專利名稱：用于檢測水稻白葉枯病菌的引物、方法以及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于檢測水稻白葉枯病菌的引物、方法以及試劑盒，具體涉及一種用于檢測水稻白葉枯病菌強(qiáng)毒菌株GD414的引物、方法以及試劑盒。
背景技術(shù)：
按照在一套水稻近等基因系上的反應(yīng)型，可以將中國水稻白葉枯病菌劃分成9個(gè)標(biāo)準(zhǔn)生理小種，其中GD414是R3號小種的典型代表，是我國發(fā)現(xiàn)的一株水稻白葉枯病菌強(qiáng)毒菌株。因?yàn)楦魉酒贩N對各水稻白葉枯病菌小種的抗性不一樣，因此鑒定各地區(qū)的流行小種對水稻種植品種的選擇將具有指導(dǎo)意義。GD414作為一個(gè)典型小種的代表，在中國南方稻區(qū)經(jīng)常作為優(yōu)勢小種出現(xiàn)，因此鑒定GD414將具有更重要的意義和作用。傳統(tǒng)的鑒定方法是通過菌株在6個(gè)水稻近等基因系材料上的抗病反應(yīng)模型來判斷，這種方法需時(shí)較長，工作繁瑣且精確度較低。分子水平鑒定方法比傳統(tǒng)的寄主反應(yīng)方法更簡單、快速，并且節(jié)約空間和勞動(dòng)力。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測水稻白葉枯病菌強(qiáng)毒菌株GD414的引物、方法以及試劑盒，利用所述引物、方法以及試劑盒能夠準(zhǔn)確、簡便、迅速地將GD414與其它白葉枯病菌菌株區(qū)分開來，從而為水稻種植品種的選擇提供必要的指導(dǎo)。用于實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下一種用于檢測水稻白葉枯病菌菌株GD414的引物，該引物的上游引物核苷酸序列為SEQ ID NO :4，下游引物核苷酸序列為SEQ ID NO :3。一種用于檢測水稻白葉枯病菌菌株⑶414的方法，該方法包括以下步驟(I)挑取待測菌株菌落或提取待測菌株基因組DNA作為PCR擴(kuò)增模板，采用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(2)對PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。在上述方法中，挑取待測菌株菌落作為PCR擴(kuò)增模板時(shí)，PCR擴(kuò)增的條件為94°C下變性5分鐘；94°C下變性30秒，58 °C下退火30秒，72 °C下延伸I分鐘，30-35個(gè)循環(huán)；72°C延伸10分鐘。在上述方法中，提取待測菌株基因組DNA作為PCR擴(kuò)增模板時(shí)，PCR擴(kuò)增的條件為94°C下變性3分鐘；94°C下變性30秒，58 °C下退火30秒，72 °C下延伸I分鐘，30-35個(gè)循環(huán)；72°C延伸10分鐘。PCR反應(yīng)體系為20 μ I反應(yīng)體系，包括10XPCR緩沖液2 μ L，dNTP(各2. 5mM)lyL，引物(10 μ Μ)各I μ L，Taq酶1U，待測菌株基因組DNA 10ng，補(bǔ)ddH20至反應(yīng)總體積為20yL。其中10XPCR緩沖液成分如下200mMTris-HCl(pH 8. 4), 200mM KCl,IOOmM(NH4)2SO4,15mM MgCl20在上述方法中，瓊脂糖凝膠的濃度為O. 8-2% (g/ml)，瓊脂糖凝膠電泳的電壓為4-6v/cm,水稻白葉枯病菌菌株⑶414的瓊脂糖凝膠電泳特異性條帶出現(xiàn)在985bp處。一種用于檢測水稻白葉枯病菌菌株GD414的試劑盒，該試劑盒包含上述引物。優(yōu)選地，所述試劑盒還包括Taq酶，dNTP，10XPCR緩沖液。其中10XPCR緩沖液成分如下200mM Tris-HCKpH 8. 4), 200mM KCl, IOOmM(NH4)2SO4,15mM MgCl20本發(fā)明利用生物信息和生物學(xué)知識，通過一系列實(shí)驗(yàn)篩選，發(fā)現(xiàn)了⑶414菌株基因組所具有的與其它白葉枯病菌菌株所不同的特異性位點(diǎn)，并利用這一特異位點(diǎn)設(shè)計(jì)并篩選出相應(yīng)的引物、PCR檢測方法以及相應(yīng)的檢測試劑盒，從而將GD414與其它白葉枯病菌菌株準(zhǔn)確、簡便、迅速地區(qū)分開來。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用瓊脂糖凝膠電泳分析時(shí)，水稻白葉枯病菌菌株GD414的特異性條帶出現(xiàn)在985bp處，非常易于辨認(rèn)區(qū)分，表明上述引物、方法以及試劑盒明顯更有利于水稻白葉枯病菌菌株GD414鑒定。


