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一種半成熟樹突狀細(xì)胞的體外制備方法

文檔序號(hào):394061閱讀:428來源:國(guó)知局
專利名稱:一種半成熟樹突狀細(xì)胞的體外制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域,特別涉及一種半成熟樹突狀細(xì)胞的制備方法。
背景技術(shù)
樹突狀細(xì)胞(DCs)是構(gòu)成機(jī)體細(xì)胞免疫的兩大核心之一,不同樹突狀細(xì)胞亞型指導(dǎo)不同效應(yīng)性T細(xì)胞的分化,從而決定著機(jī)體免疫系統(tǒng)在識(shí)別外來抗原中行使免疫應(yīng)答抑或免疫耐受兩種截然不同的功能。大量研究已證明不成熟樹突狀細(xì)胞(iDCs),完全成熟樹突狀細(xì)胞(mDCs)和半成熟樹突狀細(xì)胞(semi-mature DCs)在介導(dǎo)機(jī)體免疫系統(tǒng)行使免疫耐受還是免疫應(yīng)答中起著完全不同的決定性作用。從解決組織、器官移植排斥和治療自身免疫性疾病的目的出發(fā),人們正在不懈地努力以尋找具有誘導(dǎo)機(jī)體免疫耐受的半成熟樹突狀細(xì)胞。因此,其理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值顯而易見。最新報(bào)道,采用不同方法制備的半成熟樹突狀細(xì)胞具有不同的特性,因而有充分理由推測(cè)它們所誘導(dǎo)機(jī)體免疫耐受的效果及其機(jī)制也不同。迄今為止,已報(bào)道有3種不同特性的半成熟樹突狀細(xì)胞,即 semi-mature DCs1"0, semi-matureDCs1"5 和 semi-mature DCstnf-α及其制備方法。Sato K等通過分離人的外周血單個(gè)核細(xì)胞,用GM-CSF(50ng/ml)和IL-4(50ng/ ml)在體外培養(yǎng)7d,然后加入TNF-a(50ng/ml)或LPS (lOOng/ml)繼續(xù)培養(yǎng)3d;也可用 IL-IO (50ng/ml)培養(yǎng)細(xì)胞 3d,然后加入 TNF_a (50ng/ml) orLPS (100ng/ml)繼續(xù)培養(yǎng) 3d,獲得 semi-mature DCsIL_10o semi-mature DCsil-1 的主要特性是 tnf-α、IL-6 和 IFN-γ 降低, MHC-II、CD80 和 CD86 也降低。Park SJ等在體外用含10ng/ml GM-CSF或0. 5% GM-CSF上清的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠骨髓細(xì)胞,每2d用DC培養(yǎng)基換液,棄非粘附細(xì)胞,培養(yǎng)6d,即分化為骨髓來源樹突狀細(xì)胞(BMDCs),之后用 50ng/ml IL-6 刺激,再加入 100ng/mlLPS、40ng/ml TNF- α 或 40 μ g/ml anti-CD40 抗體,獲得 semi-mature DCsIL-6。semi-mature DCs1"5 的主要特性是 TNF-α 禾口 IL-12 降低,CD40、CD80 和 CCR7 也降低。Menges M等在體外用GM-CSF (200U/ml)或細(xì)胞系分泌的含10% GM-CSF上清誘導(dǎo)培養(yǎng)小鼠骨髓細(xì)胞分化為BMDCs,然后加入TNF-α (500U/ml), LPS (1 μ g/ml)或LPS聯(lián)合 anti-CD40 抗體(5 μ g/ml)培養(yǎng) 24h,即獲得 semi-mature DCstnf^α。semi-mature DCstnf^α 的主要特性是TNF- α、IL-6和IFN- γ降低,而MHC-II、CD80和CD86則升高。以上可見,采用不同方法制備的半成熟樹突狀細(xì)胞具有不同的細(xì)胞表型特性和產(chǎn)生不同水平的細(xì)胞因子,因而提示它們所誘導(dǎo)機(jī)體免疫耐受的效果及其機(jī)制迥異,確切功能仍有待證實(shí)。其中,有的需要分別用誘導(dǎo)成熟和抑制成熟的兩種因素或多種因素去處理 iDCs,以致制備技術(shù)較繁,又因依賴于兩種作用完全相反的因素導(dǎo)致樹突狀細(xì)胞的半成熟程度難以控制,DCs分化的機(jī)制及功能也就不同。因此,我們探索單因素控制的新型半成熟樹突狀細(xì)胞亞群的制備技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足,提供一種半成熟樹突狀細(xì)胞的體外制備方法,包括以下步驟(1)冰浴上收集小鼠骨髓細(xì)胞懸液,離心棄上清;(2)將步驟(1)離心得到的細(xì)胞重懸于磷酸緩沖液(PBS)中,加入細(xì)胞懸液體積 15-20倍的紅細(xì)胞裂解液,37. 