專利名稱：一種微泡菌bs03的培養(yǎng)基及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及微生物培養(yǎng)基，特別涉及一種微泡菌BS03的培養(yǎng)基及其制備方法。
背景技術：
近年來，由于沿岸水域嚴重污染和富營養(yǎng)化，赤潮發(fā)生頻率急劇增加，規(guī)模不斷擴大，新的赤潮藻種不斷出現，有毒赤潮藻種比例上升，危害的區(qū)域面積也越來越大，目前已在美國、日本、中國、加拿大、法國、瑞典、挪威、菲律賓、印度、印度尼西亞、馬來西亞、韓國、 香港等30多個國家和地區(qū)頻繁發(fā)生。降低水體富營養(yǎng)化程度，尋求有效的赤潮及其毒素污染防治途徑勢在必行，赤潮防治成為當前國內外急需解決的難題。目前，藻類的控制技術可歸納為3種，即物理方法、化學方法和生物方法。物理方法主要是通過添加絮凝劑或粘土等使藻細胞絮凝沉淀；化學方法是指向水華水體中加入一些化學殺藻劑如硫酸銅等殺滅藻細胞，這兩種方法成本均較高，可選擇性差，處理過程中會連同一些有益生物一起殺死，在殺死藻細胞同時還會導致細胞內毒素的突然釋放，對環(huán)境存在二次污染等種種局限性。生物方法主要是指利用生物之間的相互生態(tài)關系，在特定水體中建立控制因子-宿主的動態(tài)平衡體系，以防止藻類污染的發(fā)生或治理已發(fā)生的藻類污染的一種方法。目前，國內外對水華和赤潮的爆發(fā)和消亡的生物學機理的研究也剛起步，其中的溶藻細菌作為對有害赤潮的生物防治更是國內外研究的熱點。溶藻細菌(algicidal bacteria)是一類以直接或間接方式抑制藻類生長，或殺死藻類、溶解藻細胞的細菌的統(tǒng)稱。當前，國內外對溶藻細菌的研究尚處于初步階段，對于細菌溶藻活性代謝產物的研究也是剛剛開始。殺藻細菌中見諸報道最多的是倚靠釋放胞外物質殺藻，而分泌胞外物質的多少通常與細胞密度的高低相關聯(lián)，優(yōu)化培養(yǎng)基則是一種提高細胞密度的有效方法。為了獲取一定量的殺藻物質用于后續(xù)活性物質的有效分離及殺藻機制的研究工作的展開，細菌培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的優(yōu)化工作就顯得尤為重要。培養(yǎng)基是人為提供給微生物生長的最重要的培養(yǎng)環(huán)境，是影響微生物生長增殖和代謝產物合成的重要因素。影響微生物生長過程的因素有很多，主要包括培養(yǎng)基(成分、濃度)以及培養(yǎng)條件(溫度，PH值，轉速，接種量，通氧量)等。由于發(fā)酵培養(yǎng)基成分眾多，且各因素常存在交互作用，因此培養(yǎng)基優(yōu)化工作量大且復雜。數學統(tǒng)計學中的多種優(yōu)化方法已開始廣泛應用于微生物培養(yǎng)基的優(yōu)化工作，其中比較常用的實驗方法有單因素法、正交實驗設計法、均勻設計法、全因子實驗設計法和響應面設計法等方法。傳統(tǒng)的優(yōu)化方法如單因素法優(yōu)化培養(yǎng)基一次只能考慮一個因子水平的影響，工作量大，需要多次的實驗和較長的試驗周期，也無法顯示各因素之間的相互作用關系。因此， 結合單因素法和現有數學統(tǒng)計法的新型培養(yǎng)基優(yōu)化法已受到越來越多的應用。均勻設計法是我國數學家方開泰和王元創(chuàng)造的一種多因素優(yōu)化法(1、方開泰，王元.均勻設計與均勻設計表[M].北京科學出版社，1994，21-2 。該方法將數論的原理和多元統(tǒng)計相結合，近幾年來在微生物培養(yǎng)基的優(yōu)化方面已取得不少成功的例子。均勻設計的基本思路就是盡量使實驗點充分均勻分散，使每個試驗點具有更好的代表性，但同時舍棄整齊可比的要求，以減少試驗次數；然后通過多元統(tǒng)計方法來彌補這一缺陷，使試驗結論同樣可靠。