專利名稱：一種金龜子綠僵菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于工業(yè)真菌技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)計一種高產(chǎn)留體發(fā)酵金龜子綠僵菌菌株及其甾體化合物發(fā)酵的應(yīng)用技術(shù)。
背景技術(shù)：
1留體化合物生物發(fā)酵
甾體化合物是一類含有環(huán)戊烷多氫菲核的化合物，由于母核上取代基、雙鍵位置或立體構(gòu)型的不同，形成了一系列具有獨(dú)特生理功能的化合物。與留體化合物有關(guān)的激素類藥物主要為
1.1腎上腺皮質(zhì)激素(Adrenocorticosteroids)簡稱皮質(zhì)激素，包括鹽皮質(zhì)激素 (Mineralocorticoids)和糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoids)兩類。鹽皮質(zhì)激素在體內(nèi)主要影響水鹽代謝，主要藥物為醛固酮(Aldosterone)，臨床上主要應(yīng)用于治療阿狄森氏內(nèi)分泌疾病。糖皮質(zhì)激素，主要影響糖、蛋白質(zhì)、脂肪和水鹽代謝，主要藥物有可的松(Cortisone)、潑尼松(Prednisone)、地塞米松(Dexamethasone)，倍他米松(Betamethasone)等，其主要功效為抗炎、抗過敏、免疫抑制，對風(fēng)濕性、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡等膠原性疾病有明顯的治療作用。1. 2性激素(Sex Hormone)，這類激素包括雌激素Estrogens)、孕激素 (Progestoens)和雄激素(Androgens)。雌激素主要有雌酮(Oestrone)，雌三醇^striol) 等，孕激素如孕酮(Progesterone)，臨床上常用于治療婦科疾病和骨質(zhì)疏松等。雄激素如睪酮(Testosterone)，臨床上主要用于性機(jī)能不全所致的疾病，還可用于治療貧血、消耗性疾病以及促進(jìn)骨折和傷口的愈合等。1.3避孕藥物如乙炔雌二醇，炔諾酮和長效孕酮等。為目前常用的女性用避孕藥物。1. 4蛋白同化激素(Anabolic steroids)主要有17甲基去氫睪丸素(17a_methy ldehydro-testosterone)、苯丙酸i若龍(Nandrolonephylpropionate)等，主要用于蛋白質(zhì)合成不足和分解增加的治療，如營養(yǎng)不良、嚴(yán)重?zé)齻?、惡性腫瘤、手術(shù)后恢復(fù)期過長、慢性消耗性疾病以及長期大劑量使用糖皮質(zhì)激素引起的負(fù)氮平衡等。近年來甾體藥物的應(yīng)用領(lǐng)域不斷擴(kuò)大，如用于治療淋巴白血病、細(xì)菌性腦炎、人體器官移植以及和內(nèi)分泌有關(guān)的老年性疾病。另外抗腫瘤、利尿、麻醉、松肌等新藥也不斷涌現(xiàn)。留體激素還應(yīng)用于促進(jìn)家畜繁殖生長及植物生長。隨著留體藥物應(yīng)用范圍的不斷擴(kuò)大，甾體醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)呈現(xiàn)出很好的發(fā)展態(tài)勢，成為僅次于抗生素的第二大類藥物。據(jù)統(tǒng)計，80 年代初以來，世界留體藥物總產(chǎn)量及銷售額以年14% 15%的速度增長，此增長率不低于抗生素、抗感染藥物、心血管藥物、中樞神經(jīng)藥物和解熱鎮(zhèn)痛藥物。羥化反應(yīng)是留體微生物轉(zhuǎn)化中最重要的反應(yīng)，微生物能在留體的任何位置進(jìn)行羥基化反應(yīng)?