0°C避光作用8-lOmin,然后離心;(3)將步驟(2)離心得到的細(xì)胞重懸于含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中;(4)在步驟(3)得到的細(xì)胞懸液中加入10-20 μ g/L重組小鼠粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rmGM-CSF)、2. 5-10 μ g/L重組小鼠白細(xì)胞介素4 (rmIL-4)和l_5mg/L重組嵌合蛋白(Jagged-1/Fc);(5)置于培養(yǎng)箱中孵育;(6)隔天1次,重復(fù)以下操作去除上層懸浮細(xì)胞,收集疏松貼壁細(xì)胞,離心棄上清,然后用含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基重懸離心得到的細(xì)胞,加入同步驟(4) 等劑量的rmGM-CSF、rmIL-4和Jagged-1/Fc,然后置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育;(7)第6-8d開始,加入與步驟(4)相比半劑量的rmGM-CSF和rmIL-4,Jagged-I/ Fc劑量不變,其余同步驟(6);(8)第10-12d棄底層牢固貼壁細(xì)胞,收獲疏松貼壁細(xì)胞,即Jagged-I誘導(dǎo)的半成熟樹突狀細(xì)胞(semi-mature DCsjagged"1)。所述步驟(1)、(6)中離心條件為4°〇,300\8,離心3_5111土11。所述步驟O)中磷酸緩沖液的加入量為能重懸細(xì)胞的最小體積。所述步驟(2)中離心時(shí)用冷PBS作為洗滌溶液,離心洗滌3次,離心條件均為4°C, 300 X g,離心 3-5min。所述步驟(3)中細(xì)胞重懸后細(xì)胞密度為2-5X109/L。所述步驟(5)、(6)、(7)中培養(yǎng)箱內(nèi)條件為37. 0°C、5% CO2。本發(fā)明的機(jī)理業(yè)已證明Jagged-I是存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞Notch受體的主要配體之一,為單次跨膜糖蛋白,在骨髓、胎兒肝基質(zhì)細(xì)胞、胸腺上皮細(xì)胞等均有表達(dá)。 Jagged-I-Notch信號(hào)在維持造血干/祖細(xì)胞和胸腺細(xì)胞向T、B和NK細(xì)胞發(fā)育分化中發(fā)揮十分重要的作用。另發(fā)現(xiàn)樹突狀細(xì)胞(DCs)和T淋巴細(xì)胞表面均存在Notch受體和 Jagged-I配體的表達(dá),推測(cè)Jagged-I-Notch信號(hào)可能調(diào)控DCs的分化成熟,又因這兩種細(xì)胞表面互有Notch受體和Jagged-I配體,設(shè)想兩種細(xì)胞間配體與受體的相互結(jié)合為DCs和 T淋巴細(xì)胞相互作用實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間的信息交流,從而為指導(dǎo)T細(xì)胞分化提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。本發(fā)明正是基于上述Jagged-I調(diào)控細(xì)胞發(fā)育分化的特性和DCs表面存在Jagged-I受體的發(fā)現(xiàn)來設(shè)計(jì)的。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比有以下優(yōu)點(diǎn)和有益效果(1)本發(fā)明制備方法依賴Jagged-1/Fc處理細(xì)胞,而semi-mature DCsIL_6、 semi-mature DcslHc^nsemi-Iiiature DCstnf^α 分別依賴白細(xì)胞介素 6 (IL-6)、白細(xì)胞介素 IO(IL-IO)和腫瘤壞死因子α (TNF-α)處理細(xì)胞。
(2)上述 semi-mature DCs 都以 GM-CSF和 / 或 IL-4 的誘導(dǎo)為基礎(chǔ),但 semi-mature DCsil"6和semi-mature DCs1"0的誘導(dǎo)需要兩種因素的處理,即先用IL-6或IL-10處理細(xì)胞,然后用TNF-α或細(xì)菌脂多糖(LPS)等處理細(xì)胞,也就是需要兩種或兩種以上的因素聯(lián)合。而 semi-mature DCsjagged"1 只用 Jagged-1/Fc 處理細(xì)胞。(3)本發(fā)明制備方法得到的semi-mature DCsjagged-1的特性,包括細(xì)胞表型和產(chǎn)生的細(xì)胞因子,不同于 semi-mature DCs1"5、semi-mature DCsil-10 禾口 semi—mature DCs "。 