專利名稱：一種象耳豆根結(jié)線蟲lamp快速檢測(cè)方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種象耳豆根結(jié)線蟲LAMP快速檢測(cè)方法及應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
根結(jié)線蟲(Meloidogyne spp.)屬植物根系專性內(nèi)寄生物，是世界性分布的威脅農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要病原物和世界各國(guó)的植物檢疫對(duì)象。迄今已記載的根結(jié)線蟲有70余種，其中南方根結(jié)線蟲(M. incognita)、爪哇根結(jié)線蟲(M. javanica)和花生根結(jié)線蟲(M. arenaria) 因其廣分布性和多寄主性是最重要的種類。在我國(guó)，這三種根結(jié)線蟲在大多數(shù)省(區(qū))均有發(fā)生，侵染農(nóng)作物達(dá)百種以上，致使寄主常年減產(chǎn)15 25%，有時(shí)達(dá)70%以上(徐建華等.1994)，嚴(yán)重地制約了大棚蔬菜、 果樹、花卉等作物的生產(chǎn)和出口創(chuàng)匯。據(jù)估計(jì)，我國(guó)農(nóng)作物的生產(chǎn)每年因根結(jié)線蟲的為害而遭受的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)數(shù)億元以上。據(jù)調(diào)查研究，我國(guó)分布最廣泛、最常見的根結(jié)線蟲與世界各地類似，包括南方根結(jié)線蟲(M. incognita)、爪哇根結(jié)線蟲(M. javanica)、花生根結(jié)線蟲(M. arenaria)和北方根結(jié)線蟲(M. hap la) 0近年來，另一種根結(jié)線蟲-象耳豆根結(jié)線蟲(M. enterolobii)越來越受到人們的重視。該線蟲是1983年在我國(guó)海南省儋州市象耳豆樹上發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新種。根結(jié)線蟲的傳統(tǒng)鑒定方法主要根據(jù)形態(tài)學(xué)，主要是根據(jù)會(huì)陰花紋進(jìn)行鑒定，但由于不同地理種群之間存在較大的變異性導(dǎo)致有時(shí)結(jié)果不夠準(zhǔn)確。象耳豆根結(jié)線蟲部分會(huì)陰花紋形態(tài)與南方根結(jié)線蟲會(huì)陰花紋形態(tài)相似，僅根據(jù)該特征，有可能將象耳豆根結(jié)線蟲誤診。同時(shí)形態(tài)特征細(xì)微復(fù)雜，對(duì)專業(yè)知識(shí)要求高，鑒定過程耗時(shí)、費(fèi)力，且需要大量線蟲樣本，單頭線蟲不能鑒定到種。后來發(fā)展的同工酶技術(shù)雖然能快速準(zhǔn)確的鑒定不同的根結(jié)線蟲種類，它同樣需要有大量的雌蟲，因而不適用于多數(shù)情況下幼蟲和卵的檢測(cè)。由于形態(tài)學(xué)和同工酶技術(shù)的局限性，上世紀(jì)90年代起開始了根結(jié)線蟲分子鑒定的研究。目前針對(duì)根結(jié)線蟲的PCR診斷法主要基于核糖體DNA(rDNA)的ITS和IGS序列的 rDNA-PCR 法，基于 mtDNA 的 mtDNA-PCR-RFLP 法和基于 SCAR 的 SCAR-PCR 法。真核生物的rDNA在基因組內(nèi)是以串聯(lián)重復(fù)序列的形式出現(xiàn)，每一串聯(lián)重復(fù)序列包括 3 個(gè)編碼區(qū)(18SrRNA，5. 8SRNAJ8SRNA)和兩個(gè) ITSanternal Transcribed Spacers) 區(qū)，兩個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列之間各一段IGSantergenetic Spaces)區(qū)。ITS是由Gonzalez在 1990年提出隨后發(fā)展起來的全新分子標(biāo)記，其優(yōu)點(diǎn)在于拷貝數(shù)多，同時(shí)包含保守和變異序列，根據(jù)保守序列中的變異位點(diǎn)設(shè)計(jì)特殊引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增。Zijlstra 等(Zijlstra C. , Α. Ε. M. lever, B. J. Uenk, and C. H. Van Silfhout. Differences betweenlTS regions of islatoes of root-knot nematodes Meloidogyne hapla and M. chitwoodi[J], Phytopatholgy,1995,85 :1260 1268 ；Zijlstra Carolien. , A fast PCR assay to identifyMeloidogyne hapla, M. chitwoodi, and M. fallax, and to sensitively differentiate them from eachother and from M. incognita in mixtures[J]. Fundam. appl. Nematol.,1997,20 (5),505 ~ 511.)