專利名稱：Dna片段及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種DNA片段及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
我國是一個人口和農(nóng)業(yè)大國，但是隨著人口的日益增多，僅靠簡單的農(nóng)業(yè)種植模式是無法保障足夠的糧食產(chǎn)量以滿足社會需求的，生物技術(shù)才是可持續(xù)農(nóng)業(yè)最重要的途徑。傳統(tǒng)的農(nóng)作物育種依靠雜交育種，目前智能不育分子設(shè)計育種技術(shù)也正在不斷完善， 但是，不論是傳統(tǒng)方法還是現(xiàn)代技術(shù)，雄性不育系的建立在植物育種中都發(fā)揮著重要作用。 花藥作為重要的雄性生殖器官，它的發(fā)育分為兩部分，一部分是花藥的形態(tài)建成，另一部分是花粉的形成與發(fā)育，花藥的正常與否將直接影響植物的雄性育性。植物花粉發(fā)育是一個非常復(fù)雜的過程，它由個體發(fā)育的不同階段所表達的特定基因所控制(Stinson et al., 1987 ；Mascarenhas, 1989，1990)。研究表明玉米的成熟花粉中含有兩萬多種mRNA分子，其中的 10%具有花粉特異性(Willing andMascarenhas, 1984 ；Schrauwen et al.，1990)。已有多種花粉特異基因被分離出來，例如油菜中的三個花粉發(fā)育早期基因(Albani et al., 1990)。目前研究較為深入的是玉米中的ZM-13 (Hanson et al.，1989)和番茄中的LAT-52 基因(Twell et al.，1989b)，ZM-13在小孢子發(fā)育晚期表達，而LAT-52在四分體時期開始表達并在小孢子發(fā)生時期表達量迅速增加。水稻是世界上重要的糧食作物，水稻的雜交優(yōu)勢育種具有悠久的歷史，雄性不育育種的出現(xiàn)，極大地簡化了育種程序，節(jié)省勞力，解決了其他育種不容易解決的問題，利用雄性不育制種，不僅可提高制種的質(zhì)量，其產(chǎn)量也得到了很大的提高。但傳統(tǒng)的不育系、恢復(fù)系和保持系的選育需要大量的雜交組合試驗，具有盲目性且費時費力。花粉或花藥特異啟動子在植物雄性不育育種中具有重要應(yīng)用價值。Mariani等(1990年)將煙草花藥絨氈層特異表達基因！“四的啟動子與RNAase基因構(gòu)建嵌合基因，導(dǎo)入煙草和油菜中，獲得雄性不育轉(zhuǎn)基因植株，從而開創(chuàng)了利用植物基因工程技術(shù)獲得雄性不育轉(zhuǎn)基因植株的新途徑。 1992年，Mariani等又把煙草花藥絨氈層特異表達基因D9的啟動子與RNAase抑制劑基因 barstar構(gòu)建嵌合基因，轉(zhuǎn)化油菜獲得油菜雄性不育恢復(fù)系，與含RNAase基因的轉(zhuǎn)基因雄性不育系雜交后獲得可育后代。我們的研究通過分子生物學(xué)的手段完成了對水稻花藥中特異表達啟動子的調(diào)控元件的鑒定工作，并證明了它們的時空表達模式，明確了其在花粉發(fā)育特異時期的表達，從而在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上為遺傳育種的相關(guān)基礎(chǔ)與應(yīng)用研究提供一定的理論和實踐指導(dǎo)作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種DNA片段。本發(fā)明提供的 DNA 片段是從水稻(0. sativa ssp. Japonica variety iZhonghua 11’)基因組分離得到的核苷酸片段并且具有啟動子活性。本發(fā)明中的術(shù)語“啟動子”系指 DNA上一段序列，RNA聚合酶結(jié)合到該序列上，可以起始基因的轉(zhuǎn)錄。