因此均勻設計法是一種考慮試驗點在試驗范圍內充分均勻散布的試驗設計方法，在試驗數相同的條件下，均勻設計的偏差遠比正交設計小。由于均勻設計不再考慮正交試驗的整齊可比性，因此其試驗結果用逐步回歸法進行二次回歸擬合，最后根據擬合方程用單因素輪換法可求出各因素的最佳值。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種可高效培養(yǎng)微泡菌BS03、并顯著提高其細胞密度和殺藻活性物質產量的微泡菌BS03的培養(yǎng)基。本發(fā)明的另一目的在于提供一種微泡菌BS03的培養(yǎng)基的制備方法。所述微泡菌BS03已于2010年9月3日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏中心保藏編號為CCTCC NO =M 2010218，中國典型培養(yǎng)物保藏中心的地址為中國武漢，武漢大學。所述微泡菌BS03的培養(yǎng)基的組成是在IL的蒸餾水中含有蛋白胨1 20g/L，蔗糖 1 1如/1。所述微泡菌BS03的培養(yǎng)基的組成最好是在IL的蒸餾水中含有蛋白胨10. 50g，蔗糖8g。所述微泡菌BS03的培養(yǎng)基的制備方法為將胰蛋白胨、蔗糖加入蒸餾水中定容至1L，滅菌后即得微泡菌BS03的培養(yǎng)基。所述滅菌，可采用高壓滅菌，所述高壓滅菌的條件可為12rC，20min。本發(fā)明首先以2216E培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，采用單因素法探索優(yōu)化培養(yǎng)條件，即控制其他條件不變，對PH、鹽度、無機鹽分別選取不同梯度和類型進行實驗，考察其對菌體生長和殺藻活性物質產量的影響，找出主要影響因素進行均勻設計。由于培養(yǎng)基優(yōu)化是一項量大且復雜的工作，本發(fā)明中首先選擇幾種復合營養(yǎng)源，即那些既可以作為碳源又可以作為氮源的營養(yǎng)物質(如蛋白胨、酵母粉)，然后在它們的基礎上添加不同微量成分，考察各成分對菌體生長和殺藻效率的影響。最終選擇蛋白胨、蔗糖、培養(yǎng)時間、PH值、接種量為重要影響因子，利用均勻設計法，以菌液濁度、菌體干重和半致死濃度(LD50)為評價指標，進行5因素15水平的混合均勻設計，再利用DPS7. 0軟件對實驗值進行二次多項式回歸分析， 最后建立回歸模型。優(yōu)化后的培養(yǎng)基組分為蛋白胨10. 50g/L，蔗糖8g/L，培養(yǎng)時間32h， 接種量3. 00%、初始？!1值7.5。


圖1為本發(fā)明實施例中不同培養(yǎng)基對微泡菌BS03生長和殺藻效率的影響圖。在圖1中，橫坐標為培養(yǎng)基，從左到右依次為PYS培養(yǎng)基、LBK培養(yǎng)基、2216E培養(yǎng)基、BK培養(yǎng)基、B培養(yǎng)基、A培養(yǎng)基，右縱坐標為波長在600nm下的光密度值0D_，左縱坐標為半致死率 LD50(% )；柱狀圖為為半致死率LD5tl，折線圖為0D6(i(i。圖2為本發(fā)明實施例中不同碳源對微泡菌BS03生長和殺藻效率的影響圖。在圖2中，橫坐標為碳源，從左到右依次為葡萄糖(Glucose)、麥芽糖(Maltose)、可溶性淀粉 (Solublestarch)、蔗糖(Cane sugar)、乳糖(Lactobiose)，左縱坐標為半致死率LD5tl)，