；瘜W(xué)方法除了較易在C17引入羥基外，在其他位置都很難引入。自1952年 Peterson等人最早發(fā)現(xiàn)了黑根霉(Rhizopus nigricans)對孕酮的羥化反應(yīng)后，我國黃鳴龍教授等于1958年用黑根霉使16a，17a_環(huán)氧黃體酮氧化引入ll_a羥基，從而研究成功從薯蕷皂素合成可的松的七步法路線，并一直沿用至今。留體的微生物羥化反應(yīng)是利用微生物內(nèi)的羥化酶對留體特定部位引入羥基，由于羥化酶的不穩(wěn)定性，在提取過程中極易失活，因此通常采用微生物菌體細(xì)胞轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化過程通常分兩個階段。第一階段是菌體的培養(yǎng)，第二階段是加入留體底物進(jìn)行轉(zhuǎn)化。由于甾體化合物的疏水性，在底物濃度較高時，產(chǎn)物在發(fā)酵液中呈結(jié)晶析出，屬于擬結(jié)晶發(fā)酵。目前，工業(yè)上用于留體羥化轉(zhuǎn)化反應(yīng)的微生物主要有黑根霉、赭曲霉 (Aspergi 1 lusochraceus)以及黃曲霉(Aspergillus flavus) λΜΜΜ (Metarhiziums^.) 等。由于綠僵菌性狀穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化率和得率較高，近年來在國內(nèi)成為留體微生物發(fā)酵的新型菌種，具有較大的深度開發(fā)應(yīng)用前景。2綠僵菌屬分類地位及利用現(xiàn)狀
綠僵菌屬(Metarhizium Sorokin)是Sorokin于1883年建立的，它隸屬于真胃 If· (Fungi )> 1^MM Π (Ascomycota)> ^ytM ^ (Sordariomycetes)> 1 ^ ^ M ^ (Hypocreomycetidae)> 肉座菌目(Hypocreales)、麥角菌禾斗(Clavisipitetaceae)0 自 Sorokin建立綠僵菌屬以來，先后發(fā)表了 10余個種。目前國際上被廣泛接受的分類觀點(diǎn)是 Tulloch建立的分類系統(tǒng)，他將綠僵菌屬定為2個種，即金龜子綠僵菌和黃綠綠僵菌，金龜子綠僵菌包括小孢變種和大孢變種。迄今為止，以Driver (2000)等人的研究是最為詳盡和完整，基本解決了綠僵菌屬中的分類難題。他們將綠僵菌劃分為3個種金龜子綠僵菌、 黃綠綠僵菌和白色綠僵菌。該真菌能寄生8個目、30個科共約200余種昆蟲，是一種廣譜性蟲生真菌。目前， 綠僵菌多用于生物防治，防治農(nóng)林業(yè)的有害昆蟲。綠僵菌在甾體化合物轉(zhuǎn)化上的應(yīng)用較少， 國外未見報道。綠僵菌在液體深層培養(yǎng)中能以微循環(huán)產(chǎn)孢方式，即不經(jīng)營養(yǎng)生長階段，直接從液生芽孢子上形成液生分生孢子。而這種微循環(huán)產(chǎn)孢現(xiàn)象的發(fā)生與培養(yǎng)液成分和培養(yǎng)條件密切相關(guān)，并與菌株有一定的相關(guān)性。環(huán)境條件對綠僵菌的生長影響較大，通常在15 35°C條件下都能生長，其中以 20 30°C為最適生長溫度。菌絲生長和孢子形成的最適溫度為25°C;在溫度高于40°C和低于7 8°C時，分生孢子不萌發(fā)。菌絲在30°C條件下生長雖快，但不能很好地形成分生孢子。綠僵菌對濕度的要求更嚴(yán)格，生長發(fā)育要求空氣相對濕度在93%以上。孢子的存活受物理和化學(xué)因素的影響。短時間紫外輻射就可使孢子活力迅速下降，在49°C時只能耐受10 分鐘。溫度與濕度對孢子存活的影響是相關(guān)的，在溫度20°C、相對濕度為97%的條件下，存活時間可達(dá)兩年。本發(fā)明目的
