng)用分子克隆技術(shù)設(shè)計(jì)含有不同酶切位點(diǎn)的TB10. 4引物和Ag85B引物， 以H37RV-DNA為模板PCR擴(kuò)增出相應(yīng)大小的基因片段，通過(guò)雙酶切和T4連接酶的作用將擴(kuò)增的基因片段連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌克隆載體。所述的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌克隆載體后，挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR驗(yàn)證并測(cè)序，測(cè)序結(jié)果見(jiàn)SEQ ID NO :1，測(cè)序正確的重組質(zhì)粒再次轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達(dá)載體。PCR擴(kuò)增獲得的TB10. 4和Ag85B序列與GenBank中完全一致，二者融合后在大腸桿菌中表達(dá)產(chǎn)物大小約42KD，與預(yù)計(jì)大小相吻合。所述的步驟(2)的誘導(dǎo)表達(dá)方法為將步驟(1)中獲得的含有重組質(zhì)粒的表達(dá)載體接入含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，35 40°C振蕩培養(yǎng)10 14小時(shí)；再將Iml的該菌液移入IOOml的LB液體培養(yǎng)基中，35 40°C振蕩培養(yǎng)2 4小時(shí)，至吸光度A600值為 0. 6 0. 8，誘導(dǎo)振蕩培養(yǎng)6 他后，離心，收集菌體。所述的步驟(3)融合基因以包涵體的形式表達(dá)，首先將其包涵體溶于8M尿素，然后在4°C進(jìn)行梯度透析復(fù)性再采用離子交換層析和疏水層析的兩種色譜分析方法進(jìn)行最終的蛋白純化。一種無(wú)標(biāo)簽結(jié)核融合蛋白TB10. 4_Ag85B，其特征在于作為用于制備結(jié)核病疫苗的抗原。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于利用基因工程技術(shù)，克隆構(gòu)建了不帶有任何標(biāo)簽的結(jié)核分枝桿菌融合蛋白TB10. 4-Ag85B，解決了融合蛋白所帶有的標(biāo)簽會(huì)影響到動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及更進(jìn)一步的臨床學(xué)試驗(yàn)的后續(xù)問(wèn)題，并且通過(guò)利用不同的色譜分析方法使融合蛋白得到了有效的純化，有望成為結(jié)核病預(yù)防的候選疫苗。


圖1結(jié)核分枝桿菌基因TB10. 4與Ag85B體外擴(kuò)增圖譜； 圖2重組質(zhì)粒pET30a-TB10. 4的鑒定圖譜；
圖3重組質(zhì)粒pET30a-TB10. 4與基因Ag85B的連接圖譜； 圖4融合基因TB10.4-Ag85B的表達(dá)結(jié)果圖譜；
圖5無(wú)標(biāo)簽結(jié)核分枝桿菌融合蛋白TB10. 4-Ag85B第一步純化即離子交換層析圖； 圖6無(wú)標(biāo)簽結(jié)核分枝桿菌融合蛋白TB10. 4-Ag85B第二步純化即疏水層析圖； 圖7無(wú)標(biāo)簽結(jié)核分枝桿菌融合蛋白TB10. 4-Ag85B的純化結(jié)果圖譜； 圖3中1雙酶切以及純化的基因Ag85B、2雙酶切以及純化的質(zhì)粒pET30a-TB10. 4、3未酶切的質(zhì)粒 pET30a-TB10. 4、M Marker ；
圖 4 中1 Marker,2 BL21 空菌上清、3 BL21 空菌沉淀、4 TB10. 4_Ag85B 上清、5 TB10. 4-Ag85B 沉淀；
圖 7 中1 Marker,2 純化前的 TB10. 4_Ag85B、3 第一步純化后的 TB10. 4_Ag85B、4 第二步純化后的TB10. 4-Ag85B ；
SEQ ID NO: 1 融合基因TB10. 4_Ag85B的DNA測(cè)序結(jié)果(注GAATTC為EcoR I的酶
4切位點(diǎn))。
具體實(shí)施例方式以下對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行說(shuō)明，應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的優(yōu)選實(shí)施例僅用于說(shuō)明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。實(shí)施例一
重組質(zhì)粒pET30a-TB10. 4_Ag85B的克隆構(gòu)建
