專利名稱:一種高效纖維素酶的制備方法
技術領域:
本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵領域,尤其涉及一種使用微生物發(fā)酵制備高效纖維素酶的方法。
背景技術:
纖維素類物質是自然界中一類含量最豐富的可再生資源 ,同時也是一類數(shù)量巨大的環(huán)境污染物。它的結構復雜,不溶于水,加之其常常與半纖維素和木質素等緊密結合在一起,形成了更為復雜的結構,使之更加難以降解。近些年,纖維素類物質資源化的研究愈來愈熱,利用纖維素類物質生產(chǎn)乙醇、有機酸等物質成為研究的趨勢。而要想將纖維素類物質轉化為其他物質,首先必須利用纖維素酶將其降解為低聚合度的物質。由于纖維素酶應用廣泛,因而大規(guī)模生產(chǎn)高效纖維素酶勢在必行。纖維素酶主要分為三類(I)內(nèi)切纖維素酶(EC3. 2. 1.4),也稱為內(nèi)切β_1,4-D-葡聚糖酶或Cx酶。該類酶主要作用于纖維素內(nèi)部的非結晶區(qū),隨機水解β_1,4糖苷鍵,從而將長鏈纖維素分子截短,產(chǎn)生大量帶非還原性末端的小分子纖維素。內(nèi)切葡聚糖酶的底物一般為非結晶纖維素和可溶性底物。(2)外切葡聚糖酶(EC3. 2. I. 91)作用于纖維素相撞分子末端,能夠水解1,4- β -D糖苷鍵,從而依次切下纖維二糖分子,故又稱為纖維二糖水解酶。(3) β -葡萄糖苷酶(EC3. 2. I. 21)可將纖維二糖水解成葡萄糖分子。由于纖維素結構復雜,其中任何一種酶都達不到完全降解纖維素的目的。實際上,這三類酶是協(xié)同降解纖維素的。微生物降解是一種利用纖維素降解菌及其產(chǎn)生的酶來降解纖維素的方法。自然界中,能產(chǎn)生纖維素酶的微生物眾多,主要以霉菌為主。但是,目前國內(nèi)外普遍存在的不足在于成本過高、發(fā)酵周期長、酶產(chǎn)量低等。因此,本領域急需尋找新的成本較低、發(fā)酵周期較短、酶產(chǎn)量較高的纖維素酶產(chǎn)生菌。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種新的纖維素酶的制備方法。本發(fā)明提供了一種高效纖維素酶的制備方法,所述的方法包括步驟(I)將尖鐮孢菌(Fusarium oxysporum)接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進行培養(yǎng),得到纖維素酶;以所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的總重量計,其中含有l(wèi)-2w/w%碳源,O. 5-5w/w%氮源,和O. 15-0. 25w/w%無機鹽;所述尖鐮孢菌(Fusarium oxysporum)是保藏編號為CGMCC3. 1790的。在上述的制備方法中,所述的碳源選自羧甲基纖維素鈉(CMC)、微晶纖維素、廢紙漿、稻草粉、或麩皮;較佳地,所述的碳源選自羧甲基纖維素鈉(CMC)或微晶纖維素。在上述的制備方法中,所述的氮源選自有機氮源和/或無機氮源;所述的有機氮源選自麩皮、魚粉蛋白胨、黃豆餅粉、燕麥粉、酵母膏、或魚粉蛋白胨;所述的無機氮源選自硝酸銨、硫酸銨或氯化銨;較佳地,所述的有機氮源選自麩皮、黃豆餅粉、或燕麥粉。在上述的制備方法中,所述的無機鹽選自磷酸氫鉀和硫酸鎂。在上述的制備方法中,所述發(fā)酵培養(yǎng)基pH 4. 0-6. O ;較佳地,所述發(fā)酵培養(yǎng)基pH4. O。在上述的制備方法中,在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)3-6天。在上述的制備方法的一個優(yōu)選例中,以所述發(fā)酵培養(yǎng)基的總重量計,所述發(fā)酵培養(yǎng)基中含有的羧甲基纖維素鈉(CMC)和麩皮的總量為I. 0w/w%,其中羧甲基纖維素鈉(CMC)的含量大于等于0.7w/w% ;所述發(fā)酵培養(yǎng)基中含有的硝酸銨和氯化銨的總量為