提供一種用于甾體發(fā)酵生產(chǎn)的金龜子綠僵菌變種(ife tarhizium anisopliae var. anisopliae)新菌株LJYH201011，所述菌株保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)，保藏時間為2011年1月21日，保藏號為CGMCC No. 4564，具體內(nèi)容是 Metarhizium anisopliae var. anisopliae LJYH201011 ；
提供一種高產(chǎn)留體(薯蕷皂甙)發(fā)酵金龜子綠僵菌新菌株，將沃氏氧化物(Ha-Eposyprogesterone)作為底物，將其轉(zhuǎn)化為霉菌氧化物 (1 Ia-HydroxyEpoxyProgesterone)的應(yīng)用；提供所述高產(chǎn)綠僵菌菌株留體化合物發(fā)酵生產(chǎn)霉菌氧化物的工藝方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的金龜子綠僵菌新菌株生物學(xué)特征
菌株培養(yǎng)性狀在馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA)上菌落初期為白色絨毛狀。27 30°C溫度下在室內(nèi)培養(yǎng)7d，菌落圓形，外圈有時呈輪紋狀，直徑可達(dá)2. 0 3. 6cm。產(chǎn)孢時由里向外產(chǎn)生污綠色至深綠色分生孢子堆，因?yàn)榫渫饩墳榘咨木z，菌落內(nèi)部為污綠色至深綠色分生孢子堆，菌落呈孔雀斑狀。菌株形態(tài)特征菌絲具有分枝分隔，直徑1. 5 2. 4 μ m。分生孢子梗單生或聚集或緊密排列，帚狀分枝或輪生。瓶梗型產(chǎn)孢細(xì)胞，2. 3 3. 0X7. 3 7. 5 μ m，從瓶梗頂端產(chǎn)生向基成熟的分生孢子鏈。分生孢子單細(xì)胞，長橢圓形至卵圓形，兩端鈍圓形，一段稍細(xì)，分生孢子大小為2. 0 3. 0X4. 6 5. 8 μ m。分生孢子有時亦單生于分生孢子梗末端。本發(fā)明所述的金龜子綠僵菌菌株以沃氏氧化物為底物生產(chǎn)霉菌氧化物的方法包括以下步驟
1原種復(fù)活在27 30°C溫度條件下，將保存的原種在PDA培養(yǎng)基試管斜面上培養(yǎng)，直到菌落長滿斜面并出現(xiàn)綠色分生孢子堆；
2制備菌懸液取無菌水和玻璃珠置入三角瓶中，將培養(yǎng)好的菌種移入三角瓶，將三角瓶在搖床上旋轉(zhuǎn)，再取菌懸液稀釋后，涂布在直徑為PDA平板上，在27 30°C溫度條件下培養(yǎng)；
3制備試管斜面在培養(yǎng)的PDA平板上選擇單個菌落接種在PDA試管斜面上，在27 30°C溫度條件下培養(yǎng)；
4制備一級種子液將試管斜面培養(yǎng)的菌種移入已經(jīng)滅菌的搖瓶培養(yǎng)液中，在27 30°C溫度條件下，在搖床上以200 240轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)觀 30h，獲得一級種子液；
5制備二級種子液培養(yǎng)基以及裝量與上一步相同，在搖瓶中放入玻璃珠，將一級種子液按照20襯％移種量移入二級搖瓶培養(yǎng)，在27 30°C溫度條件下，在搖床上以200 240 轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)14 1 后，即得二級種子液；
6投料發(fā)酵按照2wt%的投料量投入沃氏氧化物的底物到二級種子液中搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，在以上相同條件下，培養(yǎng)4 后得到發(fā)酵液；