分析了 M. hapla, M. chitwoodi 和 M. fallax ITS 區(qū)的差異進(jìn)行了 ITS-PCR-RFLP 分析，發(fā)現(xiàn)用Aui I、DraI, HinfI可將二者分開，并且還能將二者與M. incognita和M. javanica 分開。Pertersen 等(Petersen, D. J. , Zi jlstra, C. , ffishart, J. , Blok, V. &Vrain, Τ.C. (1997). Specific probes efficientlydistinguish root-knot nematode species using signature sequence in the ribosomal intergeneticspacer. Fundamental and Applied Nematology 20，619-626.)根據(jù) IGS 區(qū)的差異，設(shè)計(jì)了 5 條 PCR 引物，應(yīng)用multiplex-PCR同時(shí)實(shí)現(xiàn)了對(duì)Μ. chitwoodi、Μ. fallax和Μ. hapla的鑒定，其靈敏度 ^IgU^J^TfC。 M胃 Powers · (Powers， T， 0. and C. Fleming 1998. Biochemical andmolecular characterization. In Perry, R. N. and D.J. Wright(edts)Free-living and Plant-parasiticnematodes. CABI Publishing 1998. Pp355-380)發(fā)現(xiàn) M. incognita、 M. javanica和Μ. arenaria ITS序列一致，Hugall等(1999)通過序列分析發(fā)現(xiàn)3種多倍體的主要根結(jié)線蟲(M. incognita,M. javanica和Μ. arenaria) ITS區(qū)遺傳變異較大，因此基于 rDNA的鑒別方法無法有效區(qū)分主要根結(jié)線蟲種群。隨機(jī)擴(kuò)增的 DNA 多態(tài)性技術(shù)(RAPD，Random Amplified Polymorphic DNA)是依賴一系列不同的隨機(jī)排列的寡核苷酸作為引物，對(duì)所研究的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析，經(jīng)EB染色檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性。Wiliamson等 (Williamson, V. Μ, Caswell-Chen, Ε. P.，B. B. Westerdahl, F. F. &G. Caryl. 1997. A PCR Assay to identify and distinguish singlejuveniles of Meloidogyne hapla and M. chitwoodi. Journal ofNematology, 29(1) :9-15.)通過對(duì) Μ· chitwoodi 禾口 Μ· hapla 基因組DNA的RAPD分析，篩選出具有Μ. hapla種鑒定特征的特異性片段，經(jīng)克隆測(cè)序后，設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，準(zhǔn)確鑒定了 M. hapla ；Zijlstra等(Zijlstra, C.，2000. Identificationof Meloidogyne chitwoodi,M. fallax and Μ. hapla based on SCAR-PCR a powerful way of enabling reliableidentification of populations orindividuals that share common traits. European Journal of Plant Pathology 106 :283-290.)
據(jù) Μ· incognita、Μ. javanica 和 Μ· arenaria 3 種根結(jié)線蟲的 RAPD 標(biāo)記，設(shè)計(jì)了 3 對(duì) SCAR 引物，快速、準(zhǔn)確的鑒定了這3種根結(jié)線蟲。以PCR為基礎(chǔ)的分子鑒定方法一定程度上克服了傳統(tǒng)形態(tài)鑒定上的缺陷。但PCR 檢測(cè)需要PCR儀、凝膠電泳和成像系統(tǒng)(紫外儀)等昂貴的專業(yè)儀器和分子生物學(xué)試劑，且需要分子生物學(xué)專業(yè)實(shí)驗(yàn)人員操作，以上檢測(cè)只能在實(shí)驗(yàn)室條件下才可以檢測(cè)，需要較長(zhǎng)的時(shí)間，限制了 PCR檢測(cè)方法在生產(chǎn)中的推廣應(yīng)用。