專利名稱：一種唐氏綜合征sybr熒光篩查試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種產(chǎn)前診斷的試劑盒及其專用擴增引物，特別是涉及一種唐氏綜合 征STOR熒光篩查試劑盒及其專用擴增引物。
背景技術(shù)：
唐氏綜合征(又稱Down綜合征或DS)是新生兒中最常見的一種染色體病， 出生后將表現(xiàn)為智力低下，部分胎兒伴有畸形。新生兒的唐氏綜合癥的發(fā)生率約為 1/1000-2/1000。按目前的出生率，我國平均每20分鐘就有一例唐氏患兒出生，全國每年出 生的唐氏患兒可多達27000例左右。DS患者尚無有效的治療方法，這些患者的存在給社會 及家庭帶來沉重的精神和經(jīng)濟負擔(dān)。產(chǎn)前診斷并及時淘汰該類胎兒是實現(xiàn)優(yōu)生優(yōu)育的主要 手段之一。目前，產(chǎn)前診斷DS的主要方法仍然是已用百年的細胞核型分析方法，即羊水、絨 毛或臍血的染色體核型分析。細胞核型分析方法是診斷染色體病的金標準，但該方法程序 繁瑣，檢驗周期長，從取材到報告發(fā)出至少需要2-3周的時間，等待報告過程中孕婦的焦慮 情緒不但會給家庭造成心理負擔(dān)而且會對胎兒產(chǎn)生不良影響。短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeat, STR)是指基因組DNA中存在一類重復(fù)單 位長度為2bp-6bp的重復(fù)序列，是人類的DNA指紋。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種唐氏綜合征STOR熒光篩查試劑盒。本發(fā)明提供了一種輔助鑒定唐氏綜合征患者的專用引物，由序列表的序列1所示 DNA和序列表的序列2所示DNA組成。所述專用引物可用于制備輔助鑒定唐氏綜合征患者的試劑盒。本發(fā)明還保護一種輔助鑒定唐氏綜合征患者的試劑盒，包括所述專用引物。所述試劑盒還可包括STOR熒光染料。所述試劑盒還可包括SYBR Premix Ex Taq TM II 禾口 ROX Reference Dye II。所述試劑盒還可包括其它PCR常規(guī)試劑和提取的基因組DNA常規(guī)試劑。本發(fā)明提供的試劑盒應(yīng)用STR的熒光定量PCR技術(shù)快速診斷唐氏綜合征，具有 如下優(yōu)點采用量化標準，結(jié)果容易判斷，準確度高；采用STOR反應(yīng)染料，省略了熒光定量 PCR技術(shù)中探針的應(yīng)用，可以避免因復(fù)序列造成的假陽性結(jié)果；實驗中引入Dissociation Mage，可以有效控制非特異擴增的出現(xiàn)；從取材到報告發(fā)出只需要48小時，可以有效減輕 孕婦和家人等待染色體報告過程中的焦慮和痛苦；所需檢材少，只需要5ml羊水或者0. 2ml 臍血或者少量絨毛就可以進行檢測，減少了取材對胎兒的影響。本發(fā)明基于對包括有短串 聯(lián)重復(fù)序列的基因區(qū)域相對定量分析，以確定是否存在引起DS的異常染色體，從而早期診 斷DS，具有潛在的臨床應(yīng)用價值。


圖1為樣本D12的D19s222參照位點的反應(yīng)曲線。圖2為樣本D12的D19s222參照位點的溶解曲線。圖3為樣本D12的D21sl259檢測位點的反應(yīng)曲線。圖4為樣本D12的D21sl259檢測位點的溶解曲線。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平 均值。實施例1、檢測DS的STR專用位點引物的設(shè)計根據(jù)對國際STR數(shù)據(jù)庫基因序列分析，以D21sl259為檢測位點，D19s222為參照 位點，根據(jù)STOR熒光PCR引物設(shè)計原則，經(jīng)NCBI-Blast分析與其他人類基因組無100%同 源性序列，理論排除非特異反應(yīng)的可能性設(shè)計引物。