7結(jié)果檢測將每個搖瓶的發(fā)酵液經(jīng)“煮沸-抽濾-粉碎-加入丙酮蒸發(fā)-回流-再抽濾-濃縮-結(jié)晶”程序后，將結(jié)晶物抽濾得到粗制品和母液，將粗制品烘干稱取粗制品重量， 根據(jù)投料量計算粗制品收率和轉(zhuǎn)化率；
8選取生產(chǎn)菌株在收率100%、轉(zhuǎn)化率70%以上的菌株中選擇收率和轉(zhuǎn)化率高于平均值的菌株，一方面制成沙土管原種在4°C條件下保存于冰箱中作為原種為以后生產(chǎn)和選育優(yōu)良菌株備用，另一方面?zhèn)鞔糜诹趔w發(fā)酵生產(chǎn)；
9傳代培養(yǎng)在27 30°C溫度條件下，將選取的生產(chǎn)菌株接入PDA培養(yǎng)基試管斜面上培養(yǎng)7 9d，直到菌落長滿斜面并產(chǎn)生綠色分生孢子；
10培養(yǎng)生產(chǎn)母種將煮熟的小米盛入三角瓶，然后將傳代培養(yǎng)后的菌種從試管斜面上接入三角瓶搖勻，在27 30°C條件下培養(yǎng)，使得菌種長滿培養(yǎng)基并呈綠色；
11培養(yǎng)一級生產(chǎn)種子液將生產(chǎn)母種接入種子罐中，培養(yǎng)基與搖瓶培養(yǎng)液相同，在27 30°C溫度條件下培養(yǎng)觀 30h，取樣鏡檢確定沒有被污染并且綠僵菌菌絲飽滿，菌絲體濕重達(dá)到3. 6g/40ml標(biāo)準(zhǔn)后即可移入二級發(fā)酵罐中培養(yǎng)；
12底物溶液制備溶解罐中加入水，將沃氏氧化物投入其中，再加入洗衣粉，密閉后升溫至121°C保溫，然后降溫至得到底物溶液備用；
13培養(yǎng)二級生產(chǎn)種子液在發(fā)酵罐中置入培養(yǎng)液，然后將種子罐中的一級生產(chǎn)種子液移入該發(fā)酵罐，在27 ^rc溫度條件下培養(yǎng)培養(yǎng)14 1 后，取樣鏡檢確定沒有被污染并且綠僵菌菌絲飽滿，菌絲體濕重達(dá)到4. 5g/40ml標(biāo)準(zhǔn)后，壓入底物溶液；
14投底物發(fā)酵壓入沃氏氧化物底物溶液，在27 ^TC溫度下發(fā)酵培養(yǎng)48 50h，根據(jù)取樣檢測當(dāng)時的發(fā)酵罐中的轉(zhuǎn)化情況決定發(fā)酵終止時間；
15壓濾在發(fā)酵達(dá)到終止條件后對發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液進(jìn)行壓濾，取濾餅打粉后備用； 16濾餅粉提取將濾餅粉投入提取罐，加入丙酮，升溫至55 65°C后回流，然后壓濾至濃縮罐進(jìn)行濃縮，再打入丙酮循環(huán)回流、提取，直至濾餅提取干凈；
17粗制品濃縮將上步的提取液濃縮至粥狀物，加入NaOH和工藝用水，升溫至95 105 °C并維持1 ；
18粗制品離心將上步溶液置入離心機(jī)離心甩干，用工藝用水洗滌至中性； 19粗制品烘干將上述粗制品放入烘箱，烘烤獲得粗制品；
20精制品將粗制品投入精制罐，加入氯仿和甲苯的混合溶劑，升溫至70 80°C回流， 再升溫至90°C保壓，然后在103 105°C下濃縮，降溫至35 40°C壓濾，再次打入氯仿和甲苯的混合溶劑，升溫至70 80°C回流，然后再升溫至90°C保壓后濃縮，趁熱壓濾，取樣檢測合格后，加入工藝用水蒸餾，去除殘留混合溶劑，趁熱離心甩干、水洗后，放入烘箱烘烤，即獲得霉菌氧化物精制品。本發(fā)明的有益效果是生產(chǎn)的霉菌氧化物具有轉(zhuǎn)化率高(70. 86 78. 74%)、收率高(100 105%)，而且生物學(xué)性狀比較穩(wěn)定等特點(diǎn)。本發(fā)明可以為以薯蕷皂甙為原料的植物甾體激素生產(chǎn)提高產(chǎn)量、降低生產(chǎn)成本提供技術(shù)支持。