與經(jīng)典方法LPS誘導(dǎo)的完全成熟的DCs比較,證明semi-mature DCyH處于半成熟狀態(tài), 其主要特性是主要組織相容性復(fù)合體II類分子(MHC-II)和⑶40的表達(dá)輕度升高,⑶80明顯升高,而⑶86變化不明顯,而且這些共刺激分子的表達(dá)水平顯著低于經(jīng)典方法LPS誘導(dǎo)的完全成熟的mDCs (圖1A,1B) ;TNF-α的水平明顯降低,白細(xì)胞介素12(IL_12)輕度升高,IL-4顯著增高,IL-6和γ干擾素(IFN-γ)變化不明顯。這種細(xì)胞因子的變化格局有利于CD4+初始T細(xì)胞向促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)和免疫耐受的輔助性T細(xì)胞2 (Th2)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 (Treg)方向分化(圖2) ;semi-mature DCslagged-1導(dǎo)致同種異基因淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力減弱(圖3),即有利于誘導(dǎo)免疫耐受。(4) semi-mature DCsjagged-1 的特性不同于已報(bào)道的 semi-mature DCs1"、 semi-mature DCsil"10和semi-mature DCstnf^α,主要取決于采用不同的誘導(dǎo)方法,即 Jagged-1/Fc 介導(dǎo)。


圖1是Jagged Ι/Fc誘導(dǎo)semi-mature DCs的細(xì)胞表型變化圖。A是雙陽細(xì)胞百分比變化,B是平均熒光強(qiáng)度變化;*P < 0. 05,< 0. 01,與相應(yīng)的對(duì)照組比較。圖2是Jagged Ι/Fc誘導(dǎo)semi-mature DCs的細(xì)胞因子變化圖。*P < 0. 05,與對(duì)照組比較。圖3是Jagged Ι/Fc誘導(dǎo)semi-mature DCs對(duì)同種異基因淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答能力的影響圖。*p < 0. 05,< 0. 01,與相應(yīng)的對(duì)照組比較。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述,但發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。實(shí)施例一semi-mature DCsjagged-1 的制備頸髓脫位處死Balb/c(由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供),無菌分離完整的股骨和脛骨,去除肌肉和結(jié)締組織,放入75%酒精中浸泡aiiin,PBS沖洗。剪斷骨頭兩端,用盛有冷PBS的注射器沖洗骨髓腔,輕輕吹打置于冰浴上平皿中的骨髓細(xì)胞懸液,200目不銹鋼網(wǎng)篩過濾,收集骨髓細(xì)胞懸液離心G°C,300Xg,;3min)。用300μ 1冷PBS重懸后加入5ml 紅細(xì)胞裂解液(Sigma-Aldrich),37. 0°C避光作用 8min,冷 PBS 洗 3 次(4°C,300 X g,3min)。 最后,細(xì)胞重懸于含10%胎牛血清RPMI1640完全培養(yǎng)基(GibcoBRL)中,調(diào)整細(xì)胞密度為 2 X IOVlo將細(xì)胞懸液每孔2mL接種于6孔板中,分別加入20 μ g/L rmGM-CSF (Peprotech)、 10 μ g/LrmIL-4 (Peprotech)和 5mg/L Jagged 1/Fc (R&D Systems),置于 37. 0°C、5% CO2 培養(yǎng)箱中孵育。隔天1次,去除上層懸浮細(xì)胞,收集疏松貼壁細(xì)胞,離心G°C,300 Xgdmin)
5棄上清。用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,分別加入同等劑量的rmGM-CSF、rmIL-4和Jagged 1/Fc。 第8d始換液后加入半劑量rmGM-CSF和rmIL_4,Jaggedl/Fc劑量不變。第12d棄底層牢固貼壁細(xì)胞,收獲疏松貼壁細(xì)胞,即semi-matureDCskged—1。實(shí)施例二semi-mature DCsjagged-1 的制備 頸髓脫位處死C57BL/6小鼠(由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供),無菌分離完整的股骨和脛骨,去除肌肉和結(jié)締組織,放入75%酒精中浸泡2min,PBS沖洗。剪斷骨頭兩端,用盛有冷PBS的注射器沖洗骨髓腔,輕輕吹打置于冰浴上平皿中的骨髓細(xì)胞懸液,200目不銹鋼網(wǎng)篩過濾,收集骨髓細(xì)胞懸液離心(4°C,300 X g,3min)。用300 μ 1冷PBS重懸后加入6ml 紅細(xì)胞裂解液(Sigma-Aldrich),37. 0°C避光作用 9min,冷 PBS 洗 3 次(4°C,300 X g,3min)。 