專利名稱：一株產低溫β-半乳糖苷酶的海洋鹽單胞菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及海洋微生物技術領域，具體涉及一株海洋鹽單胞菌菌株Ρ6009-1，及其利用該海洋鹽單胞菌生產低溫β -半乳糖苷酶的方法，及其在制備低乳糖牛奶中的應用。
背景技術：
β -半乳糖苷酶(Ε. C. 3. 2. 1. 23)全稱是β -D-半乳糖苷半乳糖水解酶，它廣泛分布在動植物以及微生物中，動物體內的半乳糖苷酶主要存在于小腸表面，其作用是將乳糖分解為葡萄糖和半乳糖，以供生物體利用。同時它還可以通過轉糖基作用將半乳糖轉移至乳糖上，生成低聚糖。乳糖是由D-半乳糖和D-葡萄糖通過β -1，4糖苷鍵連接形成的二糖，它主要存在于哺乳動物的乳汁中，在人乳中約含7%，牛乳中約含5%。牛乳是一種重要的營養(yǎng)品，但某些人群在喝牛奶時會產生腹鳴、腹瀉、嘔吐等癥狀，其主要原因是由于人體內半乳糖苷酶的含量或活性隨年齡、人種及腸道疾病的影響而降低，導致牛乳中的乳糖不能很好地被分解而產生的一種不適，稱為乳糖不耐癥或乳糖消化不良。乳糖不耐癥的主要原因是乳糖不耐癥嚴重影響了牛奶中營養(yǎng)物質的吸收。目前為解決乳糖不耐癥患者的牛奶飲用問題， 多采用在牛奶中添加外源性β -半乳糖苷酶的方法生產低乳糖牛奶，使牛奶中的乳糖在進入人體之前就被降解，避免了乳糖吸收的問題。食品工業(yè)最主要的β -半乳糖苷酶的來源是從微生物中提取純化的β -半乳糖苷酶。但是，由于牛奶的運輸、保藏多數(shù)是在低溫下進行的，因此能在低溫下分解乳糖，是工業(yè)應用半乳糖苷酶所必須具備的條件之一。鑒于此原因，目前報道的最適作用溫度低于50°C的半乳糖苷酶不多，而能在低溫(0 20°C)下保持高活性的半乳糖苷酶就更少。比較優(yōu)良的有來自于ArthrcAacterpsychrolactophilus F2的β -半乳糖苷酶，在O 20°C時可保持活性75%以上，以及來自于ArthrcAacter sp. SB中的β -半乳糖苷酶，在O 20°C時可保持活性50%以上。而目前能應用于食品工業(yè)的符合美國FDA 的GRAS級(generally regard assafe)的只有荷蘭帝斯曼集團改造的乳酸克魯維酵母菌 (Kluyveromyces lactis)中提取的β _半乳糖苷酶，該酶最適溫度在40°C左右，但它在低溫下活性很低，因此，目前沒有真正意義上的低溫半乳糖苷酶應用于食品工業(yè)中，急需發(fā)現(xiàn)新型低溫半乳糖苷酶。海洋是一個十分獨特的生態(tài)環(huán)境，復雜的生態(tài)環(huán)境，不僅使海洋微生物產生了特殊的生物活性物質，也使海洋生物代謝過程中的酶類在性質、功能上與陸地生物有很多不同，比如作用溫度，海洋微生物酶類普遍具有低溫酶的相關性質。因此，從海洋微生物中尋找低溫下具有高活性的β-半乳糖苷酶是一種很好的選擇。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于從海洋微生物中尋找到一株能夠高產低溫β -半乳糖苷酶的海洋鹽單胞菌，并利用它生產低溫半乳糖苷酶。
本發(fā)明提供了一株海洋鹽單胞菌菌株P6009-1。本發(fā)明的海洋鹽單胞菌(Halomomas sp.)菌株P6006-1，是從東海海域的海水中培養(yǎng)分離得到的，是一株鹽單胞菌屬未知種菌株，該假單胞菌屬未知種菌株P6009-1，已于2011年1月5日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC)，保藏號為CCTCC No: M2011001。本發(fā)明提供的海洋鹽單胞菌菌株P6009-1 (簡稱菌株P6009-1)形態(tài)特征如下菌落顏色呈黃色，菌落形態(tài)為圓形，邊緣整齊，表面光滑濕潤，突起于瓊脂表面。對菌株進行革蘭氏染色，為革蘭氏陰性桿菌。經DNA序列測定，菌株P6009-1的16S rDNA序列全長為1447bp。將該16S rDNA序列遞交GenBank進行Blast同源系列比對，結果發(fā)現(xiàn)，P6009-1與Halomonas sp. MZ0306A1 (EU124745. 