圖1為本發(fā)明金龜子綠僵菌菌株以沃氏氧化物為底物生產(chǎn)霉菌氧化物的工藝流程圖。圖2為本發(fā)明綠僵菌留體化合物微生物發(fā)酵生產(chǎn)流程圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例①原種復(fù)活在27 30 溫度條件下，將保存的原種在PDA培養(yǎng)基試管斜面上培養(yǎng)7 9天，待菌落長滿斜面并出現(xiàn)綠色分生孢子堆后準(zhǔn)備制備菌懸液。②制備菌懸液取20ml無菌水加上70 80顆的玻璃珠(直徑2 3mm)置入 250ml三角瓶中，然后將培養(yǎng)好的菌種移入三角瓶中。將三角瓶在搖床上(200 260轉(zhuǎn)/ 分)旋轉(zhuǎn)0.證，取菌懸液稀釋到10_5倍數(shù)后，涂布在直徑為150mmPDA平板上。在27 30 溫度條件下培養(yǎng)7天。
③制備試管斜面在培養(yǎng)的PDA平板上，選擇單個菌落接種在IOml PDA試管 (20X200)斜面上，在27 30 溫度條件下培養(yǎng)7天。④制備一級種子液制備培養(yǎng)液50ml置入250ml搖瓶中，在27 30 溫度條件下，在搖床上(200 260轉(zhuǎn)/分)培養(yǎng)觀 30h后，即獲得一級種子液。⑤制備二級種子液培養(yǎng)基以及裝量與上一步相同，但是在搖瓶中放入10顆玻璃珠，將一級種子液，按照20wt%移種量移入二級搖瓶培養(yǎng)在27 30 溫度條件下，在搖床上(200 260轉(zhuǎn)/分)培養(yǎng)14 1 后，即為二級種子液。⑥投料發(fā)酵按照2wt%的投料量投入底物(沃氏氧化物)到二級種子液中，在相同條件下，培養(yǎng)4 后即為符合要求的發(fā)酵液后下料。⑦結(jié)果檢測將每個搖瓶的發(fā)酵液加熱煮沸，趁熱抽濾。取濾餅粉碎后，加入 150ml工業(yè)級丙酮升溫到丙酮沸點(diǎn)蒸發(fā)回流2h。然后趁熱抽濾，將濾液濃縮至20ml，冷卻結(jié)晶。將結(jié)晶物抽濾得到粗制品和母液后，將粗制品在IOOtlC烘箱中烘干。稱取粗制品重量， 根據(jù)投料量計算粗制品收率和轉(zhuǎn)化率。⑧選取生產(chǎn)菌株將收率和轉(zhuǎn)化率相對較高的菌株(在收率100%、轉(zhuǎn)化率70%以上的菌株中選擇收率和轉(zhuǎn)化率都比較高的菌株)一方面制成沙土管原種在4 條件下保存于冰箱中作為原種為以后生產(chǎn)和選育優(yōu)良菌株備用；另一方面?zhèn)鞔糜诹趔w發(fā)酵生產(chǎn)。⑨傳代培養(yǎng)在27 30 溫度條件下，將選取的生產(chǎn)菌株接入PDA培養(yǎng)基試管 (30X200)斜面上培養(yǎng)7 9d，待菌落長滿斜面并產(chǎn)生綠色分生孢子后即用于培養(yǎng)生產(chǎn)用菌種。⑩培養(yǎng)生產(chǎn)母種將煮熟的小米160g放入IOOOml三角瓶，然后將傳代培養(yǎng)后的菌種從試管斜面上接入三角瓶搖勻后(接種量按照一支試管斜面菌種接種16 18瓶控制)， 在27 30 條件下培養(yǎng)7天，使得菌種長滿培養(yǎng)基并呈綠色。培養(yǎng)一級生產(chǎn)種子液將30瓶生產(chǎn)菌種接入已經(jīng)置入了 3. 6t培養(yǎng)液(配方與搖瓶培養(yǎng)液相同)的種子罐(6t容積)中。在27 30 溫度條件下培養(yǎng)觀 30h后，取樣鏡檢確定沒有被污染并且綠僵菌菌絲飽滿，菌絲體濕重達(dá)到3. 6g/40ml標(biāo)準(zhǔn)后即可移入二級發(fā)酵罐中培養(yǎng)。底物溶液制備將底物(沃氏氧化物)溶解罐(6t體積)中加入3. 