以下，結(jié)合附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施方案，其中圖I顯示實(shí)施例I中采用初始引物對水稻白葉枯病菌標(biāo)準(zhǔn)生理小種菌株多態(tài)性的檢測結(jié)果；圖2顯示實(shí)施例I中采用⑶414(4)引物對水稻白葉枯病菌標(biāo)準(zhǔn)生理小種菌株檢測的結(jié)果；圖3顯示實(shí)施例I中采用GD414(5)引物，即本發(fā)明的特異性引物對水稻白葉枯病菌標(biāo)準(zhǔn)生理小種菌株檢測的結(jié)果；圖4a_d顯示實(shí)施例2中采用本發(fā)明的特異性引物對大批量水稻白葉枯病菌菌株(Xoo)檢測的結(jié)果，其中菌株名分別如下
權(quán)利要求
1.一種用于檢測水稻白葉枯病菌菌株GD414的引物，該引物的上游引物核苷酸序列為SEQ ID NO :4，下游引物核苷酸序列為SEQ ID NO :3。
2.一種用于檢測水稻白葉枯病菌菌株GD414的方法，該方法包括以下步驟 (1)挑取待測菌株菌落或提取待測菌株基因組DNA作為PCR擴(kuò)增模板，采用根據(jù)權(quán)利要求I所述的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增； (2)對PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為20Ul反應(yīng)體系，包括10XPCR 緩沖液 2iiL，dNTP(各 2. 5mM)liiL，引物(IOuM)各 I y L，Taq 酶 1U，待測菌株基因組DNA IOng,補(bǔ)ddH20至反應(yīng)總體積為20 u L。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法挑取待測菌株菌落作為PCR擴(kuò)增模板，PCR擴(kuò)增的條件為94°C下變性5分鐘；94°C下變性30秒，58°C下退火30秒，72°C下延伸I分鐘，30-35個(gè)循環(huán)；72°C延伸10分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法提取待測菌株基因組DNA作為PCR擴(kuò)增模板，PCR擴(kuò)增的條件為94°C下變性3分鐘；94°C下變性30秒，58°C下退火30秒，72°C下延伸I分鐘，30-35個(gè)循環(huán)；72°C延伸10分鐘。
6.根據(jù)權(quán)利要求2至5中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述瓊脂糖凝膠的濃度為0.8-2% (g/mL)。
7.根據(jù)權(quán)利要求2至6中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述瓊脂糖凝膠電泳的電壓為 4_6v/cm0
8.根據(jù)權(quán)利要求2至6中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述水稻白葉枯病菌菌株⑶414的瓊脂糖凝膠電泳特異性條帶出現(xiàn)在985bp處。
9.一種用于檢測水稻白葉枯病菌菌株GD414的試劑盒，該試劑盒包含根據(jù)權(quán)利要求I所述的引物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括Taq酶、dNTP和10XPCR緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于檢測水稻白葉枯病菌菌株的引物、方法以及試劑盒，該引物的上游引物核苷酸序列為SEQ ID NO4，下游引物核苷酸序列為SEQ ID NO3。該方法包括以下步驟(1)挑取待測菌株菌落或提取待測菌株基因組DNA作為PCR擴(kuò)增模板，采用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(2)對PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。該試劑盒包含上述引物。利用所述引物、方法以及試劑盒能夠準(zhǔn)確、簡便、迅速地將GD414與其它白葉枯病菌菌株區(qū)分開來，從而為水稻種植品種的選擇提供必要的指導(dǎo)。
文檔編號C12N15/11GK102618628SQ20111003541
公開日2012年8月1日 申請日期2011年2月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月1日
發(fā)明者何晨陽, 吳茂森, 李波, 陳華民 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所