專利名稱：耐低磷環(huán)境基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和植物學(xué)領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及一種耐低磷環(huán)境基因及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
農(nóng)業(yè)上大量地施磷肥雖能暫時(shí)滿足植物生長(zhǎng)對(duì)磷的需要，但增加生產(chǎn)成本，加劇磷礦資源的耗竭，還造成水體富營(yíng)養(yǎng)化和生態(tài)環(huán)境的污染。磷是植物生長(zhǎng)與發(fā)育所必需的營(yíng)養(yǎng)元素之一。它是細(xì)胞內(nèi)磷脂、核酸等重要物質(zhì)的組分，以蛋白質(zhì)磷酸化和去磷酸化的方式調(diào)節(jié)生命活動(dòng)，參加糖、蛋白質(zhì)和脂類多種代謝過(guò)程，在植物的生命活動(dòng)中具有重要的生物學(xué)功能。土壤中磷的總量豐富，但易被礦物和有機(jī)物所固定，大部分以植物不能直接利用的形式存在，使得缺磷成為限制植物生長(zhǎng)的主要因素之一。農(nóng)業(yè)上大量地施磷肥能暫時(shí)滿足植物生長(zhǎng)對(duì)磷的需要，但增加生產(chǎn)成本，加劇磷礦資源的耗竭，還造成水體富營(yíng)養(yǎng)化和生態(tài)環(huán)境的污染。在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，植物自身形成了一系列適應(yīng)低磷環(huán)境的方式?？梢?，探明植物適應(yīng)低磷環(huán)境的分子機(jī)制、挖掘植物耐低磷生長(zhǎng)環(huán)境的功能基因，對(duì)改良現(xiàn)有農(nóng)作物品種的磷營(yíng)養(yǎng)性狀，具有重要科學(xué)及實(shí)踐應(yīng)用意義。因此，本領(lǐng)域需要鑒定和分離對(duì)抗低磷環(huán)境的基因，并深入研究其抗逆境機(jī)制，更重要地是切實(shí)地將之應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種耐低磷環(huán)境基因及其應(yīng)用。在本發(fā)明的第一方面，提供一種甘油磷酸二酯酶(OTroi)或其編碼基因的用途，用于提高植物耐低磷環(huán)境能力。在另一優(yōu)選例中，所述甘油磷酸二酯酶還用于促進(jìn)低磷生長(zhǎng)環(huán)境下植物體內(nèi)磷的循環(huán)利用。在另一優(yōu)選例中，所述甘油磷酸二酯酶是(a)如SEQ ID NO 3所示氨基酸序列的蛋白；或(b)將SEQ ID NO 3所示氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè)(如1-20個(gè)；較佳地1-10個(gè)；更佳地1-5個(gè))氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有提高植物耐低磷環(huán)境能力功能的由(a)衍生的蛋白。
toon] 在另一優(yōu)選例中，所述的甘油磷酸二酯酶(OTroi)來(lái)源于十字花科植物。在另一優(yōu)選例中，所述的甘油磷酸二酯酶(⑶F1Dl)來(lái)源于擬南芥(Arabidopsisthaliana)。在本發(fā)明的另一方面，提供一種提高植物耐低磷環(huán)境能力或促進(jìn)低磷生長(zhǎng)環(huán)境下植物體內(nèi)磷的循環(huán)利用的方法，所述方法包括提高植物中甘油磷酸二酯酶的表達(dá)或活性。在另一優(yōu)選例中，所述的方法包括將甘油磷酸二酯酶的編碼基因轉(zhuǎn)入植物中。
在另一優(yōu)選例中，所述的方法包括步驟(i)提供攜帶表達(dá)載體的農(nóng)桿菌，所述的表達(dá)載體含有甘油磷酸二酯酶的編碼基因；
(ii)將植物細(xì)胞、組織或器官與步驟(i)中的農(nóng)桿菌接觸，從而使所述甘油磷酸二酯酶的編碼基因轉(zhuǎn)入植物。在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括(iii)選擇出轉(zhuǎn)入了甘油磷酸二酯酶的編碼基因的植物細(xì)胞、組織、器官；以及(iv)將步驟(iii)中的植物細(xì)胞、組織、器官再生并選出轉(zhuǎn)基因植物。 在本發(fā)明的另一方面，提供一種耐低磷環(huán)境的植物，其是由前述方法制備獲得的轉(zhuǎn)基因植物。在本發(fā)明的另一方面，提供一種甘油磷酸二酯酶或其編碼基因的用途，用作鑒定植物的耐低磷環(huán)境能力的分子標(biāo)記物。在本發(fā)明的另一方面，提供一種受低磷環(huán)境誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，所述的啟動(dòng)子選自下組(I)如SEQ ID NO 1中第1_605位所不的核苷酸序列的多核苷酸；(2)在嚴(yán)格條件下能夠與⑴限定的多核苷酸序列雜交且具有誘導(dǎo)目的基因在低磷環(huán)境下表達(dá)的功能的多核苷酸；或(3)與(I)限定的多核苷酸序列具有90%以上(優(yōu)選95%以上，更優(yōu)選98%以上，最優(yōu)選99%以上)相同性且具有誘導(dǎo)目的基因在低磷環(huán)境下表達(dá)的功能的多核苷酸。