6t自來水，將 360kg沃氏氧化物投入其中，再加入3. 6kg洗衣粉，密閉后升溫至121°C保溫0.證后降溫至 55°C后即為底物溶液備用。培養(yǎng)二級生產(chǎn)種子液將30t容積的發(fā)酵罐中置入18t培養(yǎng)液(配方與搖瓶培養(yǎng)液相同)，然后將種子罐中的培養(yǎng)液全部移入該發(fā)酵罐，在27 ^tlC溫度條件下培養(yǎng)14 16h后，取樣鏡檢確定沒有被污染并且綠僵菌菌絲飽滿，菌絲體濕重達(dá)到4. 5g/40ml標(biāo)準(zhǔn)后，壓入底物溶液即可開始發(fā)酵。投底物發(fā)酵在盛有二級種子液的發(fā)酵罐中壓入底物(沃氏氧化物)，在相同條件下培養(yǎng)4 后，根據(jù)取樣檢測當(dāng)時的發(fā)酵罐中的轉(zhuǎn)化情況決定發(fā)酵終止時間，一般控制發(fā)酵時間48 50h。壓濾在發(fā)酵達(dá)到終止條件后對發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液進(jìn)行升溫至80°C后降溫至 60°C左右后進(jìn)行壓濾，取濾餅打粉后備用。濾餅粉提取將濾餅粉投入提取罐，加入底物的12倍重量的丙酮，升溫至55 65°C后回流0.證，然后壓濾至濃縮罐進(jìn)行濃縮；再打入底物的12倍量丙酮循環(huán)回流、提取6 次后直至濾餅提取干凈(取樣檢測)。粗制品濃縮將提取液濃縮至粥狀物，加入10 15kg NaOH和1 1. 5t工藝用水，升溫至95 105 °C并維持1 濁。粗制品離心將上述溶液置入離心機(jī)離心甩干。用45 50°C工藝用水洗滌至中性。粗制品烘干將上述粗制品放入烘箱(105 115°C)烘烤8 IOh即獲得粗制
品精制品將粗制品投入精制罐，加混合溶劑(氯仿甲苯=6: 1)升溫至70 800C回流lh，然后再升溫至90°C保壓0. 5h，然后濃縮至103 105°C，體積400 600L，然后降溫至35 40°C壓濾。按照上述程序反復(fù)精制3次；打入混合溶劑(氯仿甲苯=1: 6)， 升溫至70 80°C回流lh，然后再升溫至90°C保壓0. 5h后濃縮，趁熱壓濾，如此反復(fù)操作4 次。取樣檢測合格后，加入工藝用水2 2. 5t后蒸餾，去除殘留混合溶劑，趁熱離心甩干、 水洗后，放入烘箱(105 115°C)烘烤8 IOh即獲得霉菌氧化物精制品。對本發(fā)明提出的新型金龜子綠僵菌菌株，就其菌株培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件和搖床驗(yàn)證 (對沃氏氧化物發(fā)酵轉(zhuǎn)化為霉菌氧化物)整個過程，進(jìn)行了 4個實(shí)例驗(yàn)證在搖床轉(zhuǎn)速200r/ min，培養(yǎng)溫度27 °C，發(fā)酵時間40h的條件下，收率為100%，轉(zhuǎn)化率為70. 86% ；在搖床轉(zhuǎn)速 220r/min,培養(yǎng)溫度，發(fā)酵時間48h的條件下，收率為105%，轉(zhuǎn)化率為75. 36% ；在搖床轉(zhuǎn)速230r/min，培養(yǎng)溫度^°C，發(fā)酵時間56h的條件下，收率為105%，轉(zhuǎn)化率為78. 74% ； 在搖床轉(zhuǎn)速M(fèi)Or/min，培養(yǎng)溫度30°C，發(fā)酵時間60h的條件下，收率為100%，轉(zhuǎn)化率為 73.67%。其結(jié)果表明在培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件(搖床轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間)做相應(yīng)變動的條件下，金龜子綠僵菌菌株LJYH201011對沃氏氧化物的轉(zhuǎn)化率和霉菌氧化物的收率分別穩(wěn)定在100 105%和70. 86 78. 74%之間，說明本發(fā)明提出的金龜子綠僵菌新型菌株具有優(yōu)良的性狀；而且其在大型生產(chǎn)規(guī)模上該菌株也具有較高的轉(zhuǎn)化率和收率，其沃氏氧化物轉(zhuǎn)化率為60 65%，霉菌氧化物(精品)收率為86 89%。