1)相似度最高，為 99%。菌株P6009-1 的 16S rDNA 全序列如 SEQ ID NO 1 所示。本發(fā)明還提供了利用該海洋鹽單胞菌生產低溫β -半乳糖苷酶的方法。該方法是將上述海洋鹽單胞菌在含乳糖的培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，培養(yǎng)溫度為25-37°C，培養(yǎng)3-7天，pH 值為 7. 2-7.8。較優(yōu)的方法是，將上述海洋鹽單胞菌接種于化1^11 2216E液體培養(yǎng)基(蛋白胨 5g，酵母膏Ig,磷酸鐵0. lg, NaCl 60g, 1000ml蒸餾水，pH7. 6) ,28°C,培養(yǎng)2天；然后轉入發(fā)酵液體培養(yǎng)基(乳糖20g，蛋白胨5g，酵母膏l(xiāng)g，磷酸鐵0. Ig)中培養(yǎng)，28°C，培養(yǎng)3天。本發(fā)明還提供了利用該海洋鹽單胞菌生產出的低溫半乳糖苷酶在制備低乳糖牛奶中的應用。采用乳糖誘導培養(yǎng)菌株Ρ6009-1，細胞裂解液與乳糖在30°C左右水浴反應lOmin， 即可將乳糖分解生成葡萄糖和半乳糖。本發(fā)明菌株P6009-1具有能分解乳糖的能力，可以用來分解牛乳中的乳糖。利用該海洋鹽單胞菌生產出的低溫半乳糖苷酶，最適反應溫度為30°C，以30°C時ONP的吸光度值為100%，算得該粗酶在4°C時的酶活力可保持在 15% 20%之間，8°C時的酶活力為最適溫度下的35%。
具體實施例方式下面結合實施例對本發(fā)明進行詳細描述。但下列實施例不應看作對本發(fā)明范圍的限制。實施例1 菌株P6009-1的培養(yǎng)菌株P6009-1的培養(yǎng)基為蛋白胨5g，酵母膏l(xiāng)g，磷酸鐵0. lg，人工海水(或陳海水)1000ml, pH 7. 6。人工海水配方=NaCl 25. 0g, Na2SO4 4. 0g, KCl 0. 7g, NaHCO3 0. 20g, KBr 0. 10g, H3BO3 0. 03g, NaF 0.003g，53mL 1. 0mol/LMgCl2 溶液，IOmL 1. Omol/1 CaCl2 溶液，0.90ml 0. lmol/L SrCl2溶液，蒸餾水1000ml，pH調為6. 5。按常規(guī)將菌株P6009-1接種于培養(yǎng)基，在下培養(yǎng)。實施例2 菌株P6009-1的粗酶液制取采用乳糖誘導培養(yǎng)，將P6009-1菌株接種于hbell 2216E液體培養(yǎng)基(蛋白胨 5g，酵母膏 lg，磷酸鐵 0. lg，NaCl 60g，1000ml 蒸餾水，pH7. 6)，，130r/min 搖床培養(yǎng) 2天，活化菌株，然后轉入發(fā)酵液體培養(yǎng)基(乳糖20g，蛋白胨5g，酵母膏l(xiāng)g，磷酸鐵0. Ig)中培養(yǎng)，28°C,130r/min搖床培養(yǎng)3天，發(fā)酵液離心，5000r/minX 15minX4°C，棄上清。用 0. 05mol/L pH7. 2的磷酸緩沖液將沉淀重懸，轉移至離心管中，并用磷酸緩沖液洗滌菌體兩次，并離心，5000r/minX15minX4°C，棄上清。將菌體重懸于0. 05mol/L pH7. 2的磷酸緩沖液中。冰浴條件下用超聲波粉碎機破碎細胞每次超聲ls，間隔Is再超聲，共5min。破菌后的菌液離心12000r/minX40minX4°C，取上清即為粗酶液。實施例3 金屬離子對粗酶活性的影響取粗酶液10 μ L，加入87 μ L 20g/L的乳糖，再分別加入3 μ L的0. 2M的MnCl2, FeCl2, FeCl3、MgCl2, ZnCl2, LiCl,CoCl2, BaCl2, SrCl2, CuCl2, NaCl、CaCl2 溶液，放置在不同溫度下孵育，通過薄層層析方法檢測乳糖是否被分解生成半乳糖和葡萄糖，具體操作為取 5μ L反應液用毛細管點樣于硅膠薄層板上，以正丁醇吡啶水(5 4 1)為展開劑進行展開，待溶劑前沿達到離薄層板上沿約Icm時，取出薄層板，揮干溶劑后噴上20%硫酸-甲醇溶液，115°C烘烤顯色。