在本發(fā)明的另一方面，提供所述的啟動(dòng)子的用途，所述的啟動(dòng)子用于誘導(dǎo)目的基因在低磷環(huán)境下表達(dá)。在本發(fā)明的另一方面，提供一種構(gòu)建物，所述的構(gòu)建物含有所述的受低磷環(huán)境誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。在另一優(yōu)選例中，所述構(gòu)建物中，受低磷環(huán)境誘導(dǎo)的啟動(dòng)子的下游含有至少一個(gè)多克隆位點(diǎn)(如酶切位點(diǎn))，其與所述的受低磷環(huán)境誘導(dǎo)的啟動(dòng)子可操作性連接，用于插入目的基因。在另一優(yōu)選例中，所述的構(gòu)建物是表達(dá)載體。在另一優(yōu)選例中，所述的構(gòu)建物含有以下可操作性連接的元件所述的啟動(dòng)子；和目的基因。在另一優(yōu)選例中，所述的目的基因是外源基因。在另一優(yōu)選例中，所述的目的基因是結(jié)構(gòu)基因。在另一優(yōu)選例中，所述的目的基因可編碼具有特定功能的蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述的目的基因位于所述啟動(dòng)子的下游，且與所述啟動(dòng)子的間隔小于2000bp (優(yōu)選的，小于IOOObp ;更優(yōu)選的，小于500bp ;最優(yōu)選的，小于300bp)。在本發(fā)明的另一方面，提供一種誘導(dǎo)目的基因在低磷環(huán)境下表達(dá)的方法，所述的方法包括將構(gòu)建物轉(zhuǎn)化植物，所述的構(gòu)建物含有所述的受低磷環(huán)境誘導(dǎo)的啟動(dòng)子以及與所述的啟動(dòng)子可操作地連接的目的基因。在另一優(yōu)選例中，所述方法包括(a)提供攜帶表達(dá)載體的農(nóng)桿菌，所述表達(dá)載體中含有構(gòu)建物，所述的構(gòu)建物含有所述的受低磷環(huán)境誘導(dǎo)的啟動(dòng)子以及與所述的啟動(dòng)子可操作地連接的目的基因；(b)將植物細(xì)胞、組織或器官與步驟(a)中的農(nóng)桿菌接觸，從而使所述的構(gòu)建物轉(zhuǎn)入植物。
在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括(C)選擇出轉(zhuǎn)入了所述構(gòu)建物的植物細(xì)胞、組織、器官；以及(d)將步驟(C)中的植物細(xì)胞、組織、器官再生并選出轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖I、At⑶PDl的組織表達(dá)特性。(a)Northern blot分析根、莖、葉、花、果實(shí)組織中At⑶F1Dl的轉(zhuǎn)錄表達(dá)；(b) pAtOTPDl::⑶S植株中⑶S組織化學(xué)染色。圖2、低磷營(yíng)養(yǎng)環(huán)境誘導(dǎo)At⑶PDl基因表達(dá)。(a) Northern blot分析低磷營(yíng)養(yǎng)環(huán)境下At⑶PDl轉(zhuǎn)錄表達(dá)；(b)低磷營(yíng)養(yǎng)環(huán)境下pAt⑶HH ::⑶S植株⑶S組織化學(xué)染色。圖3、低磷營(yíng)養(yǎng)環(huán)境下At⑶PDl突變體atgdpdl-1的表型。(a) AtGDPDl 突變體 atgdpdl-1 的 T-DNA 插入分析；(b) Southern blot 分析突變體 atgdpdl-1 中 T-DNA 插入的數(shù)量；(c) Semi-RT-PCR分析突變體atgdpdl-1和野生型(WT)中At⑶H)l-6基因表達(dá)變化；(d)缺磷營(yíng)養(yǎng)環(huán)境下突變體atgdpdl-1和野生型(WT)的主根長(zhǎng)比較；(e)缺磷營(yíng)養(yǎng)環(huán)境下突變體atgdpdl-1和野生型(WT)的鮮重比較。圖4、不同濃度的磷生長(zhǎng)環(huán)境下突變體atgdpdl-1和野生型(WT)植物體內(nèi)無(wú)機(jī)磷含量分析。圖5、缺磷生長(zhǎng)環(huán)境下過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株OE-AtOTroi和野生型(WT)主根長(zhǎng)度的差異。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛的研究，找到一種對(duì)于調(diào)節(jié)植物抗逆境能力(提高植物耐低磷
環(huán)境的能力)有用的基因-甘油憐酸二酷酶(Qlycerophospho2iester￡hospho2iestera
se,GDPD)基因。本發(fā)明的基因可極好地應(yīng)用于植物品種的改良，提高植物對(duì)于逆境(低磷環(huán)境)的抵抗力。本發(fā)明為運(yùn)用轉(zhuǎn)基因等分子育種技術(shù)培育耐低磷生長(zhǎng)環(huán)境及磷高效循環(huán)利用的農(nóng)作物新品種，提供非常有價(jià)值的基因資源。本發(fā)明中，對(duì)于適用于本發(fā)明的植物(或作物)沒(méi)有特別的限制，只要其適合進(jìn)行基因的轉(zhuǎn)化操作，如各種農(nóng)作物、花卉植物、或林業(yè)植物等。所述的植物比如可以是(不限于)雙子葉植物、單子葉植物、或裸子植物。