4右縱坐標為波長在600nm下的光密度值0D_，柱狀圖為為半致死率LD5tl，折線圖為0D_。圖3為本發(fā)明實施例中不同氮源對微泡菌BS03生長和殺藻效率的影響圖。在圖 3中，橫坐標為氮源，從左到右依次為大豆蛋白胨(Soya P印tone)、蛋白胨(P印tone)、牛肉膏(Beefextract)、ΚΝ03、酵母粉(Yeast Powder)、NaN03，左縱坐標為半致死率 LD5tl(%)，右縱坐標為波長在600nm下的光密度值0D_，柱狀圖為為半致死率LD5tl，折線圖為0D_。圖4為本發(fā)明實施例中不同氮源對微泡菌BS03生長和殺藻效率的影響圖。在圖 4中，橫坐標為無機鹽，從左到右依次為NaN03、KBr、i^S04、CaCl2、K2HP04,，左縱坐標為半致死率LD5tl )，右縱坐標為波長在600nm下的光密度值0D_，柱狀圖為為半致死率LD5tl，折線圖為 OD6tltl。圖5為本發(fā)明實施例中不同氮源對微泡菌BS03生長和殺藻效率的影響圖。在圖 5中，橫坐標為pH值，從左到右依次為5 9，，左縱坐標為半致死率LD5tl )，右縱坐標為波長在600nm下的光密度值0D_，柱狀圖為為半致死率LD5tl，折線圖為0D_。
具體實施例方式以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，但本發(fā)明不限于下述實施例。菌種微泡菌BS03由廈門大學應用與環(huán)境微生物研究所分離保藏，初步鑒定為微泡菌屬(Microbulbifer sp.)，已于2010年9月3日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏中心保藏編號為CCTCC NO :M2010218o藻種Alexandrium tamarense (AT)無菌株，藻種系由暨南大學水生生物研究所提供，經本申請人無菌藻技術除菌得到的塔瑪亞歷山大藻無菌株。藻類所用培養(yǎng)液為f/2培養(yǎng)液。藻類置于室內三角瓶中培養(yǎng)，溫度為20士 1°C，光照條件為1 光照，1 黑暗。初始培養(yǎng)基Q216E)蛋白胨(P印tone) 5g，酵母提取物(Yeast Extract) lg，磷酸高鐵O. Ig,瓊脂粉IOg (固體培養(yǎng)基)，pH7. 0 7. 2，陳海水定容到1L。濁度測定法取適當原液或是稀釋的菌體發(fā)酵液，以空培養(yǎng)基做對照，在波長 600nm下測定光密度(OD)值。細胞干重(DCW)吸取發(fā)酵液10ml，8000r/min離心lOmin，棄去上清后用去離子水洗滌菌體3次，80°C恒溫烘至恒重，稱重計算DCW(g/L)。LD50 取發(fā)酵培養(yǎng)后的無菌細胞濾液，按照0. 5%U. 0%U. 5%三種不同濃度添加入測試藻類中，作用24h后用盧戈氏液固定，在光學顯微鏡下計數。應用藍宙LD5tl軟件，計算半數致死劑量(LD5tl)。實施例1采用2216E為基礎培養(yǎng)基，進行單因素法優(yōu)化培養(yǎng)條件的探索。溫度的影響分別設定培養(yǎng)溫度為20、25、28、30和35°C，ρΗ7· 0 7. 2，1 %接種量，250ml三角搖瓶裝液量為50ml，180r/min搖床培養(yǎng)24h后，取菌液測定OD6tltl和LD5(1。轉速的影響分別設定搖床震蕩速度為120、150、180和210r/min，其余條件與上述相同，培養(yǎng)24h后取發(fā)酵液測定0D_和LD5Q。初始pH的影響分別選用2. 0mol/l的HCl與2. 0mol/l的NaOH調培養(yǎng)基的pH為 5. 0,6. 0,7. 0,8. 0 和 9. 0，溫度 28°C，1 %接種量，250ml 三角搖瓶裝液量為 50ml, 180r/min 搖床培養(yǎng)24h后，取菌液測定0D_和LD5Q。