1、主要材料結(jié)核分枝桿菌株H37Rv來(lái)自甘肅省疾病控制中心；質(zhì)粒pET30a、Ε. coli DH5a與BL21(DE3)由復(fù)旦大學(xué)王洪海教授惠贈(zèng)；引物由上海生物生工工程有限公司合成； 基因測(cè)序由北京華大基因科技完成；PCR試劑盒、產(chǎn)物純化試劑盒、膠回收試劑盒購(gòu)自大連寶生物有限公司；基因組提取試劑盒、DNA Marker III購(gòu)自蘭州市鵬程生物有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶I ,Η η lll,Nde I購(gòu)自上海生物生工工程有限公司。2、主要儀器高壓蒸汽滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠)；電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司);超低溫冰箱-80°C (USA 813283-1048)；艾科浦超純水機(jī)AFZ0502U (重慶頤洋科技有限公司)；超凈工作臺(tái)(蘇州凈化)；東盛龍PCR儀；DYY12電泳儀及水平電泳槽(北京六一儀器廠)；IF258全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)(上海嘉鵬科技有限公司)；電子天平BT124S ；電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；Beckman低溫高速離心機(jī) (USA) ； JB3型定時(shí)恒溫磁力攪拌器(上海雷磁新徑儀器有限公司)；PH儀(PB-16) ；DK80電熱恒溫水槽(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)
3、重組質(zhì)粒pET30a-TB10. 4_Ag85B的克隆構(gòu)建方法
(1)根據(jù)GenBank中H37Rv中的TB10. 4和Ag85B的基因序列，設(shè)計(jì)4對(duì)引物，分別為 TB10. 4上游引物(10. 4s)含酶切位點(diǎn)Mfe I及起始密碼子；TB10. 4下游引物(10. 4a)含酶切位點(diǎn)I ；Ag85B上游引物(85Bs)含酶切位點(diǎn)I ；Ag85B下游引物(85Ba)含酶切位點(diǎn)HinA III及終止密碼子。以H37Rv的DNA為模板，PCR擴(kuò)增的TB10. 4基因和 858bp的Ag85B基因(見(jiàn)圖1)。TB10. 4基因的PCR條件為98°C變性10 s, 55°C退火15 s, 72°C 聚合30 s,共30個(gè)循環(huán)。Ag85B基因的PCR條件為98°C變性10 s，62°C退火15 s’72V聚合30 s,共30個(gè)循環(huán)。i2)Nde I ,EcoR I雙酶切并純化后的TB10. 4基因和質(zhì)粒pET30a，在T4連接酶的作用下將兩者進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化入E. coli DH5a中。PCR驗(yàn)證篩選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序鑒定(北京華大基因科技完成測(cè)序)(見(jiàn)圖2)。即保存菌種為pET30a-TB10. 4 (DH5a)。(3)提取以上鑒定正確的重組質(zhì)粒pET30a_TB10. 4?！阠oR I和歷idIII雙酶切Ag85B 基因和重組質(zhì)粒pET30a-TB10. 4，分別純化后用T4連接酶進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化入E. coli DH5 α (見(jiàn)圖3)。PCR驗(yàn)證篩選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序鑒定(北京華大基因科技完成測(cè)序)。即保存菌種為 pET30a-TB10. 4_Ag85B (DH5 α )。實(shí)施例二
融合基因ΤΒ10. 4-Ag85B的誘導(dǎo)表達(dá)
1、主要材料低分子量蛋白Marker購(gòu)自大連寶生物有限公司；卡那霉素、LB培養(yǎng)基成分(胰蛋白胨、氯化鈉、酵母提取物)及蛋白電泳相關(guān)試劑(丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、Tris、過(guò)硫酸銨、甘氨酸、SDS、TEMED、β巰基乙醇、G250等)、磷酸氫二鈉與磷酸二氫鈉等試劑均購(gòu)自蘭州市鵬程生物有限公司；IPTG購(gòu)自上海生物生工工程有限公司。2、主要儀器高壓蒸汽滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠)；電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司);超低溫冰箱-80°C (USA 813283-1048)；艾科浦超純水機(jī)AFZ0502U (重慶頤洋科技有限公司)；超凈工作臺(tái)(蘇州凈化);DYY12電泳儀及垂直電泳槽(北京六一儀器廠);IF258全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)(上海嘉鵬科技有限公司);電子天平BT124S;電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；Beckman低溫高速離心機(jī)(USA) ； JB3型定時(shí)恒溫磁力攪拌器(上海雷磁新徑儀器有限公司);PH儀(PB-16)；脫色搖床TS-I (海門(mén)市麒麟醫(yī)用儀器廠)；恒溫振蕩器IS-RDVl ；超聲波細(xì)胞破碎儀(寧波新芝)。3、融合基因TB10. 4-Ag85B的誘導(dǎo)表達(dá)方法