更具體地，所述的植物包括(但不限于)小麥、大麥、黑麥、水稻、玉米、高梁、甜菜、蘋果、梨、李、桃、杏、樓桃、草莓、木莓、黑莓、豆、扁豆、豌豆、大豆、油菜、芥、罌粟、齊墩果、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、花生、葫蘆、黃瓜、西瓜、棉花、亞麻、大麻、黃麻、柑桔、梓檬、葡萄柚、菠菜、苘苣、蘆笑、洋白菜、大白菜、小白菜、胡蘿卜、洋蔥、土豆、西紅柿、青椒、鱷梨、桂皮、樟腦、煙葉、堅(jiān)果、咖啡、茄子、甘蔗、茶葉、胡椒、葡萄樹、蠔麻草、香蕉、天然橡膠樹和觀賞植物等。作為一種優(yōu)選方 式，所述的“植物”包括但不限于十字花科、禾本科、薔薇科。比如，所述的“植物”包括但不限于十字花科蕓薹屬的大白菜、小白菜，十字花科鼠耳芥屬植物，禾本科的水稻，此外還包括煙草、瓜果、蔬菜、油菜等等。更佳地，所述的“植物”是十字花科蕓薹屬或鼠耳芥屬(如擬南芥)的植物。如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(lái)(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒(méi)有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。如本文所用，“分離的甘油磷酸二酯酶”、“分離的⑶PDl蛋白”或“分離的⑶PDl多肽”是指GDPDl蛋白基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化GDPDl蛋白?；旧霞兊亩嚯脑诜沁€原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由......構(gòu)
成”、“基本上由......構(gòu)成”、和“由......構(gòu)成”；“主要由......構(gòu)成”、“基本上
由......構(gòu)成”和“由......構(gòu)成”屬于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。如本文所用，所述的“低磷環(huán)境”是指一種環(huán)境(較佳地為土壤環(huán)境)，其中磷的含量低于50 ii M ;較佳地低于30 ii M ;更佳地低于15 ii M ;更佳的低于10 u M。本發(fā)明的多肽(蛋白)可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選的是重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。本發(fā)明還包括⑶PDl蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的GDPDl蛋白相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個(gè)或多個(gè)保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個(gè)化合物(比如延長(zhǎng)多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來(lái)純化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根據(jù)本文的定義這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“⑶PDl蛋白”指具有提高植物耐低磷環(huán)境能力的SEQID NO :3序列的多肽。該術(shù)語(yǔ)還包括具有提高植物耐低磷環(huán)境能力的、SEQ IDNO :3序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè)，還更佳如1-8個(gè)或1-5個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或減少一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語(yǔ)還包括GDPDl蛋白的活性片段和活性衍生物。 多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與GDPDl蛋白DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗GDPDl蛋白的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含GDPDl蛋白或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長(zhǎng)的多肽外，本發(fā)明還包括了 GDPDl蛋白的可溶性片段。通常，該片段具有GDPDl蛋白序列的至少約20個(gè)連續(xù)氨基酸，通常至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個(gè)連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個(gè)連續(xù)氨基酸。本發(fā)明還提供⑶PDl蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然⑶PDl蛋白的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過(guò)各種技術(shù)得到，如通過(guò)輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過(guò)定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如P、Y-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。在本發(fā)明中，“⑶PDl蛋白保守性變異多肽”指與SEQ ID NO 3的氨基酸序列相比，有至多20個(gè)，較佳地至多10個(gè)，更佳地至多5個(gè)，最佳地至多3個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表I進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生。表I