所述DNA片段的核苷酸序列是如下1)或2)或3):1)序列表中序列1所示的核苷酸序列；2)在高嚴謹條件下與所述1)的核苷酸序列雜交且具有啟動子活性的核苷酸序列；3)與所述1)的核苷酸序列具有70%以上的同源性且具有啟動子活性的核苷酸序列。所述高嚴謹條件是指，將雜交膜置于預(yù)雜交液(0.25mol/L磷酸鈉緩沖液， pH7. 2,7% SDS)中，65°C預(yù)雜交30min ；棄預(yù)雜交液，加入雜交液(0. 25mol/L磷酸鈉緩沖液，pH7.2,7% SDS，同位素標記的核苷酸片段)，65°C雜交12hr ；棄雜交液，加入洗膜液I (20mmol/L磷酸鈉緩沖液，ρΗ7· 2,5% SDS)，65°C洗膜2次，每次30min ；加入洗膜液 II (20mmol/L 磷酸鈉緩沖液，ρΗ7· 2,1% SDS)，65°C洗膜 30min。本發(fā)明的DNA片段還包括與來自SEQ ID NO. 1的片段的核苷酸序列互補的核苷酸序列。這里使用的術(shù)語“互補的”系指遵循堿基配對原則產(chǎn)生的之意。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進化和點突變的方法，對本發(fā)明的啟動子核苷酸序列進行突變。那些經(jīng)過人工修飾的，具有與本發(fā)明分離得到的啟動子核苷酸序列70%或者更高同源性的核苷酸，只要保持了表達靶基因的啟動子活性，均是衍生于本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。這里使用的術(shù)語“同源性”指與天然核酸序列的序列相似性?！巴葱浴卑ㄅc本發(fā)明的啟動子核苷酸序列具有優(yōu)選地75%或更高，更優(yōu)選地85%或更高，甚至更優(yōu)選地90% 或更高，以及最優(yōu)選地95%或更高同一性的核苷酸序列。同源性可以用肉眼或計算機軟件進行評價。使用計算機軟件，兩個或多個序列之間的同源性可以用百分比(％ )表示，其可以用來評價相關(guān)序列之間的同源性。含有上述DNA片段的重組載體也屬于本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。上述重組載體是將上述的DNA片段代替pCAMBIA1301載體中⑶S基因的3 啟動子后得到的重組載體。含有上述DNA片段的轉(zhuǎn)基因細胞系也屬于本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。含有上述DNA片段的重組菌也屬于本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。上述重組菌可以是含有上述DNA片段的農(nóng)桿菌。本發(fā)明的另一目的在于提供上述的DNA片段作為啟動子的應(yīng)用。上述啟動子可為花粉組織特異性表達啟動子。優(yōu)選可為水稻花粉組織特異性表達啟動子。本發(fā)明的又一目的在于提供上述的DNA片段在構(gòu)建水稻智能兩系育種中的應(yīng)用。實驗證明本發(fā)明的DNA片段作為啟動子能夠特異地驅(qū)動下游GUS基因從單核晚期花粉中開始表達，直至花粉完全成熟。利用本發(fā)明的DNA片段作為啟動子可以構(gòu)建不育系和恢復(fù)系基因，從而構(gòu)建水稻智能兩系育種。其次，本發(fā)明的DNA片段作為花粉特異表達啟動子可為水稻及其它農(nóng)作物花粉生長發(fā)育基因的功能分析及表達調(diào)控研究提供了一個有力的工具，可以配合使用該組啟動子連接花粉發(fā)育功能基因，分析其表達量、表達時期與表型的關(guān)系，從而探明花粉特異基因的功能。此外，本發(fā)明的DNA片段作為啟動子還為水稻等轉(zhuǎn)基因食品的安全性研究和開發(fā)創(chuàng)造了有利條件，在預(yù)防轉(zhuǎn)基因植物通過授粉途徑發(fā)生基因漂移和延長花卉的貨架壽命等方面都具有重大的應(yīng)用前景。