D21sl259檢測位點專用引物由正向引物D21sl259-F和反向引物D21sl259-R組 成。D19s222參照位點專用引物由正向引物D19s222-F和反向引物D19s222-R組成。D21sl259-F(序列表的序列 1) :5，-TGTTGGTCATAAGCAAAGGTTAAAAT-3，；D21sl259-R(序列表的序列 2、:5，-GGCGCCGTGTGTAAGAGTGT-3，。D19s222-F:5， -TTTCCTGAAGATTATTTTGGCCTT-3，；D19s222-R :5，-CTCATTCTCAAACAAAAAAGTCAAGG-3，。實施例2、應(yīng)用設(shè)計的引物輔助鑒定DS一、質(zhì)控品的制備標準品包括陰性質(zhì)控品和陽性質(zhì)控品。陰性質(zhì)控品取經(jīng)典染色體檢測方法(細胞核型分析方法)確診為非DS患者的羊 水，提取基因組DNA，作為陰性質(zhì)控品(分裝，在-20°C保存)。陽性質(zhì)控品取經(jīng)典染色體檢測方法(細胞核型分析方法)確診為DS患者的羊 水，提取基因組DNA，作為陽性質(zhì)控品(分裝，在-20°C保存)。陰性質(zhì)控品和陽性質(zhì)控品也可以采用體外DNA擴增技術(shù)大量制備。二、應(yīng)用設(shè)計的引物輔助鑒定DS144個樣本分別為參照標準操作規(guī)程采集自144個個志愿者的羊水(每個志愿者 采集20-25ml)，其中130個為采自經(jīng)典染色體檢測方法(細胞核型分析方法)確診為非DS 患者的羊水，14個為采自經(jīng)典染色體檢測方法(細胞核型分析方法)確診為DS患者的羊 水。每個樣本分別進行如下檢測1、羊水基因組DNA提取采用深圳益生堂生物企業(yè)有限公司生產(chǎn)的基因組DNA快速提取試劑盒進行羊水 DNA的提取。(1)取IOml羊水至15ml離心管，4500rpm離心5分鐘(可見細胞沉淀)，棄上清；
4加入ImlDEPC處理水，8000rpm離心10分鐘(可見細胞沉淀)，棄上清；(2)加入300ul裂解液，劇烈震蕩至細胞團塊完全溶解，65°C放置IOmin (期間混勻 2次)，12000rpm離心3分鐘，棄上清；(3)加入400ul洗滌液A，用漩渦震蕩器充分懸浮沉淀，12000rpm離心3分鐘，棄上 清；(4)加入600ul洗滌液B，用漩渦震蕩器充分懸浮沉淀，12000rpm離心3分鐘，棄上 清；(5)加入600ul無水乙醇，用漩渦震蕩器充分懸浮沉淀，12000rpm離心3分鐘，棄 上清，用加樣器盡可能吸去多余的液體，65°C烤箱開蓋放置至沉淀變白(約需10分鐘)；(6)加入200ul TE緩沖液，震蕩懸浮沉淀，將樣品管65°C放置10分鐘(期間混勻 2次)，12000rpm離心3分鐘，上清液即可作為PCR擴增的模板。2、熒光定量檢測(1)反應(yīng)液的制備反應(yīng)液甲(檢測位點反應(yīng)液)的制備總體積為15μ1，每份反應(yīng)液中含 下列組分SYBR Premix Ex Taq TM ΙΙ(2Χ)10.0μ 1, D21sl259-F (10 μ Μ) 0. 8 μ 1, D21sl259-R(10yM)0. 8μ 1, ROX Reference Dye II (50X) 0· 4 μ 1，dH20(滅菌蒸餾 水)3. 0 μ 1。反應(yīng)液乙(參照位點反應(yīng)液)的制備總體積為15μ1，每份反應(yīng)液中含 下列組分SYBR Premix Ex Taq ΤΜ Κ2Χ)10·0μ 1，D19s222-F(5yM)0.4y 1， D19s222-R(5yM)0. 4μ 1,R0X Reference Dye II (50X) 0. 4 μ 1，dH20(滅菌蒸溜水)3. 8 μ 1。