權(quán)利要求
1.一種金龜子綠僵菌菌株，其分類地位為真菌界、子囊菌門、糞殼菌綱、肉座菌亞綱、 肉座菌目、麥角菌科、綠僵菌屬；保藏于“中國普通微生物菌種保藏管理中心”，保藏時間為 2011 年 1 月 21 日，保藏號為=CGMCC No. 4564。
2.權(quán)利要求1所述的金龜子綠僵菌菌株CGMCCNo. 4564在以沃氏氧化物為底物生產(chǎn)霉菌氧化物中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所述的金龜子綠僵菌菌株CGMCCNo. 4564在以沃氏氧化物為底物生產(chǎn)霉菌氧化物的方法，其特征在于包括以下步驟3. 1原種復(fù)活在27 30°C溫度條件下，將保存的原種在PDA培養(yǎng)基試管斜面上培養(yǎng)， 直到菌落長滿斜面并出現(xiàn)綠色分生孢子堆；3. 2制備菌懸液取無菌水和玻璃珠置入三角瓶中，將培養(yǎng)好的菌種移入三角瓶，將三角瓶在搖床上旋轉(zhuǎn)，再取菌懸液稀釋后，涂布在直徑為PDA平板上，在27 30°C溫度條件下培養(yǎng)；3. 3制備試管斜面在培養(yǎng)的PDA平板上選擇單個菌落接種在PDA試管斜面上，在27 30°C溫度條件下培養(yǎng)；3. 4制備一級種子液將試管斜面培養(yǎng)的菌種移入已經(jīng)滅菌的搖瓶培養(yǎng)液中，在27 30°C溫度條件下，在搖床上以200 240轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)觀 30h，獲得一級種子液；3. 5制備二級種子液培養(yǎng)基以及裝量與上一步相同，在搖瓶中放入玻璃珠，將一級種子液按照20wt%移種量移入二級搖瓶培養(yǎng)，在27 30°C溫度條件下，在搖床上以200 240 轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)14 1 后，即得二級種子液；3. 6投料發(fā)酵按照2wt%的投料量投入沃氏氧化物到二級種子液中搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，在以上相同條件下，培養(yǎng)4 后得到發(fā)酵液；3. 7結(jié)果檢測將每個搖瓶的發(fā)酵液經(jīng)“煮沸-抽濾-粉碎-加入丙酮蒸發(fā)-回流-再抽濾-濃縮-結(jié)晶，，程序后，將結(jié)晶物抽濾得到粗制品和母液，將粗制品烘干稱取粗制品重量，根據(jù)投料量計算粗制品收率和轉(zhuǎn)化率；3. 8選取生產(chǎn)菌株在收率100%、轉(zhuǎn)化率70%以上的菌株中選擇收率和轉(zhuǎn)化率高于平均值的菌株，一方面制成沙土管原種在4°C條件下保存于冰箱中作為原種為以后生產(chǎn)和選育優(yōu)良菌株備用，另一方面?zhèn)鞔糜诹趔w發(fā)酵生產(chǎn)；3. 9傳代培養(yǎng)在27 30°C溫度條件下，將選取的生產(chǎn)菌株接入PDA培養(yǎng)基試管斜面上培養(yǎng)7 9天，直到菌落長滿斜面并產(chǎn)生綠色分生孢子；3. 10培養(yǎng)生產(chǎn)母種將煮熟的小米盛入三角瓶并滅菌冷卻后，然后將傳代培養(yǎng)后的菌種從試管斜面上接入三角瓶搖勻，在27 30°C條件下培養(yǎng)，使得菌種長滿培養(yǎng)基并呈綠色；3. 