循環(huán)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是日本學(xué)者Notomi (2000年)等人開發(fā)的一種新型循環(huán)恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)。反應(yīng)采用能特異識(shí)別靶序列上6個(gè)位點(diǎn)的4條引物及一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶(Bst DNA polymerase), 在等溫條件下。C (左右)可以高效(30min Ih)和特異的擴(kuò)增目標(biāo)DNA。在LAMP反應(yīng)過程中，從dNIPs中析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的鎂離子結(jié)合，能產(chǎn)生焦磷酸鎂沉淀物，出現(xiàn)渾濁沉淀，因此用肉眼就判定擴(kuò)增結(jié)果，也可通過向其擴(kuò)增產(chǎn)物中添加熒光染料通過變化來判定結(jié)果，也可通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行觀察可以看到梯形條帶，尤其適宜于基層的簡(jiǎn)潔快速檢測(cè)。LAMP反應(yīng)具有簡(jiǎn)單、快速、高效、經(jīng)濟(jì)等特征。因而具有極為廣泛的應(yīng)用前景
目前，LAMP在動(dòng)物疫病和食品安全方面廣泛應(yīng)用，國(guó)內(nèi)最早報(bào)道是在2002年北京奶牛中心運(yùn)用引進(jìn)的LAMP法進(jìn)行胚胎性別的檢測(cè)。2009年日本Kikuchi開發(fā)出松材線蟲 LAMP快速檢測(cè)體系，能在1小時(shí)內(nèi)檢測(cè)到松材線蟲。但在象爾豆根結(jié)線蟲上的尚無相關(guān)報(bào)道。本發(fā)明第一次采用LAMP技術(shù)檢測(cè)象耳豆根結(jié)線蟲。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是建立循環(huán)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)檢測(cè)象耳豆根結(jié)線蟲的LAMP快速檢測(cè)方法。同時(shí)提供該檢測(cè)方法所用的試劑盒。一種象耳豆根結(jié)線蟲LAMP快速檢測(cè)方法，其特征在于其中LAMP反應(yīng)體系所使用的引物是①M(fèi)EF3 5，-GGCTGTATATGTGGTGACAT-3，，②MEB3 5，-AGTTCGCAAAACTTATCGC-3，，③MEFIP 5 ’ -GAAAAAAAGAGTGCTGGCGTCCGTTAGGACTAAATGAGTTTAAGACT-3 ’，④MEBIP 5，-AACAAAATTCCTAGCCTTTCCGGAGTTTGCTGCGTTCTTCA-3，， MELB 5 ’ -TGGATCACTAGGCTCGTGGATCG-3 ’。
其中的LAMP反應(yīng)體系包括1)引物混合液夕卜弓I物MEF3禾口 MEB3各0. 2ymol/L，內(nèi)引物MEFIP和MEBIP各 1. 6 μ mol/L,環(huán)引物 MELB 為 0. 4 μ mol/L ；2)反應(yīng)混合液10mmol/L dNTP, 20mmol/L Tris-HCl (pH 8. 8), 10mmol/L KCl, 5mmol/L MgSO4, IOmmo 1/L (NH4) 2SO4,0. 1% Triton x-100，0. lmol/L 甜菜堿，8U Bst DNA 聚合酶大片段，3) 1 μ IDNA 模板；加滅菌雙蒸餾水補(bǔ)全到25 μ 1。其中LAMP反應(yīng)條件如下將引物混合液和反應(yīng)混合液混合均勻后加入1 μ 1 DNA 模板，61 65°C保溫 30 90min，82°C保溫 lOmin。其中LAMP反應(yīng)的最終產(chǎn)物中加入有顯色劑，輕甩離心管觀察。所述顯色劑為STOR green I與PCR級(jí)DMSO的混合物，其體積比為1 9。所述DNA模板的提取方法為挑取單頭象耳豆根結(jié)線蟲放入裝有10 μ IddH2O的 0. 2mL離心管中，加入8 μ 1的LB溶液，2 μ 1的20mg/ml蛋白酶K溶液，點(diǎn)動(dòng)離心后，放入液氮中，再放入37°C水浴鍋中，待融化后放入液氮中，重復(fù)6 7次，然后在-80°C下冷凍 30min ；然后將離心管在65°C下溫育90min，95°C反應(yīng)IOmin處理后上清液作為線蟲DNA模板直接用于 LAMP 和 PCR 反應(yīng)，所述 LB 溶液為 500mmol/L KCl, 10mmol/L Tris-HCl, 15mmol/ LMgCl2,1. Ommo 1/L DTT，4. 5% Tween20，等體積混勻，過濾滅菌。一種象耳豆根結(jié)線蟲LAMP快速檢測(cè)試劑盒，包括反應(yīng)混合液和引物混合液，所述引物混合液為外引物MEF3和MEB3各0. 2 μ mol/L,內(nèi)引物MEFIP和BIP各1. 6 μ mol/L, 環(huán)引物 MELB 為 0.4ymol/L，所述反應(yīng)混合液為 10mmol/L dNTP, 20mmo 1/L Tris-HCl (pH 8. 8), 10mmol/L KCl,5mmol/L MgSO4, lOmmol/L(NH4)2S04,0. 1 % Triton x-100,0. lmol/L betaine，和單獨(dú)包裝的8U Bst DNA聚合酶大片段，所述引物混合液中的引物序列分別為
