專利名稱：中國荷斯坦奶牛lhcgr基因作為分子標(biāo)記的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及家畜具有突變位點(diǎn)的基因作為分子標(biāo)記的應(yīng)用，尤其涉及中國荷斯坦奶牛LHCGR基因作為分子標(biāo)記在選育超數(shù)排卵奶牛中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前，在奶牛育種中的傳統(tǒng)選擇方法大多是基于個(gè)體的表型記錄值，通過分析個(gè)體本身及其親屬的表型數(shù)據(jù)去評(píng)估該個(gè)體在某個(gè)性狀上所具有的遺傳優(yōu)勢(shì)。最近在對(duì)中國荷斯坦奶牛超數(shù)排卵性狀進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇的研究中分別有Ke-Qiong Tang等 (2010)和mi-CaiYang等Q010)把基因INHA和FSHR作為超數(shù)排卵性狀的分子標(biāo)記。由于傳統(tǒng)的選擇方法要等到個(gè)體生長到性成熟或之后才能獲得超數(shù)排卵的數(shù)據(jù)， 這樣世代間隔較長，遺傳育種的選擇速度也就較慢。超數(shù)排卵是一個(gè)數(shù)量性狀，它除了受環(huán)境影響外，主要由多個(gè)基因控制，篩選出越多的相關(guān)基因越有利于選擇的準(zhǔn)確度和提高選擇強(qiáng)度，但現(xiàn)在報(bào)道的僅有基因FSHR和 INHA兩個(gè)基因的突變與之相關(guān)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種中國荷斯坦奶牛LHCGR基因作為分子標(biāo)記的應(yīng)用。中國荷斯坦奶牛 LHCGR基因存在 Reference SNP Cluster R印ort :rs41256848 位點(diǎn)，當(dāng)該位點(diǎn)純合為“G”時(shí)，表現(xiàn)出超數(shù)排卵的優(yōu)勢(shì)。以此作為分子標(biāo)記用于中國荷斯坦奶牛的輔助育種。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種選育超數(shù)排卵的中國荷斯坦奶牛的方法。本發(fā)明所提供的選育超數(shù)排卵的中國荷斯坦奶牛的方法，是檢測待測中國荷斯坦奶牛LHCGR基因Reference SNP Cluster R印ort :rs41256848位點(diǎn)，確定待測中國荷斯坦奶牛LHCGR基因?yàn)镚T、GG或TT型，以LHCGR基因?yàn)镚G型的中國荷斯坦奶牛進(jìn)行育種，獲得較好超數(shù)排卵性狀的中國荷斯坦奶牛；所述GG型為LHCGR基因ReferenceSNP Cluster Report :rs41256848 位點(diǎn)是純合 G ；所述 TT 型為 LHCGR 基因 Reference SNP Cluster Report :rs41256848 位點(diǎn)是純合 T ；所述 GT 型為 LHCGR 基因 Reference SNP Cluster Report :rs41256848 位點(diǎn)是雜合 T/G。本發(fā)明選育超數(shù)排卵的中國荷斯坦奶牛的方法，可以通過提取中國荷斯坦奶?；蚪M DNA，克隆 LHCGR 基因或包含 LHCGR 基因 Reference SNP Cluster Report :rs41256848 位點(diǎn)的部分片段，然后對(duì)該LHCGR基因或所述部分片段進(jìn)行單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測或進(jìn)行測序?qū)崿F(xiàn)。上述部分片段是以中國荷斯坦奶牛基因組DNA為模板，SEQ IDNo. 1和2所示的DNA 分子為引物對(duì)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得的。上述單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)檢測中，LHCGR基因GG型為凝膠電泳顯示有兩條帶， LHCGR基因TT型為凝膠電泳顯示有兩條帶，LHCGR基因GG型的兩條帶在電泳過程中泳動(dòng)速度小于LHCGR基因TT型的兩條帶；LHCGR基因TG型為凝膠電泳顯示有四條帶。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種選育超數(shù)排卵的中國荷斯坦奶牛的引物對(duì)及專用試齊U盒。本發(fā)明選育超數(shù)排卵的中國荷斯坦奶牛的引物對(duì)的核苷酸序列如SEQ ID No. 1和 2所示。本發(fā)明的選育超數(shù)排卵的中國荷斯坦奶牛的專用試劑盒，含有上述的引物對(duì)。除了上述引物對(duì)外，該試劑盒還可以含有進(jìn)行PCR所需要的試劑，該試劑包括Taq DNA聚合酶、dNTP、PCR緩沖液、變性溶液等。本發(fā)明通過對(duì)中國荷斯坦奶牛LHCGR基因進(jìn)行分型，并將該分型與超數(shù)排卵性狀進(jìn)行相關(guān)性分析，確定中國荷斯坦奶牛超數(shù)排卵相關(guān)基因LHCGR基因可以作為分子標(biāo)記選育出超數(shù)排卵的中國荷斯坦奶牛。本發(fā)明以分子標(biāo)記輔助選擇進(jìn)行育種，可縮短世代間隔， 提高育種進(jìn)程。另外還可結(jié)合與奶牛超數(shù)排卵性狀相關(guān)的其他分子標(biāo)記位點(diǎn)，使得對(duì)奶牛選擇更加精確。