11培養(yǎng)一級生產(chǎn)種子液將生產(chǎn)母種接入種子罐中，培養(yǎng)基與搖瓶培養(yǎng)液相同，在 27 30°C溫度條件下培養(yǎng)觀 30h，取樣鏡檢確定沒有被污染并且綠僵菌菌絲飽滿，菌絲體濕重達(dá)到3. 6g/40ml標(biāo)準(zhǔn)后即可移入二級發(fā)酵罐中培養(yǎng)；3. 12底物溶液制備溶解罐中加入水，將沃氏氧化物投入其中，再加入洗衣粉，密閉后升溫至121°C保溫，然后降溫至常溫得到底物溶液備用；3. 13培養(yǎng)二級生產(chǎn)種子液在發(fā)酵罐中置入培養(yǎng)液，然后將種子罐中的一級生產(chǎn)種子液移入該發(fā)酵罐，在27 溫度條件下培養(yǎng)14 1 后，取樣鏡檢確定沒有被污染并且綠僵菌菌絲飽滿，菌絲體濕重達(dá)到4. 5g/40ml標(biāo)準(zhǔn)后，壓入底物溶液；/3. 14投底物發(fā)酵壓入沃氏氧化物底物溶液，在27 溫度下發(fā)酵培養(yǎng)48 50h， 根據(jù)取樣檢測當(dāng)時的發(fā)酵罐中的轉(zhuǎn)化情況決定發(fā)酵終止時間；/3. 15壓濾在發(fā)酵達(dá)到終止條件后對發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液進(jìn)行壓濾，取濾餅打粉后備用； 3. 16濾餅粉提取將濾餅粉投入提取罐，加入丙酮，升溫至55 65°C后回流，然后壓濾至濃縮罐進(jìn)行濃縮，再打入丙酮循環(huán)回流、提取，直至濾餅提取干凈；/3. 17粗制品濃縮將上步的提取液濃縮至粥狀物，加入NaOH和工藝用水，升溫至95 105 °C并維持1 ； /3. 18粗制品離心將上步溶液置入離心機(jī)離心甩干，用工藝用水洗滌至中性； 3. 19粗制品烘干將上述粗制品放入烘箱，烘烤獲得粗制品；/3. 20精制品將粗制品投入精制罐，加入氯仿和甲苯的混合溶劑，升溫至70 80°C回流，再升溫至90°C保壓，然后在103 105°C下濃縮，降溫至35 40°C壓濾，再次打入氯仿和甲苯的混合溶劑，升溫至70 80°C回流，然后再升溫至90°C保壓后濃縮，趁熱壓濾，取樣檢測合格后，加入工藝用水蒸餾，去除殘留混合溶劑，趁熱離心甩干、水洗后，放入烘箱烘烤，即獲得霉菌氧化物精制品。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高產(chǎn)甾體發(fā)酵金龜子綠僵菌新菌株LJYH201011及其在以沃氏氧化物為底物生產(chǎn)霉菌氧化物中的應(yīng)用。所述菌株保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)，保藏時間為2011年1月21日，保藏號為CGMCCNo.4564。本發(fā)明所述的綠僵菌菌株，其用于甾體化合物(薯蕷皂甙)為原料生產(chǎn)植物激素的轉(zhuǎn)化過程中，以沃氏氧化物為底物生產(chǎn)霉菌氧化物。其生產(chǎn)霉菌氧化物具有轉(zhuǎn)化率高(70.86～78.74%)、收率高(100～105%)，而且生物學(xué)性狀比較穩(wěn)定等特點(diǎn)。本發(fā)明可以為以薯蕷皂甙為原料的植物甾體激素生產(chǎn)提高產(chǎn)量、降低生產(chǎn)成本提供技術(shù)支持。
文檔編號C12N1/14GK102168024SQ20111003139
公開日2011年8月31日 申請日期2011年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月28日
發(fā)明者周德群, 楊曉亮, 楊毅, 王錢鋼, 趙月華 申請人:麗江映華生物藥業(yè)有限公司