① MEF3 5，-GGCTGTATATGTGGTGACAT-3，，②MEB3 5，-AGTTCGCAAAACTTATCGC-3，，③MEFIP 5 ’ -GAAAAAAAGAGTGCTGGCGTCCGTTAGGACTAAATGAGTTTAAGACT-3 ’，④MEBIP 5 ’ -AACAAAATTCCTAGCCTTTCCGGAGTTTGCTGCGTTCTTCA-3 ’， MELB 5 ’ -TGGATCACTAGGCTCGTGGATCG-3 ’。所述試劑盒還包括顯色劑，所述顯色劑為STOR green I與PCR級(jí)DMSO的混合物， 其體積比為1 9。所述試劑盒還包括DNA提取試劑，所述DNA提取試劑包括1)8μ 1的LB(Lysis Buffer)溶液500mmol/L KCl, 10mmol/L Tris-HCl, 15mmol/L MgCl2,1. Ommol/L DTT,4. 5% Tween20，等體積混勻，2)2μ 1的蛋白酶K :20mg/ml蛋白酶K。上述任一檢測(cè)方法或上述任一試劑盒在診斷植物、土壤的象耳豆根結(jié)線蟲感染情況或鑒別象耳豆根結(jié)線蟲中的應(yīng)用。本發(fā)明利用循環(huán)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)建立針對(duì)象耳豆根結(jié)線蟲的檢測(cè)方法。本方法具有多條引物的擴(kuò)增，并在兩端形成了帶有引物功能的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，這種多引物結(jié)合和可自產(chǎn)生引物的原理使其具有了靈敏度高、 特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，由于LAMP反應(yīng)操作步驟簡(jiǎn)單及反應(yīng)產(chǎn)物中包含大量核酸和焦磷酸鎂的沉淀，熒光劑顯色后可以用肉眼觀察判定反應(yīng)結(jié)果，適用于各種實(shí)驗(yàn)條件下檢測(cè)工作的使用，也適合在實(shí)驗(yàn)條件不足的室外檢測(cè)。本發(fā)明的方案具體實(shí)施步驟如下1.線蟲DNA提取試劑配制1)LB(Lysis Buffer)溶液500mmol/L KCl, 10mmol/L Tris-HCl, 15mmol/L MgCl2, 1. 0mmol/LDTT,4. 5% Tween20，等體積混勻，過濾滅菌。2)蛋白酶 K 20mg/ml 蛋白酶 K。2. DNA 的提取挑取單頭根結(jié)線蟲放入裝有10 μ IddH2O的0.2ml離心管中，加入8 μ 1的LB (lysis buffer)溶液，2 μ 1蛋白酶K溶液，點(diǎn)動(dòng)離心后，放入液氮中，再放入3°C水浴鍋中，待融后放入液氮中，重復(fù)6 7次，然后在_8°C下冷凍30min。然后將離心管取出，在6°C下溫育 90min, °C 9反應(yīng)IOmin處理后作為線蟲DNA模板直接用于LAMP和PCR反應(yīng)。3.象耳豆根結(jié)線蟲rDNA-ITS擴(kuò)增及序列分析采用ITS 區(qū)的通用引物 rDNAl (5，-TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3，)和 rDNA2(5，-T TTCACTCGCCGTTACTAAGG-3’ )擴(kuò)增兩種象耳豆根結(jié)線蟲種群ITS區(qū)片段。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為 50 μ 1，PCR 反應(yīng)體系為 10XBuffer (含 Mg2+) 5 μ 1，IOmM dNTP 4 μ 1，弓丨物 rDNAl 禾口 rDNA2 (10 μ mol/L)各 1 μ 1，Taq 酶(5U/ μ 1，Takara) 0· 5 μ 1，模板 DNA 5 μ 1，滅菌 ddH20 補(bǔ)足至50 μ 1。PCR擴(kuò)增條件為V 9預(yù)變性5min, V 5退火30sec，72°C延伸Imin ；9°C變性 45sec，"C 5退火30sec，7°C延伸lmin，;35個(gè)循環(huán)；7°C再次延伸10min，4°C保存。PCR擴(kuò)增后，取5 μ 1擴(kuò)增產(chǎn)物加1 μ 1加樣緩沖液在1. 5%瓊脂糖凝膠上電泳，EB染色，在紫外燈下觀測(cè)并照相回收、克隆和測(cè)序如SEQ ID Ν01，序列測(cè)定由上海生工生物工程有限公司完成。4.象耳豆根結(jié)線蟲LAMP引物設(shè)計(jì)根據(jù)象耳豆根結(jié)線蟲ITS測(cè)序結(jié)果為模板，設(shè)計(jì)以下5條引物，序列如下