(1)從 E. coli pET30a-TB10. 4_Ag85B (DH5 α )提取重組質(zhì)粒 pET30a- TB10. 4_Ag85B， 轉(zhuǎn)化入Ε. coli BL21(DE3)中，PCR驗(yàn)證篩選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序鑒定(北京華大基因科技完成測(cè)序)。即為保存菌種為pET30a- TB10. 4-Ag85B (BL21)。(2)將菌種 pET30a-TB10. 4-Ag85B (BL21) 10μ 1 接入含有 50μ g/ml 卡那霉素的5ml的LB液體培養(yǎng)基中，37 °C振蕩培養(yǎng)約12小時(shí)；再將Iml的該菌液移入IOOml的LB 液體培養(yǎng)基中(含有50 μ g/ml卡那霉素)，37°C振蕩培養(yǎng)約3小時(shí)，至A600值為0. 6 0. 8，加入IPTG至終濃度為0. lmmol/ L，18°C誘導(dǎo)振蕩培養(yǎng)6 他后，將菌液4°C離心， 10，OOOrpmX 20min 收集菌體。(3)將上述菌體按照5ml/g重懸于20mM PB緩沖液中，冰浴條件下超聲破碎細(xì)菌 40min lh左右(200W，超聲2s停2s)至液體澄清，4°C，10，OOOrpm離心20min后，將上清和沉淀分別進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(注將大腸桿菌BL21同等條件下誘導(dǎo)表達(dá)作為陰性對(duì)照！)。(4)經(jīng)SDS-PAGE分析，與BL21空菌相比，分子量在42KD左右有明顯的特異蛋白表達(dá)條帶，并以包涵體形式表達(dá)為主，上清液中蛋白很少(見(jiàn)圖4)。實(shí)施例三
無(wú)標(biāo)簽融合蛋白TB10. 4-Ag85B的純化
1、主要材料低分子量蛋白Marker購(gòu)自大連寶生物有限公司；蛋白電泳相關(guān)試劑(丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、Tris、過(guò)硫酸銨、甘氨酸、SDS、TEMED, β巰基乙醇、G250等)、 尿素、磷酸氫二鈉與磷酸二氫鈉、MW8000-14000透析袋等均購(gòu)自蘭州市鵬程生物有限公司； IPTG購(gòu)自上海生物生工工程有限公司。2、主要儀器純化儀(ΑΚΤΑ purifierTM UPC100 Sweden) ；DYY12 電泳儀及垂直電泳槽(北京六一儀器廠)；脫色搖床TS-I (海門(mén)市麒麟醫(yī)用儀器廠)；IF258全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)(上海嘉鵬科技有限公司)；PH儀(PB-16)；濾器及0. 45 μ m濾膜；酶標(biāo)儀；離子交換柱(DEAE)；疏水層析柱(Butyl FF)03、配制緩沖液I 液 20mM PB (ρΗ7· 4)； II 液 20mM PB+1M NaCl (ρΗ7· 4);ΙΙΙ液 20mM ΡΒ+2 M NaCl (ρΗ7· 4)。4、按上述表達(dá)步驟進(jìn)行大量表達(dá)融合蛋白ΤΒ10. 4-Ag85B,收集的菌體重懸于20mM PB緩沖液中，冰浴下超聲破碎40min Ih左右，4°C，10，OOOrpm離心20min離心后收集沉淀， 溶解于8M尿素中。
5、預(yù)先處理透析袋(MW8000-14000)，配制含5mM Tris-Cl, pH8. 0的尿素梯度復(fù)性液(6M尿素，4M尿素，2M尿素，IM尿素，0. 5M尿素，0 M尿素)各5000ml，4°C下將蛋白 TB10. 4-Ag85B依次用每個(gè)梯度透析1 來(lái)復(fù)性。6、收集復(fù)性后的蛋白，用0.45μπι濾器過(guò)濾；酶標(biāo)儀測(cè)定蛋白濃度(mg/ml )，根據(jù)所選層析柱的載量，計(jì)算確定蛋白的上樣量。7、第一步純化離子交換層析。選用弱陰離子交換柱DEAE進(jìn)行純化，收集不同梯度洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE分析得初步純化物。具體步驟如下⑴用5-10個(gè)柱體積的起始緩沖液A液即I液平衡分離柱，或直到基線，pH及電導(dǎo)穩(wěn)定后。⑵將樣品調(diào)整至I液的起始 PH和離子強(qiáng)度，并加載至分離柱。⑶用5-10個(gè)柱體積的A液(I液)沖洗分離柱，或直到基線，PH及電導(dǎo)穩(wěn)定，即所有未結(jié)合物質(zhì)均被沖洗出分離柱。⑷用10-20個(gè)柱體積的梯度進(jìn)行洗脫，離子強(qiáng)度逐漸增加(0%B-100%B，注B液為II液)，直至目的蛋白被洗脫下來(lái)。收集不同的洗脫成分進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分析(見(jiàn)圖5和圖7)。8、第二步純化疏水層析。經(jīng)過(guò)離子交換層析初步純化后的蛋白，加入等體積的III 液，使蛋白含高鹽上柱。選用Butyl FF柱進(jìn)行純化，收集不同梯度洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE 分析得最終純化物。具體步驟如下⑴用5-10個(gè)柱體積的起始緩沖液A液即II液來(lái)平衡柱子，或直到紫外吸光回到基線，電導(dǎo)平衡。⑵調(diào)節(jié)樣品到選擇的A液的鹽濃度和pH。過(guò)濾， 上樣到柱子上。⑶用5-10個(gè)柱體積的A液沖洗或直到紫外吸光回到基線，電導(dǎo)平衡，此時(shí)所有的未結(jié)合的蛋白被從柱子上洗脫掉。W傭10-20個(gè)柱體積開(kāi)始洗脫，增加B液(I液) 的比例，直到鹽濃度達(dá)到最低，就是無(wú)鹽緩沖液(100%的B液)。收集不同的洗脫成分進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分析(見(jiàn)圖6和圖7)。9、最后，將最終得到的蛋白純化產(chǎn)物凍存待用。