權(quán)利要求
1.一種甘油磷酸二酯酶或其編碼基因的用途，用于提高植物耐低磷環(huán)境能力。
2.如權(quán)利要求I所述的用途，其特征在于，所述甘油磷酸二酯酶還用于促進(jìn)低磷生長(zhǎng)環(huán)境下植物體內(nèi)磷的循環(huán)利用。
3.如權(quán)利要求I所述的用途，其特征在于，所述甘油磷酸二酯酶是 (a)如SEQID NO 3所示氨基酸序列的蛋白；或 (b)將SEQID NO :3所示氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有提高植物耐低磷環(huán)境能力功能的由(a)衍生的蛋白。
4.一種提高植物耐低磷環(huán)境能力或促進(jìn)低磷生長(zhǎng)環(huán)境下植物體內(nèi)磷的循環(huán)利用的方法，所述方法包括提高植物中甘油磷酸二酯酶的表達(dá)或活性。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的方法包括將甘油磷酸二酯酶的編碼基因轉(zhuǎn)入植物中。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的方法包括步驟 (i)提供攜帶表達(dá)載體的農(nóng)桿菌，所述的表達(dá)載體含有甘油磷酸二酯酶的編碼基因；( )將植物細(xì)胞、組織或器官與步驟(i)中的農(nóng)桿菌接觸，從而使所述甘油磷酸二酯酶的編碼基因轉(zhuǎn)入植物。
7.一種甘油磷酸二酯酶或其編碼基因的用途，用作鑒定植物的耐低磷環(huán)境能力的分子標(biāo)記物。
8.一種受低磷環(huán)境誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，其特征在于，所述的啟動(dòng)子選自下組 (1)如SEQID NO :I中第1-605位所示的核苷酸序列的多核苷酸； (2)在嚴(yán)格條件下能夠與(I)限定的多核苷酸序列雜交且具有誘導(dǎo)目的基因在低磷環(huán)境下表達(dá)的功能的多核苷酸；或 (3)與(I)限定的多核苷酸序列具有90%以上相同性且具有誘導(dǎo)目的基因在低磷環(huán)境下表達(dá)的功能的多核苷酸。
9.權(quán)利要求8所述的啟動(dòng)子的用途，其特征在于，所述的啟動(dòng)子用于誘導(dǎo)目的基因在低磷環(huán)境下表達(dá)。
10.一種構(gòu)建物，其特征在于，所述的構(gòu)建物含有權(quán)利要求8所述的受低磷環(huán)境誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。
11.如權(quán)利要求10所述的構(gòu)建物，其特征在于，所述的構(gòu)建物含有以下可操作性連接的元件 權(quán)利要求8所述的啟動(dòng)子；和 目的基因。
12.—種誘導(dǎo)目的基因在低磷環(huán)境下表達(dá)的方法，其特征在于，所述的方法包括將構(gòu)建物轉(zhuǎn)化植物，所述的構(gòu)建物含有權(quán)利要求8所述的受低磷環(huán)境誘導(dǎo)的啟動(dòng)子以及與所述的啟動(dòng)子可操作地連接的目的基因。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述方法包括 (a)提供攜帶表達(dá)載體的農(nóng)桿菌，所述表達(dá)載體中含有構(gòu)建物，所述的構(gòu)建物含有權(quán)利要求8所述的受低磷環(huán)境誘導(dǎo)的啟動(dòng)子以及與所述的啟動(dòng)子可操作地連接的目的基因； (b)將植物細(xì)胞、組織或器官與步驟(a)中的農(nóng)桿菌接觸，從而使所述的構(gòu)建物轉(zhuǎn)入植物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種耐低磷環(huán)境基因及其應(yīng)用。找到一種對(duì)于提高植物耐低磷環(huán)境的能力有用的基因——甘油磷酸二酯酶基因。所述基因可極好地應(yīng)用于植物品種的改良，提高植物對(duì)于逆境(低磷環(huán)境)的抵抗力。本發(fā)明為運(yùn)用轉(zhuǎn)基因等分子育種技術(shù)培育耐低磷生長(zhǎng)環(huán)境及磷高效循環(huán)利用的農(nóng)作物新品種，提供非常有價(jià)值的基因資源。
文檔編號(hào)C12N15/113GK102618516SQ20111003301
公開日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2011年1月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月31日
發(fā)明者程玉祥, 黃繼榮 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院