最后,細(xì)胞重懸于含10%胎牛血清RPMI1640完全培養(yǎng)基(GibcoBRL)中,調(diào)整細(xì)胞密度為 2 X IOVlo將細(xì)胞懸液每孔2mL接種于6孔板中,分別加入10 μ g/L rmGM-CSF (Peprotech)、 2. 5 μ g/L rmIL-4 (Peprotech)和 lmg/L Jagged 1/Fc (R&D Systems),置于 37. 0°C、5% CO2 培養(yǎng)箱中孵育。隔天1次,去除上層懸浮細(xì)胞,收集疏松貼壁細(xì)胞,離心(4°C,300Xg,3min) 棄上清。用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,分別加入同等劑量的rmGM-CSF、rmIL-4和Jagged 1/Fc。 第8d始換液后加入半劑量rmGM-CSF和rmIL-4,Jagged 1/Fc劑量不變。第12d棄底層牢固貼壁細(xì)胞,收獲疏松貼壁細(xì)胞,即semi-mature DCJaggedA實(shí)施例三semi-mature DCsjagged-1 的制備頸髓脫位處死C57BL/6小鼠(由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供),無菌分離完整的股骨和脛骨,去除肌肉和結(jié)締組織,放入75%酒精中浸泡2min,PBS沖洗。剪斷骨頭兩端,用盛有冷PBS的注射器沖洗骨髓腔,輕輕吹打置于冰浴上平皿中的骨髓細(xì)胞懸液, 200目不銹鋼網(wǎng)篩過濾,收集骨髓細(xì)胞懸液離心(4°C,300Xg,3min)。用300 μ 1冷PBS 重懸后加入4. 5ml紅細(xì)胞裂解液(Sigma-Aldrich),37. 0°C避光作用9min,冷PBS洗3次 (4°C,300Xg,3min)。最后,細(xì)胞重懸于含10%胎牛血清RPMI1640完全培養(yǎng)基(GibcoBRL) 中,調(diào)整細(xì)胞密度為2X 109/L。將細(xì)胞懸液每孔2mL接種于6孔板中,分別加入15 μ g/L rmGM-CSF(Peprotech)>7 μ g/L rmIL-4(P印rotech)禾口 3mg/L Jagged 1/Fc(R&D Systems), 置于37. 0°C,5% CO2培養(yǎng)箱中孵育。隔天1次,去除上層懸浮細(xì)胞,收集疏松貼壁細(xì)胞,離心(4°C,300Xg,3min)棄上清。用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,分別加入同等劑量的rmGM-CSF、 rmIL-4 和 Jagged 1/Fc。第 8d 始換液后加入半劑量 rmGM-CSF 和 rmIL-4,Jagged 1/Fc 劑量不變。第12d棄底層牢固貼壁細(xì)胞,收獲疏松貼壁細(xì)胞,即semi-mature DC^aggedA實(shí)施例四semi-mature DCsjagged-1 的檢測(cè)(1) semi-mature DCsjagged"1的表型分析用冷PBS離心洗滌實(shí)施例一收集的 semi-mature DCsjagget"3 次(4 °C,300 X g,3min),100 μ L 冷 PBS 重懸細(xì)胞 (5 X IO5-I X IO6)。分別加 Λ 0. 25 μ g anti-CDllc-FITC(eBioscience)和 LOygant i-MHC-II-PE(eBioscience),0· 25 μg anti-CDllc-FITC(eBioscience)禾口 0·125 μg anti-CD86-FITC(eBioscience),0. 25 μ g anti-CDllc-FITC(eBioscience)禾口 0·06 μ g anti-CD80-PE-CY5(eBioscience),0· 25 μ g anti—CDllc—FITC(eBioscience)禾口 0·25 μ g anti-CD40-APC (eBioscience)染色,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,輕輕混勻后4. 0°C下避光放置30min。 經(jīng)PBS洗滌2次(4 ,300Χβ,3π η),100μ PBS重懸,在振蕩器上緩慢加入4 %多聚甲醛PBS溶液100 μ L,在FACSCalibur流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson)上檢測(cè)CDllc分別與⑶40,⑶80,CD86和MHC-II雙陽細(xì)胞百分比(圖1A)和平均熒光強(qiáng)度(圖1B)。每管樣品檢測(cè)10000個(gè)細(xì)胞,所獲數(shù)據(jù)用CELLQuest軟件(Becton Dickinson)分析,另以經(jīng)典方法LPS誘導(dǎo)完全成熟的mDCs作比較。