最后應(yīng)說(shuō)明的是以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明， 盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。 凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種無(wú)標(biāo)簽結(jié)核融合蛋白TB10-Ag85B，其特征在于由以下步驟制備而成(1)將結(jié)核分枝桿菌的基因TB10.4和Ag85B進(jìn)行重組融合，構(gòu)建重組質(zhì)粒；(2)將上述步驟(1)中制備的質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化，挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，獲得重組基因的表達(dá)物；(3)對(duì)上述步驟(2)中的重組基因表達(dá)物進(jìn)行純化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種無(wú)標(biāo)簽結(jié)核融合蛋白TB10-Ag85B，其特征在于所述的步驟(1)的重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法為根據(jù)GenBank中H37Rv中的TB10. 4和Ag85B的基因序列，應(yīng)用分子克隆技術(shù)設(shè)計(jì)含有不同酶切位點(diǎn)的TB10. 4引物和Ag85B引物，以H37Rv_DNA 為模板PCR擴(kuò)增出相應(yīng)大小的基因片段，通過(guò)雙酶切和T4連接酶的作用將擴(kuò)增的基因片段連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌克隆載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種無(wú)標(biāo)簽結(jié)核融合蛋白TB10-Ag85B，其特征在于所述的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌克隆載體后，挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR驗(yàn)證并測(cè)序，測(cè)序正確的重組質(zhì)粒再次轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達(dá)載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種無(wú)標(biāo)簽結(jié)核融合蛋白TB10-Ag85B，其特征在于所述的步驟(2)的誘導(dǎo)表達(dá)方法為將步驟(1)中獲得的含有重組質(zhì)粒的表達(dá)載體接入含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，35 40°C振蕩培養(yǎng)10 14小時(shí)；再將Iml的該菌液移入IOOml的 LB液體培養(yǎng)基中，35 40°C振蕩培養(yǎng)2 4小時(shí)，至吸光度A600值為0. 6 0. 8，誘導(dǎo)振蕩培養(yǎng)6 后，離心，收集菌體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種無(wú)標(biāo)簽結(jié)核融合蛋白TB10-Ag85B，其特征在于所述的步驟(3)采用離子交換層析和疏水層析的兩種色譜分析方法進(jìn)行最終的蛋白純化。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種無(wú)標(biāo)簽結(jié)核融合蛋白TB10.4-Ag85B，其特征在于作為用于制備結(jié)核病疫苗的抗原。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種無(wú)標(biāo)簽結(jié)核融合蛋白TB10-Ag85B，利用基因工程技術(shù)，將結(jié)核分枝桿菌的基因TB10.4和Ag85B進(jìn)行重組融合，構(gòu)建重組質(zhì)粒，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，獲得重組基因的表達(dá)物，最后將重組基因表達(dá)物進(jìn)行純化，克隆構(gòu)建了不帶有任何標(biāo)簽的結(jié)核分枝桿菌融合蛋白TB10.4-Ag85B。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于解決了融合蛋白所帶有的標(biāo)簽會(huì)影響到動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及更進(jìn)一步的臨床學(xué)試驗(yàn)的后續(xù)問(wèn)題，并且通過(guò)利用不同的色譜分析方法使融合蛋白得到了有效的純化，有望成為結(jié)核病預(yù)防的候選疫苗。
文檔編號(hào)C12R1/19GK102174112SQ20111002808
公開(kāi)日2011年9月7日 申請(qǐng)日期2011年1月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月26日
發(fā)明者萬(wàn)艷, 張穎, 王秉翔, 祝秉東, 章國(guó)平, 胡麗娜, 辛奇, 達(dá)澤蛟 申請(qǐng)人:蘭州大學(xué)