圖1為PCR擴增的凝膠電泳結(jié)果。圖2為⑶S載體的構(gòu)建過程。圖3為水稻花粉的發(fā)育過程，A、造胞細胞，B、花粉母細胞，C、四分體，D、單核早期， E、單核晚期，F(xiàn)、雙核早期，G、雙核中期，H、雙核晚期，I、未成熟三核時期，J、DAPI染色未成熟三核時期花粉，K、成熟三核時期，L、DAPI染色成熟三核時期花粉。圖4為水稻花粉特異性表達啟動子驅(qū)動GUS表達檢測結(jié)果，A、花粉母細胞時期小花，B、四分體時期小花，C、單核早期小花，D、單核晚期小花，E、雙核早期小花，F(xiàn)、雙核中期小花，G、雙核晚期小花，H、成熟三核時期小花，I、單核晚期花粉粒，J、雙核時期花粉，K、成熟三核時期花粉粒。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，但本發(fā)明并不限于以下實施例。下述實施例中，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。實施例1、水稻花粉特異性表達啟動子的獲得及其檢測分析我們采用RACE方法從水稻cDNA庫克隆到了一個花藥基因，為了檢測它的表達模式，我們分別用RT-PCR和原位雜交的方法進行分析。RT-PCR檢測分別以水稻根、莖、內(nèi)外稃及雌蕊、種子、穗子、花藥和花粉為材料提取RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用特異引物進行 RT-PCR分析，結(jié)果顯示這個基因特異的在雄蕊尤其是花粉中表達。原位雜交分析將不同發(fā)育時期的水稻花藥取材后經(jīng)過脫水透明等處理后，最終將其包埋到石蠟中。然后將蠟塊中的材料切成8μπι厚的蠟片，再經(jīng)脫蠟、復(fù)水、除蛋白等前處理后，用基因特異區(qū)段的RNA 探針進行雜交，最后經(jīng)顯色檢測基因的組織表達特性。結(jié)果如顯示，這個基因在花藥絨氈層和花粉粒中均表達。上述兩種方法均證明該基因在水稻花粉粒中特異表達，我們利用突變體和RNAi 的方法對這個基因的功能研究也證明它的確對水稻花藥的發(fā)育和花粉粒的育性起著至關(guān)重要的作用(待發(fā)表)。由于基因的時空表達模式是受基因上游的啟動子區(qū)域所調(diào)控的，因此，在研究基因功能的同時也有必要對它們的啟動子序列及表達特征進行分析。一、水稻花粉特異性表達啟動子序列的獲得根據(jù)水稻中目的基因的cDNA序列，選取轉(zhuǎn)錄起始位點上游2000bp左右的DNA序列為能夠行使調(diào)控功能的完整啟動子區(qū)域(基本啟動子和5’ UTR區(qū)域)， 在NCBI (http://www.ncbi. nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)庫中查找各啟動子的電子序列。然后根據(jù)各啟動子序列設(shè)計特異引物(PF =GAC CCCGGG GGAACTCACCGGCTAGCCATC和PR =CAG TCTAGAGGCGGAGGCAGAATCCCCTCT，引物中所加的酶切位點為上游引物Sam I (GAC CCCGGG)， 下游引物 Xba I (CAG TCTAGA))，以水稻(0. sativa ssp. Japonica variety iZhonghuall', 購自中國農(nóng)科院作物科學(xué)研究所)基因組DNA為模板，，用ExTaq酶進行PCR擴增，由PCR擴增的凝膠電泳結(jié)果(如圖1所示)可知得到1991bp的目的片段。擴增產(chǎn)物經(jīng)切膠純化后連接到T-easy載體上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5ci，篩選陽性克隆，進行PCR、酶切、測序鑒定。測序結(jié)果表明其具有序列表中序列1的自5’端的第1-1991的堿基，命名為I^romoter。二、水稻花粉特異性表達啟動子的檢測分析1、啟動子驅(qū)動⑶S的時空表達特征(1)克隆載體的構(gòu)建對pCAMBIA1301 (購自Cambia公司)進行改造，以Hind III和Nco I進行雙酶切 PCAMBIA1301載體，回收大片段，以Klenow酶補平粘性末端，得到兩平末端，用T4連接酶將兩平末端連接，即將母載體PCAMBIA1301 (Cornejo et al.，1993)改建為pGUS1301。