從圖IA中可見,與對(duì)照組比較,除了⑶86夕卜, Semi^atureDCSjagged-1細(xì)胞表面反映細(xì)胞成熟度的共刺激分子CD40和CD86的表達(dá)有所升高,MHC-II分子也有所升高,但⑶40、⑶86共刺激分子和MHC-II分子的百分比均顯著低于完全成熟的mDCs,這與細(xì)胞表面表達(dá)這些分子的總平均熒光強(qiáng)度相吻合(圖1B),因此,細(xì)胞的表型變化表明semi-mature DCsjagged-1的確處于半成熟狀態(tài)。(2) semi-mature DCsjagget"的細(xì)胞因子分析收集semi-mature DCsjagged-1體外培養(yǎng)細(xì)胞上清,以經(jīng)典方法LPS誘導(dǎo)完全成熟的mDCs的細(xì)胞培養(yǎng)上清作比較,采用小鼠雙抗夾心ELISA試劑盒(JINGMEI BIOTECH)檢測(cè) semi-mature DCsjagget"培養(yǎng)上清中 IL-4、IL-6、IL-12、TNF-α 和 IFN-γ 的水平,具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行,最后經(jīng)BIO-RAD 680型酶標(biāo)儀在450nm處讀取吸光度值,并經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其濃度。圖2顯示,TNF-α的水平明顯降低,白細(xì)胞介素12(IL-12)輕度升高,IL-4 顯著增高,IL-6和γ干擾素(IFN-γ)變化不明顯;其中,IL-12的輕度升高說明Jagged-I 誘導(dǎo)的DCs處于半成熟狀態(tài),TNF-α或IFN-γ的水平降低或無變化,不利于Jagged-I誘導(dǎo)的DCs指導(dǎo)⑶4+初始T細(xì)胞向促進(jìn)免疫應(yīng)答的Thl方向分化,同時(shí)出現(xiàn)IL-4顯著增高,這種細(xì)胞因子的變化格局有利于CD4+初始T細(xì)胞向促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)和免疫耐受的Th2和Treg 方向分化Jagged-I誘導(dǎo)的DCs產(chǎn)生細(xì)胞因子的格局與LPS誘導(dǎo)的完全成熟的mDCs產(chǎn)生細(xì)胞因子的格局完全不同(圖2)。已公認(rèn)LPS誘導(dǎo)的完全成熟的mDCs指導(dǎo)CD4+初始T細(xì)胞向促進(jìn)免疫應(yīng)答的輔助性T細(xì)胞1 (Thl)方向分化,因此,semi-mature DCsjagged-1的細(xì)胞因子變化格局說明其功能也是處于半成熟狀態(tài),即有利于誘導(dǎo)免疫耐受。(3) semi-mature DCsjagged"1對(duì)淋巴結(jié)細(xì)胞免疫應(yīng)答能力的影響頸髓脫位處死BALB/C小鼠(廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供),無菌分離雙側(cè)腋窩、 鎖骨下、腹股溝淺表淋巴結(jié)和腸系膜淋巴結(jié),去掉被膜,冰浴上機(jī)械研磨,用200目不銹鋼網(wǎng)篩過濾。收集細(xì)胞懸液,冷PBS離心G°C,300 Xgdmin)洗滌細(xì)胞2次,含10%胎牛血清 RPMI 1640 (GibcoBRL)完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為2 X 109/L,作為反應(yīng)細(xì)胞。另取上述步驟(1)項(xiàng)用C57BL/6小鼠骨髓細(xì)胞制備的semi-mature DCsjagged-1作為刺激細(xì)胞, 刺激細(xì)胞與反應(yīng)細(xì)胞按細(xì)胞數(shù)1 5,1 10,1 20的比例接種于96孔板,總體積200μ 1, 置于37. 0°C>5% CO2培養(yǎng)箱中混合培養(yǎng)72h,加入四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT) (Sigma-Aldrich), 使終濃度為5mg/L,4h后離心棄上清(300 X g,5min),加入100 μ 1 二甲基亞楓(DMSO),避光放置于微量振蕩器上輕微震蕩lOmin,用680型酶標(biāo)儀(BIO-RAD)在540nm處檢測(cè)吸光度 (OD)值。如圖3所示,與對(duì)照組比較,semi-mature DCyH導(dǎo)致同種異基因淋巴細(xì)胞的免疫應(yīng)答能力明顯減弱,而LPS誘導(dǎo)的完全成熟DCs則導(dǎo)致同種異基因淋巴細(xì)胞的免疫應(yīng)答能力增強(qiáng)。