① MEF3 5，-GGCTGTATATGTGGTGACAT-3，
② MEB3 5，-AGTTCGCAAAACTTATCGC-3，③MEFIP 5 ’ -GAAAAAAAGAGTGCTGGCGTCCGTTAGGACTAAATGAGTTTAAGACT-3 ’④MEBIP 5 ’ -AACAAAATTCCTAGCCTTTCCGGAGTTTGCTGCGTTCTTCA-3 ’(5) MELB :5，-TGGATCACTAGGCTCGTGGATCG-3’5. LAMP反應(yīng)體系配置外引物MEF3和MEB3各0. 2ymol/L,內(nèi)引物MEFIP和BIP 各 1.6ymol/L，環(huán)引物 MELB 為 0. 4ymol/L，10mmol/L dNTP, 20mmol/L Tris-HCl (pH 8.8)， 10mmol/LKCl,5mmol/L MgSO4,10mmol/L(NH4)2S04,0. 1% Triton x-100,0. lmol/L betaine, 8U BstDNA聚合酶大片段，1 μ 1 DNA模板，用滅菌雙蒸餾水補(bǔ)全到25 μ 1。6LAMP反應(yīng)擴(kuò)增條件將以上各成分(Bst DNA聚合酶先不加)加入反應(yīng)管中混合后，置于95°C反應(yīng)5min，然后冰浴;3min，加入1μ 1的Bst DNA聚合酶，然后置于65°C恒溫水浴中等溫?cái)U(kuò)增60min，再82°C保溫5min，反應(yīng)結(jié)束后加入2 μ 1配制好的顯色劑混勻后觀察結(jié)果。7LAMP結(jié)果檢測(cè)結(jié)果可以采用以下三種檢測(cè)方法1)將上述反應(yīng)完的體系中加入2μ1的顯色劑。輕晃混勻，即可觀察；幻取2 μ 1擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠電泳中電泳可觀察到梯形帶；3)將反應(yīng)后的離心管3000rpm離心30sec，陽(yáng)性的管底可觀察到白色沉淀。本發(fā)明所提供的象耳豆根結(jié)線蟲LAMP快速檢測(cè)方法具有以下優(yōu)點(diǎn)一、靈敏度高，對(duì)象耳豆根結(jié)線蟲的檢測(cè)極限可達(dá)到1/200000條幼蟲水平，比常規(guī)PCR檢測(cè)象耳豆根結(jié)線蟲的檢測(cè)靈敏度高100倍。二、特異性強(qiáng)，所用的特異引物根據(jù)象耳豆根結(jié)線蟲的ITS六個(gè)不同區(qū)域設(shè)計(jì)出5 條引物，特異性比常規(guī)PCR要強(qiáng)。三、檢測(cè)時(shí)間短，1小時(shí)左右可獲得檢測(cè)結(jié)果，比常規(guī)PCR檢測(cè)縮短2 4h。四、不需要PCR儀，對(duì)儀器設(shè)備要求低，不需要任何PCR儀、凝膠電泳和成像系統(tǒng)， 只需要一個(gè)水浴鍋或者保溫瓶就可以完成檢測(cè)。五、操作簡(jiǎn)單、結(jié)果明顯，整個(gè)檢測(cè)過程不涉及復(fù)雜儀器和設(shè)備，一般技術(shù)人員即可完成檢測(cè)，結(jié)果容易辨別，通過不同顏色，肉眼即可觀察結(jié)果，不需要繁瑣的電泳和紫外觀察。六、對(duì)人和環(huán)境友好，檢測(cè)過程不需要使用EB等有毒試劑，對(duì)人和環(huán)境非常安全。綜上所述，本發(fā)明具有比現(xiàn)有PCR技術(shù)檢測(cè)象耳豆根結(jié)線蟲的方法具有更高的特異性、靈敏度和便攜性?？梢栽趯?shí)際生產(chǎn)中現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用檢測(cè)。該技術(shù)可應(yīng)用于對(duì)象耳豆根結(jié)線蟲田間土壤樣品及植物上象耳豆根結(jié)線蟲病發(fā)生的早期快速分子檢測(cè)，具有實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值。


圖1為象耳豆根結(jié)線蟲ITS序列的LAMP引物設(shè)計(jì)示意圖，圖2為象耳豆根結(jié)線蟲LAMP方法檢測(cè)A為加熒光染料檢測(cè)結(jié)果，1 陽(yáng)性結(jié)果，具有綠色熒光，2 陰性對(duì)照，為深褐色。B檢測(cè)結(jié)果為電泳圖，M :D2000DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量(Takara) 1 陽(yáng)性結(jié)果，為L(zhǎng)AMP擴(kuò)增梯形條帶，2 陰性對(duì)照，無擴(kuò)增產(chǎn)物。圖3為象耳豆根結(jié)線蟲LAMP檢測(cè)方法對(duì)不同地理種群的檢測(cè)結(jié)果圖，A為加熒光染料檢測(cè)結(jié)果，1 =MEXED, 2 =MEDT, 3 陰性對(duì)照。B 為電泳檢測(cè)結(jié)果，M :D2000DNA 標(biāo)準(zhǔn)分子量(Takara)，1 =MEXED, 2 =MEDT, 3 陰性對(duì)照，圖4為象耳豆根結(jié)線蟲LAMP檢測(cè)方法特異性檢測(cè)結(jié)果圖A為L(zhǎng)AMP加熒光染料檢測(cè)結(jié)果圖，1 13分別為MEXED、MIDX、MHYJ、MJYN、MAYN、 RSAM、、PLD、GS-14、GS-11、DdCL、BD 和陰性對(duì)照。