圖1不同個(gè)體PCR產(chǎn)物SSCP分析結(jié)果。圖2三種基因型測序圖譜。圖2中A、B、C分別代表GT、GG、TT三種帶型的測序圖譜。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1用基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)從牛血液中提取奶?；蚪M DNA。奶牛LHCGR基因部分片段克隆(1)引物設(shè)計(jì)以?；蚪MDNA(NCBI中g(shù)ene數(shù)據(jù)庫ID :281900)為模板，利用 Primer 5. 0設(shè)計(jì)特異性引物1對(duì)正向引物為5，-GCTCTACCTGCTGCTCAT-3，，反向引物為5，-TAATTGCTGACACCCACA-3，。O)PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件PCR反應(yīng)總體系為20μ 1，其中正、反向引物各ΙΟρΜ， dNTP為4μΜ，10 X PCR緩沖液(Mg2+plus) 2 μ 1，0. 5單位的Taq DNA聚合酶(寶生物工程有限公司)，基因組DNA50ng。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性5min，然后35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括 95°C變性30s，57°C退火30s，72°C延伸30s，最后循環(huán)外72°C延伸5min。PCR產(chǎn)物(297bp) 用瓊脂糖凝膠電泳檢測。對(duì)擴(kuò)增的片段進(jìn)行SSCP分型3μ1的PCR產(chǎn)物與8μ 1變性溶液(95%甲酰胺，25mM EDTA，0. 025 % 二甲苯青和0.025 %溴酚藍(lán))混合，然后在PCR儀上98 °C孵育lOmin，立刻放到冰上獲得變性的DNA。變性的DNA進(jìn)行13 %聚丙烯酰胺凝膠電泳 (PAGE)8-10h(120V)。凝膠用0. 1 %硝酸銀進(jìn)行染色。對(duì)不同帶型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。對(duì)SSCP結(jié)果中不同帶型的DNA進(jìn)行測序及數(shù)據(jù)庫比對(duì)。
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分析北京奶牛中心4個(gè)良種場共114頭荷斯坦小母牛的LHCGR突變與超數(shù)排卵性狀之間的關(guān)系，用PASW Statistic 18中的一般線性模型(GLM)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。研究發(fā)現(xiàn)在該群體中擴(kuò)增的LHCGR片段進(jìn)行SSCP分型后共有三種帶型(參見圖 1)，分別命名為GG (有兩條帶)、TT (有兩條帶)、TG (有四條帶)，GG型的兩條帶在電泳過程中泳動(dòng)速度小于TT型的兩條帶。對(duì)三種帶型的PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行測序(參見圖幻，圖2 中A、B、C分別為GT、GG、TT三種帶型的測序圖譜。GG帶型LHCGR基因自5 ‘末端第62551 位的核苷酸殘基為G的純合體；TT帶型LHCGR基因自5'末端第62551位的核苷酸殘基為T的純合體；GT帶型LHCGR基因自5'末端第62551位的核苷酸殘基為T/G的雜合體。 把測序結(jié)果和NCBI中SNP數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)為已知突變位點(diǎn)(Reference SNP Cluster Report :rs41256848)。因此該SNP位點(diǎn)優(yōu)勢(shì)等位基因G可作為奶牛超數(shù)排卵性狀的分子標(biāo)記。對(duì)這三種帶型在群體中的分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并和超數(shù)排卵性狀進(jìn)行相關(guān)性分析見表 1。表1.三種基因型在群體中的個(gè)體數(shù)及與超數(shù)排卵性狀之間的關(guān)系
GG(17)GT(56)TT(41)P value
TNO10.989±1.517a10.287±0.889a7.036±1.057b0.020NTE6.615±1.020a4.262±0.686c3.246±0.836c0.008NUO1.518±0.8263.445±0.5552.479±0.6770.046