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式,但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制,其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化, 均應(yīng)為等效的置換方式,都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種半成熟樹突狀細(xì)胞的體外制備方法,其特征在于包括以下步驟(1)冰浴上收集小鼠骨髓細(xì)胞懸液,離心棄上清;(2)將步驟(1)離心得到的細(xì)胞重懸于PBS中,加入細(xì)胞懸液體積15-20倍的紅細(xì)胞裂解液,37. 0°C避光作用8-lOmin,然后離心;(3)將步驟(2)離心得到的細(xì)胞重懸于含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基中;(4)在步驟(3)得到的細(xì)胞懸液中加入10-20yg/L重組小鼠粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子rmGM-CSF、2. 5-10 μ g/L重組小鼠白細(xì)胞介素4rmIL_4和l_5mg/L重組嵌合蛋白 Jagged-1/Fc;(5)置于培養(yǎng)箱中孵育;(6)隔天1次,重復(fù)以下操作去除上層懸浮細(xì)胞,收集疏松貼壁細(xì)胞,離心棄上清,用含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基重懸離心得到的細(xì)胞,加入同步驟(4)等劑量的 rmGM-CSF、rmIL-4和Jagged-1/Fc,然后置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育;(7)第6-8天開始,加入與步驟(4)相比半劑量的rmGM-CSF和rmIL-4,Jagged-l/FC齊[J 量不變,其余同步驟(6);(8)第10-12天棄底層牢固貼壁細(xì)胞,收獲疏松貼壁細(xì)胞,即Jagged-I誘導(dǎo)的半成熟樹突狀細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種半成熟樹突狀細(xì)胞的體外制備方法,其特征在于所述步驟⑴、(6)中離心條件為4°C,300Xg,離心3-5min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種半成熟樹突狀細(xì)胞的體外制備方法,其特征在于所述步驟(2)中磷酸緩沖液的加入量為能重懸細(xì)胞的最小體積。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種半成熟樹突狀細(xì)胞的體外制備方法,其特征在于所述步驟(2)中離心時(shí)用冷PBS作為洗滌溶液,離心洗滌3次,離心條件均為4°C,300Xg,離心 3-5min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種半成熟樹突狀細(xì)胞的體外制備方法,其特征在于所述步驟(3)中細(xì)胞重懸后細(xì)胞密度為(2-5)X109/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種半成熟樹突狀細(xì)胞的體外制備方法,其特征在于所述步驟(5)、(6)、(7)中培養(yǎng)箱內(nèi)條件為37. 0°C、5% CO2。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種半成熟樹突狀細(xì)胞的體外制備方法,具體為收集小鼠骨髓細(xì)胞懸液,離心,裂解,細(xì)胞重懸于RPMI 1640完全培養(yǎng)基中,加入10-20μg/L rmGM-CSF、2.5-10μg/L rmIL-4和1-5mg/L Jagged-1/Fc,孵育,收集疏松貼壁細(xì)胞,用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,加入等劑量的rmGM-CSF、rmIL-4和Jagged-1/Fc,收集疏松貼壁細(xì)胞,第6-8d加入半劑量的rmGM-CSF和rmIL-4,等劑量Jagged-1/Fc,第10-12d收獲疏松貼壁細(xì)胞,即semi-mature DCsJagged-1。這種細(xì)胞只用Jagged-1/Fc處理,能導(dǎo)致同種異基因淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力減弱,有利于誘導(dǎo)免疫耐受。
文檔編號(hào)C12N5/077GK102154199SQ201110032089
公開日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2011年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月29日
發(fā)明者于哲, 劉靜, 邢飛躍 申請(qǐng)人:暨南大學(xué)
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