鹽度的影響用人工海水分別設定培養(yǎng)基的鹽度為10、20、30、40和50%。，初始 pH7. 0 7. 2，溫度，1 %接種量，250ml三角搖瓶裝液量為50ml，180r/min搖床培養(yǎng)24h 后，，然后取發(fā)酵液測定0D600和LD5tl。實驗結果顯示溫度在微生物生長過程中對于菌株的生物量和活性代謝產物的分泌起著重要的作用，該BS03菌株在20 30°C間菌細胞密度隨著溫度的升高而增大，當溫度大于30°C時，菌密度有所下降。溫度改變過程中，菌體生長和殺藻物質的產生規(guī)律是一致的?？紤]到節(jié)省能源故選擇為培養(yǎng)條件。微生物培養(yǎng)過程中轉速的改變直接影響的就是微生物的溶氧量，過高或過低的的溶氧速率都不利于菌體生長，在轉速為180r/min 時，該BS03菌株生物量和LD5tl分別為1. 726，0. 648，該值為適宜菌體生長和產活性物質的搖床轉速。PH在微生物生長過程中影響較大，該菌在pH為5. 0 8. 0的培養(yǎng)條件下，其生物量隨著PH值的升高而增大，而LD5tl在pH值為7. 0時最低，即此時菌體產活性物質的能力最強。當PH值大于8. 0和小于6. 0時菌體的生物量和產活性物的能力都受限制。故該菌最適合在中性偏堿性條件下生長。鹽度對于海洋微生物的生長增值有著重要意義，由結果可知，BS03生長及其殺藻活性物質的產生都受到鹽濃度變化的顯著影響。當培養(yǎng)基鹽度為 10%。時，菌體生長緩慢，產溶藻活性物質的能力低，此時LD5tl為4. 105。隨著鹽度增加菌體生長迅速，溶藻活性物質分泌能力也明顯增強。當鹽度大于30%。，該菌的殺藻率雖有略微增加，但菌體生長明顯減慢。因此30%。的是適合微泡菌BS03的鹽度范圍。故此，BS03的最佳培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度為^°C，適宜的培養(yǎng)基初始pH為7. 0，鹽度為30%。，轉速為180r/min。實施例2在本實施例中首先選擇幾種復合營養(yǎng)源即那些既可以作為碳源又可作氮源的營養(yǎng)物質(如蛋白胨、酵母粉等)和兩種無機氮源。然后在它們的基礎上添加不同微量成分， 考察各成分對微泡菌的生長及產活性物質的影響(參見圖1 5)。以2216E為基礎培養(yǎng)基(無碳源和氮源)，用5. Og/L大豆蛋白胨、蛋白胨、牛肉膏、酵母粉為復合營養(yǎng)源及NaNO3和KNO3為無機氮源。其余組分含量同于基礎培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件為接種量為l%,28°C,180r/min, pH為7，鹽度為30%。，搖瓶培養(yǎng)24h后測定0D_ 和LD5(1。結果顯示，BS03菌株更適合生長在有機氮中。無機氮中菌體的生物量較低，ΚΝ03、 NaNO3WOD6tltl值分別為0. 071,0. 06133，有機氮中牛肉膏條件下菌體的生物量達到最大0D_ 為1. 126，蛋白胨次之1. 003，但此時菌株BS03溶藻活性物質的分泌能力不如蛋白胨培養(yǎng)條件下強。故綜合分析BS03菌株培養(yǎng)基選擇蛋白胨作為其最佳氮源，繼續(xù)后續(xù)的實驗。在5. Og/L胰蛋白胨的基礎上分別加入lg/L的可溶性淀粉、麥芽糖、乳糖、葡萄糖、 蔗糖充當碳源，并以僅加有蛋白胨作為對照1，其余組分含量同于基礎培養(yǎng)基，2216E為對照2。培養(yǎng)條件為接種量為1%，281，18017/1^11，？!1為7，鹽度為30%。，搖瓶培養(yǎng)2411后測定OD6tltl和LD5tlt5結合生長量和LD5tl考察加入的組分是否對BS03菌株存在促進作用。結果表明不同試驗組培養(yǎng)基BS03的發(fā)酵液生物量均比對照2(原培養(yǎng)基2216E)多，但差別不大。而各組的溶藻效果區(qū)別很明顯，可能由于培養(yǎng)基成分及配比不同影響了 BS03產生活性殺藻物質的能力。