(2)熒光定量PCR使用ΑΒΙ7500熒光定量PCR儀操作，具體操作過程如下①加樣在反應(yīng)液甲和反應(yīng)液乙中各加入5 μ 1步驟1制備的模板(將等量陰性質(zhì)控品作 為陰性對照，將等量陽性質(zhì)控品作為陽性對照，將等量水作為空白對照)，分別加入專用熒 光PCR反應(yīng)8聯(lián)管中，蓋上PCR反應(yīng)蓋(注意蓋反應(yīng)蓋時，手用力方向要垂直，以免損壞管 蓋)8聯(lián)管離心機離心1分鐘，置于儀器反應(yīng)槽中。反應(yīng)條件為95"C 30s (Xl) ；95 V 5s,62 V 32s (X 40) ；95 V 15s,60 V 60s, 95°C 15s (Xl) ；Dissociation Stage ；在反應(yīng)第二階段和 Dissociation Stage 階段收集焚 光信號。②質(zhì)量控制水空白Δ CT為零；陰性質(zhì)控品Δ Ct值大于0. 6 ；陽性質(zhì)控品Δ CT在-0. 1-0. 3之間。實驗中檢測樣品除空白對照外增長曲線(反應(yīng)曲線)均呈S型曲線，Ct值<37; Dissociation Stage反應(yīng)曲線(溶解曲線)主峰呈單峰，如為雙峰或多峰實驗無效。以上要求需在同一次實驗中同時滿足，否則，本次實驗無效，需重新進行。③結(jié)果分析反應(yīng)結(jié)束后自動保存檢測數(shù)據(jù)文件，自動分析CT值結(jié)果。
記錄import下面儀器自動分析計算出的相應(yīng)標本的檢測位點和參照位點的CT 值，并計算Δ CT ( S卩同一樣本檢測位點和參照位點CT值差，即檢測位點基因的CT值與參照 位點基因的CT值之差)。ACt值小于等于0.3判斷為陽性，Δ Ct值在0.3-0. 6之間要重 復(fù)實驗或用染色體鑒定實驗判斷，Δ Ct值大于0. 6判斷為陰性。利用本技術(shù)檢測結(jié)果如下表(表1)。表1實驗檢測結(jié)果
權(quán)利要求
1.輔助鑒定唐氏綜合征患者的專用引物，由序列表的序列1所示DNA和序列表的序列 2所示DNA組成。
2.權(quán)利要求1所述專用引物在制備輔助鑒定唐氏綜合征患者的試劑盒中的應(yīng)用。
3.一種輔助鑒定唐氏綜合征患者的試劑盒，包括權(quán)利要求1所述的專用引物。
4.如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括STOR熒光染料。
5.如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括SYBR Premix ExTaq TM II 和 ROX Reference Dye II。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種唐氏綜合征SYBR熒光篩查試劑盒。本發(fā)明提供的試劑盒包括序列表的序列1所示DNA和序列2所示DNA組成的專用引物。本發(fā)明的試劑盒有如下優(yōu)點采用量化標準結(jié)果容易判斷，準確度高；采用SYBR反應(yīng)染料省略了熒光定量PCR技術(shù)中探針的應(yīng)用可避免因復(fù)序列造成的假陽性結(jié)果；引入Dissociation Stage可以有效控制非特異擴增的出現(xiàn)；只需要48小時，可有效減輕孕婦和家人等待染色體報告過程中的焦慮和痛苦；所需檢材少，只需要5ml羊水或者0.2ml臍血或者少量絨毛就可以進行檢測，減少了取材對胎兒的影響。
文檔編號C12N15/11GK102146462SQ201110030240
公開日2011年8月10日 申請日期2011年1月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月27日
發(fā)明者任景慧, 何薇, 劉春芳, 葉健忠, 林琳華, 武學(xué)成, 郭輝 申請人:郭輝