以0. 2%乳糖，0. 2%半乳糖，0. 2%葡萄糖為標準對照品，觀察反應液中是否出現(xiàn)于標準品&值相同的斑點。結果發(fā)現(xiàn)，加入aiCl2、CuCl2, NaCl溶液的反應管中葡萄糖、半乳糖斑點亮度明顯減弱甚至消失，而加入其他上述離子的反應管中的葡萄糖和半乳糖的生成亮無明顯變化， 因此，Zn2+、Cu2+、Na+對該菌株產低溫β -半乳糖苷酶的活性具有較顯著抑制作用，而Mn2+、 Fe2\ Fe3\ Mg2+、Li+、Co2+、Ba2+、Sr2+、Ca2+ 對該酶的活性無抑制作用。實施例4 粗酶分解乳糖的定性實驗取粗酶液20yL，加入 IOyL 2g/L 的乳糖，分別于 4°C，8°C，15°C，30°C，40°C， 60°C反應30min，加熱煮沸IOmin以終止反應。各取反應液5 μ 1用毛細管點于硅膠G薄層板上，以0. 2%乳糖，0. 2%半乳糖，0. 2%葡萄糖標準品為陽性對照，以正丁醇吡啶水 (5:4: 1)為展開劑，進行展開，以20%硫酸甲醇為顯色劑，發(fā)現(xiàn)在41，81，151，301， 40°C溫度下反應，均能出現(xiàn)葡萄糖、半乳糖陽性斑點，與對照品的Rf值相同；而60°C反應， 無陽性斑點產生。實施例5 粗酶在低溫下的活力取粗酶液10 μ L，加入IOyL 40mM的ONPG溶液，補充體積至100 μ L，分別在4°C， 8°C，15°C，300C，40°C，60°C下反應一定時間，用IM的Na2CO3溶液終止反應，在OD4tl5nm處測量吸光度值，發(fā)現(xiàn)該酶的最適反應溫度為30°C，以30°C時ONP的吸光度值為100%，算得該粗酶在4°C時的酶活力可保持在15% 20%之間，8°C時的酶活力為最適溫度下的35%。
權利要求
1.海洋鹽單胞菌，保藏號為CCTCCNo :M2011001。
2.一種利用如權利要求1所述的海洋鹽單胞菌生產低溫半乳糖苷酶的方法，其特征在于該方法是將海洋鹽單胞菌在含乳糖的培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，培養(yǎng)溫度為25-37°C，培養(yǎng) 3-7 天，ρΗ7· 2-7. 8。
3.根據(jù)權利要求2所述的生產低溫半乳糖苷酶的方法，其特征在于該方法是將海洋鹽單胞菌接種于hbell 2216E液體培養(yǎng)基蛋白胨5g、酵母膏l(xiāng)g、磷酸鐵0. lg、NaCl 60g和1000ml蒸餾水，pH7. 6J8°C，培養(yǎng)2天；然后轉入發(fā)酵液體培養(yǎng)基乳糖20g、蛋白胨 5g、酵母膏Ig和磷酸鐵0. Ig, 280C，培養(yǎng)3天。
4.一種如權利要求1所述的海洋鹽單胞菌在制備低乳糖牛奶中的應用。
5.一種利用如權利要求1所述的海洋鹽單胞菌生產低溫半乳糖苷酶的方法在制備低乳糖牛奶中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及海洋微生物技術領域。由于牛奶的運輸、保藏多數(shù)是在低溫下進行的，因此能在低溫下分解乳糖，是工業(yè)應用β-半乳糖苷酶所必須具備的條件之一。本發(fā)明的海洋鹽單胞菌菌株P6006-1，是從東海海域的海水中培養(yǎng)分離得到的，已于2011年1月7日保藏于中國武漢典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC)，保藏號為CCTCC No.M2011001。本發(fā)明還提供了利用該海洋鹽單胞菌生產低溫β-半乳糖苷酶的方法。利用該海洋鹽單胞菌生產出的低溫β-半乳糖苷酶可以用來分解牛乳中的乳糖，最適反應溫度為30℃。
文檔編號C12R1/01GK102174439SQ201110029078
公開日2011年9月7日 申請日期2011年1月27日 優(yōu)先權日2011年1月27日
發(fā)明者劉軍華, 劉小宇, 盧小玲, 焦炳華, 王國祥, 胡波, 高云 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學