B為L(zhǎng)AMP檢測(cè)結(jié)果電泳圖，M :D2000DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量(Takara)，1 13分別為 MEXED, MIDX、MHYJ, MJYN、MAYN、RSAM、、PLD、GS-14、GS-IUDdCL, BD 和陰性對(duì)照。圖5為象耳豆根結(jié)線蟲靈敏度檢測(cè)結(jié)果A為L(zhǎng)AMP加熒光染料檢測(cè)結(jié)果圖，1 7分別為單頭線蟲，10—1、10_2、10_3、10_4、 10_5和陰性對(duì)照。B為L(zhǎng)AMP檢測(cè)結(jié)果電泳圖，M :D2000DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量(Takara)，1 7分別為單頭線蟲，10—1、10_2、10_3、10_4、10_5 和陰性對(duì)照。C為普通PCR法檢測(cè)結(jié)果電泳圖，M :D2000DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量(Takara)，1 7分別為單頭線蟲，10人10_2、10_3、10_4、10_5、陰性對(duì)照。
具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。所述試劑均為市售，所用根結(jié)線蟲本申請(qǐng)人實(shí)驗(yàn)室均有保存，可以免費(fèi)向公眾發(fā)放。實(shí)驗(yàn)材料共收集2個(gè)象耳豆根結(jié)線蟲種群(DT和XED)(見表1)。表1供試象耳豆根結(jié)線蟲種群及其來源
樣品代號(hào) Code群體種類 Species采樣地點(diǎn) Originof population寄主植物 Hosts樣品來源 ProviderMEDTMeloidogyne enterolobii海南Hainan象耳豆本實(shí)驗(yàn)室采集MEXEDMeloidogyne enterolobii海南Hainan光棍樹本實(shí)驗(yàn)室采集主要試劑Taq DNA聚合酶購(gòu)自天根公司；DNAmarker購(gòu)自TaKaRa公司；引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成；pGEM-T Easy Vector購(gòu)于美國(guó)promega Pro K(蛋白酶K) 購(gòu)自Roche公司；Bst DNA聚合酶大片段購(gòu)自New England Biolabs公司；SYBR green I購(gòu)自 Invitrogen 公司。實(shí)施例1象耳豆根結(jié)線蟲DNA的提取、rDNA-ITS擴(kuò)增及序列分析1. 1象耳豆根結(jié)線蟲DNA的提取挑取單頭根結(jié)線蟲放入裝有10 μ IddH2O的0.2ml離心管中，加入8 μ 1的LB (lysis buffer)溶液，2 μ 1蛋白酶K溶液，點(diǎn)動(dòng)離心后，放入液氮中，再放入3°C水浴鍋中，待融后放入液氮中，重復(fù)6 7次，然后在_8°C下冷凍30min。然后將離心管取出，在6°C下溫育 90min, °C 9反應(yīng)IOmin處理后作為線蟲DNA模板直接用于LAMP和PCR反應(yīng)。1. 2象耳豆根結(jié)線蟲rDNA-ITS擴(kuò)增及序列分析利用ITS 區(qū)的通用弓丨物 rDNAl (5，-TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3，)和 rDNA2 (5，-T TTCACTCGCCGTTACTAAGG-3’ )擴(kuò)增兩種象耳豆根結(jié)線蟲種群ITS區(qū)片段。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為 50 μ 1，PCR 反應(yīng)體系為 10XBuffer (含 Mg2+) 5 μ 1，IOmM dNTP 4 μ 1，弓丨物 rDNAl 禾口 rDNA2 (10 μ mol/L)各 1 μ 1，Taq 酶(5U/ μ 1，Takara) 0· 5 μ 1，模板 DNA 5 μ 1，滅菌 ddH20 補(bǔ)足至50 μ 1。PCR擴(kuò)增條件為V 9預(yù)變性5min，V 5退火30sec，7°C延伸Imin ；9°C變性 45sec，"C 5退火30sec，7°C延伸lmin，;35個(gè)循環(huán)；7°C再次延伸10min，4°C保存。PCR擴(kuò)增后，取5 μ 1擴(kuò)增產(chǎn)物加1 μ 1加樣緩沖液在1. 5%瓊脂糖凝膠上電泳，EB染色，在紫外燈下觀測(cè)并照相回收、克隆和測(cè)序如SEQ ID NOl所示，序列測(cè)定由上海生工生物工程有限公司完成。