僅加有蛋白胨的對照1無論是生長量還是殺藻率都明顯低于對照2，即原基礎培養(yǎng)基；碳源添加組分中，添加葡萄糖和蔗糖的培養(yǎng)基其細胞胞濾液的LD5tl為1. 021,0. 965，皆低于原基礎培養(yǎng)基的1. 201，而其他幾種添加碳源的培養(yǎng)基其細胞胞濾液的LD5tl都高于原基礎培養(yǎng)基的細胞胞濾液的LD5tl，這表明這些碳源成分中葡萄糖和蔗糖對微泡菌BS03分泌活性物質有促進作用；因考慮成本問題故后續(xù)實驗選擇蔗糖為菌株BS03培養(yǎng)基的最佳碳源。在微生物發(fā)酵過程中，菌體的接種量和發(fā)酵時間也是影響微生物菌體生物量的產生及活性代謝物分泌的重要因素。故后續(xù)的實驗將菌體的接種量和發(fā)酵時間列入影響菌株 BS03發(fā)酵的影響因子，參與培養(yǎng)基優(yōu)化過程。說明該方程對菌體干重的模擬預測是可信的。由以上均勻設計實驗，可知各因素對殺藻率和菌體生長量均有一定的影響，該微泡菌BS03的的最佳培養(yǎng)基方案為pH值7. 5， 培養(yǎng)時間32h，蛋白胨10. 50g/L，蔗糖8. Og/L，接種量為3. 0%。實施例3根據前期試驗，選擇蛋白胨、蔗糖、pH、接種量、培養(yǎng)時間為影響因子進行5因素15 水平的均勻設計，其余組分同于初始培養(yǎng)基。五個因素分別為自變量XI、X2、X3、X4和X5， 菌體干重和OD6tltl為因變量Yp I。培養(yǎng)條件選擇J8°C，180r/min，鹽度為30%。。各因素均設置15水平，將實驗結果經DPS軟件數據處理系統(tǒng)二次多項式逐步回歸分析，并對該模型進行顯著性檢驗(參見表1，表2)表 權利要求
1.一種微泡菌BS03的培養(yǎng)基，其特征在于所述微泡菌BS03已于2010年9月3日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO =M 2010218 ；所述微泡菌BS03的培養(yǎng)基的組成是在IL的蒸餾水中含有蛋白胨1 20g/L，蔗糖1 15g/L0
2.如權利要求1所述的一種微泡菌BS03的培養(yǎng)基，其特征在于所述微泡菌BS03的培養(yǎng)基的組成是在IL的蒸餾水中含有蛋白胨10. 50g，蔗糖Sg。
3.如權利要求1所述的一種微泡菌BS03的培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于其具體步驟為將胰蛋白胨、蔗糖加入蒸餾水中定容至1L，滅菌后即得微泡菌BS03的培養(yǎng)基。
4.如權利要求3所述的一種微泡菌BS03的培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于所述滅菌的條件為121°C，20min。
全文摘要
一種微泡菌BS03的培養(yǎng)基及其制備方法。涉及微生物培養(yǎng)基，提供一種可高效培養(yǎng)微泡菌BS03、并顯著提高其細胞密度和殺藻活性物質產量的培養(yǎng)基及其制備方法。培養(yǎng)基的組成可為在1L的蒸餾水中含有蛋白胨1～20g/L，蔗糖1～15g/L。培養(yǎng)基的制備方法為將胰蛋白胨、蔗糖加入蒸餾水中定容至1L，滅菌后即得微泡菌BS03的培養(yǎng)基。以2216E為基礎培養(yǎng)基，采用多種方法優(yōu)化培養(yǎng)條件，開發(fā)出了一個適合高密度培養(yǎng)微泡菌BS03的復合培養(yǎng)基。
文檔編號C12N1/20GK102154180SQ201110040910
公開日2011年8月17日 申請日期2011年2月18日 優(yōu)先權日2011年2月18日
發(fā)明者傅麗君, 安新麗, 景曉明, 李 東, 田蘊, 鄭天凌, 陳勇 申請人:廈門大學