NDE2.175±0.8662.086±0.5821.434±0.7100.557表1中a，b，c同行數(shù)據(jù)標(biāo)有不同字母者差異顯著(ρ < 0. 05)。TNO 獲得總卵數(shù)； NTE 可移植胚胎數(shù)；NUO 未受精卵數(shù)；NDE 變性胚胎數(shù)。綜上所述，GG基因型個(gè)體在獲得總卵數(shù)方面顯著高于TT基因型個(gè)體，在可移植胚胎數(shù)方面顯著高于GT和TT基因型個(gè)體。通過SSCP檢測對(duì)奶?；蚪MLHCGR基因分型，選擇GG基因型個(gè)體可選育出超數(shù)排卵的奶牛個(gè)體。另外可結(jié)合與奶牛超數(shù)排卵性狀相關(guān)的其他分子標(biāo)記位點(diǎn)，使得對(duì)奶牛選擇更加精確，作為奶牛超數(shù)排卵的分子標(biāo)記輔助選擇比傳統(tǒng)的遺傳選擇可加大選擇強(qiáng)度，縮短世代間隔，提高育種進(jìn)程。
權(quán)利要求
1.中國荷斯坦奶牛LHCGR基因作為分子標(biāo)記在選育超數(shù)排卵奶牛中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述LHCGR基因存在ReferenceSNP Cluster Report :rs41256848位點(diǎn)，該SNP位點(diǎn)純合體為G時(shí)表現(xiàn)出超數(shù)排卵的優(yōu)勢(shì)。
3.選育超數(shù)排卵的中國荷斯坦奶牛的方法，是檢測待測中國荷斯坦奶牛LHCGR基因 Reference SNP Cluster Report :rs41256848位點(diǎn)，確定待測中國荷斯坦奶牛LHCGR基因?yàn)?GT、GG或TT型，以LHCGR基因?yàn)镚G型的中國荷斯坦奶牛進(jìn)行育種，獲得較好超數(shù)排卵性狀的中國荷斯坦奶牛；所述 GG 型為 LHCGR 基因 Reference SNP ClusterReport :rs41256848 位點(diǎn)是純合 G ；所述 TT 型為 LHCGR 基因 ReferenceSNP Cluster Report :rs41256848 位點(diǎn)是純合 T ；所述 GT 型為 LHCGR 基因 Reference SNP Cluster Report :rs41256848 位點(diǎn)是雜合 T/G。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于包括如下步驟提取中國荷斯坦奶?；蚪M DNA，克隆 LHCGR 基因或包含 LHCGR 基因 Reference SNP Cluster Report :rs41256848 位點(diǎn)的部分片段，然后對(duì)該LHCGR基因或所述部分片段進(jìn)行單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測或進(jìn)行測序。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述部分片段是以中國荷斯坦奶?；蚪M DNA為模板，SEQ ID No. 1和2所示的DNA分子為引物對(duì)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得的。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測中，LHCGR基因 GG型為凝膠電泳顯示有兩條帶，LHCGR基因TT型為凝膠電泳顯示有兩條帶，所述LHCGR基因GG型的兩條帶在電泳過程中泳動(dòng)速度小于所述LHCGR基因TT型的兩條帶；LHCGR基因 TG型為凝膠電泳顯示有四條帶。
7.選育超數(shù)排卵的中國荷斯坦奶牛的引物對(duì)，其特征在于其核苷酸序列如SEQID No. 1和2所示。
8.選育超數(shù)排卵的中國荷斯坦奶牛的專用試劑盒，其特征在于含有權(quán)利要求7所述的引物對(duì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種中國荷斯坦奶牛LHCGR基因作為分子標(biāo)記的應(yīng)用。中國荷斯坦奶牛LHCGR基因存在Reference SNP ClusterReportrs41256848位點(diǎn)，當(dāng)該位點(diǎn)純合為“G”時(shí)，表現(xiàn)出超數(shù)排卵的優(yōu)勢(shì)。以此作為分子標(biāo)記用于中國荷斯坦奶牛的輔助育種，可縮短世代間隔，提高育種進(jìn)程。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102168136SQ20111003635
公開日2011年8月31日 申請(qǐng)日期2011年2月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月11日
發(fā)明者于勇, 田見暉 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)