實(shí)施例2LAMP技術(shù)檢測(cè)象耳豆根結(jié)線蟲方法的建立2. ILAMP 引物設(shè)計(jì)根據(jù)象耳豆根結(jié)線蟲ITS序列測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)并篩選下述LAMP引物，引物交上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列如下①M(fèi)F3 5 ’ -GGCTGTATATGTGGTGACAT-3 ’②MB3 5 ’ -AGTTCGCAAAACTTATCGC-3 ’③MFIP 5，-GAAAAAAAGAGTGCTGGCGTCCGTTAGGACTAAATGAGTTT-AAGACT-3，④MBIP 5，-AACAAAATTCCTAGCCTTTCCGGAGTTTGCTGCGTTCTTCA-3，(5) MELB :5，-TGGATCACTAGGCTCGTGGATCG-3’2. 2LAMP反應(yīng)體系配置弓I物混合液外引物MEF3和MEB3各0. 2 μ mol/L,內(nèi)引物MEFIP和MEBIP各 1. 6ymol/L，環(huán)引物 MELB 為 0. 4 μ mol/L,反應(yīng)混合液10mmol/LdNTP,20mmol/L Tris-HCl(pH 8.8),10mmol/L KCl, 5mmol/LMgSO4, IOmmol/L(NH4)2SO4jO. 1% Triton χ-100,0. lmol/L betaine，8U Bst DNA 聚合酶大片段，1 μ 1 DNA模板，用滅菌雙蒸餾水補(bǔ)全到25 μ 1。2. 3LAMP反應(yīng)擴(kuò)增條件將以上各成分(Bst DNA聚合酶先不加)加入反應(yīng)管中混合后，置于95°C反應(yīng)5min，然后冰浴;3min，加入1μ 1的Bst DNA聚合酶，然后置于65°C恒溫水浴中等溫?cái)U(kuò)增60min，再82°C保溫5min，反應(yīng)結(jié)束后加入2 μ 1配制好的顯色劑混勻后觀察結(jié)果(如圖2中的A所示)。取2 μ 1產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上電泳，EB染色，在紫外燈下觀測(cè)并照相(如圖2中的B所示)，可看到有LAMP的特征性梯形帶。實(shí)施例3LAMP法檢測(cè)不同地理種群象耳豆根結(jié)線蟲將本實(shí)驗(yàn)室采集的兩種象耳豆根結(jié)線蟲進(jìn)行LAMP檢測(cè)，將上述的引物混合液和反應(yīng)混合液混合均勻后，加入1 μ 1模板DNA，按2. 3的反應(yīng)條件進(jìn)行，反應(yīng)結(jié)束后加入2 μ 1 配制好的顯色劑混勻后，觀察顏色變化(如圖3中的A所示)，加有象耳豆根結(jié)線蟲DNA的管中能看到綠色熒光，陰性對(duì)照則為紅褐色。取2 μ 1產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上電泳，EB染色，在紫外燈下觀測(cè)并照相(如圖3中的B所示)，可看到1 2泳道有LAMP的特征性梯形帶，陰性對(duì)照沒有發(fā)現(xiàn)有擴(kuò)增產(chǎn)物。
實(shí)施例4象耳豆根結(jié)線蟲LAMP特異性檢測(cè)收集南方根結(jié)線蟲、北方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲、花生根結(jié)線蟲、香蕉穿孔線蟲、 短體線蟲、甘薯莖線蟲、大豆孢囊線蟲、禾谷孢囊線蟲、豆傘滑刃線蟲(見表2)，分別提取其 DNA作為模板與象耳豆根結(jié)線蟲DNA模板一起進(jìn)行LAMP檢測(cè)，以檢測(cè)象耳豆根結(jié)線蟲LAMP 檢測(cè)方法的特異性。表2供試的其它植物線蟲群體樣品代碼及來源
權(quán)利要求
1.一種象耳豆根結(jié)線蟲LAMP快速檢測(cè)方法，其特征在于其中LAMP反應(yīng)體系所使用的引物是①M(fèi)EF3 :5’ -GGCTGTATATGTGGTGACAT-3’，②MEB3 :5’ -AGTTCGCAAAACTTATCGC-3’，③MEFIP :5’ -GAAAAAAAGAGTGCTGGCGTCCGTTAGGACTAAATGAGTTTAAGACT-3’，@ MEBIP :5’ -AACAAAATTCCTAGCCTTTCCGGAGTTTGCTGCGTTCTTCA-3’，(5)MELB :5’ -TGGATCACTAGGCTCGTGGATCG-3’
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于其中的LAMP反應(yīng)體系包括1)引物混合液外引物MEF3和MEB3各0.2 μ mol/L,內(nèi)引物MEFIP和MEBIP各 1. 6ymol/L，環(huán)引物 MELB 為 0. 4 μ mol/L ；2)反應(yīng)混合液1Ommol/L dNTP, 20mmol/L Tris-HCl (pH 8. 8), 10mmol/L KCl,5mmol/L MgSO4,10mmol/L (NH4)2SO4jO. 1% Triton χ-100，0. lmol/L 甜菜堿，8U Bst DNA 聚合酶大片段；3)1 μ 1 DNA 模板；加滅菌雙蒸餾水補(bǔ)全到25 μ 1。