然后分別用)(ba I和Sma I雙酶切ρ⑶S1301載體，再用T4連接酶連接經(jīng)相同酶切(即用)(ba I和Sma I雙酶切)后的上述步驟一中擴增得到的啟動子(Promoter)，得到構(gòu)建成的載體， 命名為P::GUS載體。載體構(gòu)建過程如圖2所示。(2)水稻的遺傳轉(zhuǎn)化利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的雙元載體系統(tǒng)對水稻進行遺傳轉(zhuǎn)化，將上述步驟(1)中構(gòu)建好的P:⑶S載體導(dǎo)入EHA105農(nóng)桿菌工程菌株，然后按照已有的成熟方法進行轉(zhuǎn)化(Hieiet al. ,1994 ；Huang et al. ,2000)開展水稻的遺傳轉(zhuǎn)化工作，對轉(zhuǎn)化后的植株進行鑒定，得到轉(zhuǎn)基因陽性植株。(3)⑶S染色鑒定對上述步驟O)中轉(zhuǎn)化成功的各轉(zhuǎn)基因株系(轉(zhuǎn)基因陽性植株)進行分子鑒定， 然后將陽性轉(zhuǎn)基因苗進行GUS染色分析，染色后的花、花藥和花粉在解剖鏡和體式顯微鏡下照相。為了詳細研究基因的表達模式，對水稻花粉發(fā)育時期進行了詳細的劃分(如圖3 所示)，圖中可見花粉發(fā)育各個時期的形態(tài)，A為造胞細胞，B為花粉母細胞，C為四分體，D 為單核早期，E為單核晚期，F(xiàn)為雙核早期，G為雙核中期，H為雙核晚期，I為未成熟三核時期，J為DAPI染色未成熟三核時期花粉，K為成熟三核時期，L為DAPI染色成熟三核時期花粉。進行GUS染色，檢測結(jié)果(如圖4所示)顯示，從圖4中D(單核晚期小花)開始顯色，到圖4中E (雙核早期小花)、F(雙核中期小花)、G(雙核晚期小花)和H(成熟三核時期小花)均為藍色。由圖4中I (單核晚期花粉粒)、J(雙核時期花粉)和K(三核時期花粉粒)中的花粉粒均顯示為明顯的藍色，更進一步確認了 GUS染色結(jié)果。通過上述GUS 染色檢測結(jié)果可知本實施例得到的啟動子能夠特異地驅(qū)動下游GUS基因從單核晚期花粉中開始表達，直至花粉完全成熟。
權(quán)利要求
1.一種DNA片段，其核苷酸序列是如下1)或2)或3):1)序列表中序列1所示的核苷酸序列；2)在高嚴謹條件下與所述1)的核苷酸序列雜交且具有啟動子活性的核苷酸序列；3)與所述1)的核苷酸序列具有70%以上的同源性且具有啟動子活性的核苷酸序列。
2.含有權(quán)利要求1所述的DNA片段的重組載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組載體，其特征在于所述重組載體是將權(quán)利要求1所述的DNA片段代替pCAMBIA1301載體中⑶S基因的3 啟動子后得到的重組載體。
4.含有權(quán)利要求1所述的DNA片段的轉(zhuǎn)基因細胞系。
5.含有權(quán)利要求1所述的DNA片段的重組菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組菌，其特征在于所述重組菌是含有權(quán)利要求1所述DNA 片段的農(nóng)桿菌。
7.權(quán)利要求1所述的DNA片段作為啟動子的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述啟動子為花粉組織特異性表達啟動
全文摘要
本發(fā)明公開了DNA片段及其應(yīng)用。本發(fā)明的DNA片段，其核苷酸序列是如下1)或2)或3)1)序列表中序列1所示的核苷酸序列；2)在高嚴謹條件下與所述1)的核苷酸序列雜交且具有啟動子活性的核苷酸序列；3)與所述1)的核苷酸序列具有70％以上的同源性且具有啟動子活性的核苷酸序列。實驗證明本發(fā)明的DNA片段作為啟動子能夠特異地驅(qū)動下游GUS基因從單核晚期花粉中開始表達，直至花粉完全成熟。
文檔編號C12N5/10GK102199601SQ20111003897
公開日2011年9月28日 申請日期2011年2月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月16日
發(fā)明者劉源, 吳鳳, 孟征, 杜曉秋, 閆碩 申請人:中國科學(xué)院植物研究所