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)方法，其中LAMP反應(yīng)條件如下將引物混合液和反應(yīng)混合液混合均勻后加入1 μ 1 DNA模板后，61 65°C溫育30 90min，82°C保溫lOmin。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)方法，其中LAMP反應(yīng)的最終產(chǎn)物中加入有顯色劑，輕甩離心管觀察即可。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)方法，所述顯色劑為STORgreen I與PCR級(jí)DMSO的混合物，其體積比為1 9。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)方法，所述DNA模板的提取方法為挑取單頭象耳豆根結(jié)線蟲放入裝有 ομ 1 ddH20的0. 2mL離心管中，加入8μ 1的LB溶液，2μ 1的20mg/ml蛋白酶K溶液，點(diǎn)動(dòng)離心后，放入液氮中，再放入37°C水浴鍋中，待融化后放入液氮中，重復(fù)6 7次，然后在-80°C下冷凍30min。然后將離心管在65°C下溫育90min，95°C反應(yīng)IOmin處理后上清液作為線蟲DNA模板直接用于LAMP和PCR反應(yīng)，所述LB溶液為500mmol/L KCl， IOmmol/L Tris-HCl，15mmol/L MgCl2,1. 0mmol/L DTT，4· 5% Tween20，等體積混勻，過濾滅菌。
7.一種象耳豆根結(jié)線蟲LAMP快速檢測(cè)試劑盒，包括反應(yīng)混合液和引物混合液，所述引物混合液為外引物MEF3和MEB3各0. 2 μ mol/L,內(nèi)引物MEFIP和BIP各1. 6 μ mol/L,環(huán)引物 MELB 為 0.4 μ mol/L，所述反應(yīng)混合液為 10mmol/L dNTP, 20mmol/L Tris-HCl (pH8. 8), 10mmol/L KCl,5mmol/L MgSO4, lOmmol/L(NH4)2S04,0. 1% Triton χ-100,0. lmol/L betaine 和單獨(dú)包裝的8U Bst DNA聚合酶大片段，所述引物混合液中的引物序列分別為①M(fèi)EF3 :5’ -GGCTGTATATGTGGTGACAT-3’，②MEB3 :5’ -AGTTCGCAAAACTTATCGC-3’，③MEFIP :5’ -GAAAAAAAGAGTGCTGGCGTCCGTTAGGACTAAATGAGTTTAAGACT-3’，@ MEBIP :5’ -AACAAAATTCCTAGCCTTTCCGGAGTTTGCTGCGTTCTTCA-3’，(5) MELB :5’ -TGGATCACTAGGCTCGTGGATCG-3，。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，還包括顯色劑，所述顯色劑為STORgreen I與PCR級(jí)DMSO的混合物，其體積比為1 9。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的試劑盒，還包括DNA提取試劑，所述DNA提取試劑包括 1)LB 溶液500mmol/L KCl,10mmol/L Tris-HCl,15mmol/L MgCl2,1. Ommol/L DTT,4. 5% Tween20,等體積混勻，2) 20mg/ml蛋白酶K。
10.權(quán)利要求1-6所述任一檢測(cè)方法或7-9所述任一試劑盒在診斷植物、土壤的象耳豆根結(jié)線蟲感染情況或鑒別象耳豆根結(jié)線蟲中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及“一種象耳豆根結(jié)線蟲LAMP快速檢測(cè)方法及應(yīng)用”。根據(jù)克隆測(cè)序的象耳豆根結(jié)線蟲ITS序列，在其序列保守區(qū)域設(shè)計(jì)了5條LAMP引物MEF3、MEB3、MEFIP、MEBIP和MELB；并配制了LAMP反應(yīng)體系。通過對(duì)象耳豆根結(jié)線蟲DNA提取，象耳豆根結(jié)線蟲等溫?cái)U(kuò)增、擴(kuò)增產(chǎn)物顯色檢測(cè)，從而快速檢測(cè)出象耳豆根結(jié)線蟲。本發(fā)明的檢測(cè)方法特異性強(qiáng)、靈敏度高、成本低廉、操作簡(jiǎn)便，在象耳豆根結(jié)線蟲現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)和象耳豆根結(jié)線蟲病的早期診斷方面具有很高的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102174650SQ201110034960
公開日2011年9月7日 申請(qǐng)日期2011年2月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月9日
發(fā)明者何旭峰, 彭德良, 彭煥 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所