O.55w/w%,其中硝酸銨的含量大于等于O. 5w/w%,或氯化銨的含量大于等于O. 5w/w%。在上述的制備方法中,所述尖鐮孢菌是經(jīng)過種子培養(yǎng)基培養(yǎng)的;較佳地,所述尖鐮孢菌經(jīng)種子培養(yǎng)基培養(yǎng)28-32小時。據(jù)此,本發(fā)明提供了一種新的成本較低、發(fā)酵周期較短、酶產(chǎn)量較高的纖維素酶產(chǎn)生菌。
圖I是不同吸收波長下反應產(chǎn)物的吸光曲線;其中①是試劑空白的吸收曲線,②是反應產(chǎn)物的吸收曲線。圖2是葡萄糖標準曲線,其中橫坐標是參與反應的葡萄糖的起始濃度,縱坐標是葡萄糖和DNS (2,5-三硝基水楊酸)反應所獲得的反應產(chǎn)物在540nm的吸光值。
具體實施例方式發(fā)明人經(jīng)過長期的摸索,獲得了一種發(fā)酵培養(yǎng)基,通過將尖鐮孢菌(Fusariumoxysporum)接種于該培養(yǎng)基,經(jīng)發(fā)酵可以得到高效纖維素酶。在此基礎上,完成了本發(fā)明。具體地,本發(fā)明中用于尖鐮孢菌(Fusarium oxysporum)發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基,以其總重量計,其中含有碳源l_2w/w%,氮源O. 5-5w/w%,無機鹽O. 15-0. 25w/w %, pH4. 0_6· O ο所述碳源可為羧甲基纖維素鈉(CMC)、微晶纖維素、廢紙漿、稻草粉、麩皮等。這些碳源均含有大量纖維素,可誘導菌體產(chǎn)纖維素酶并被降解利用。羧甲基纖維素鈉和微晶纖維素為人工合成纖維素,結構相對簡單,相對易于降解;秸桿類物質是天然纖維素,結構十分復雜,須經(jīng)爆破、粉碎或酸堿處理等才可增強纖維素酶的降解作用和提高其降解率。所述氮源可為有機氮源或無機氮源,也可為有機氮源和無機氮源的組合。無機氮源易于吸收,在發(fā)酵初期更易于促進菌體生長;有機氮源可延長穩(wěn)定期的時間。所述有機氮源可為麩皮、魚粉蛋白胨、黃豆餅粉、燕麥粉或酵母膏或魚粉蛋白胨等。其中,麩皮、黃豆餅粉和燕麥粉中均含有一定量的纖維素,也可在一定程度上起到誘導產(chǎn)酶的作用。所述無機氮源可為硝酸銨、硫酸銨或氯化銨等。所述無機鹽選自磷酸鉀、硫酸鎂等,例如但不限于,所述發(fā)酵培養(yǎng)基中含有碳源lw/w%,氮源 O. 5_5w/w%,KH2PO4O. 2w/w%, MgSO4 · 7H20 O. 01w/w%, Tween-80 0.2%,pH4.O。本發(fā)明所提供的纖維素酶的制備方法具體步驟如下將尖鐮孢菌(Fusarium oxysporum)接種于上述本發(fā)明提供的發(fā)酵培養(yǎng)基中進行培養(yǎng),得到纖維素酶。較佳地,是將尖鐮孢菌(Fusarium oxysporum)接種于上述本發(fā)明提供的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)3-6天,將得到的發(fā)酵液于12000r冰凍離心15分鐘,所得上清液即為纖維素酶粗酶液。更佳地,是將尖鐮孢菌(Fusarium oxysporum)接種于種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)28_32小時,然后轉接到上述本發(fā)明提供的發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中,于同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)3-6天,將得到的發(fā)酵液于12000r冰凍離心15min,所得上清液即為纖維素酶粗酶液。所述尖鐮孢菌可購買于中國普通微生物菌種保藏管理中心,保藏編號為CGMCC3. 1790。所述的種子培養(yǎng)基配方為葡萄糖2%,蛋白胨I %,酵母膏0.5%,pH 7.0。所述種子培養(yǎng)的條件為培養(yǎng)溫度28°C,搖床轉速180rpm,裝瓶量30ml/250ml ;所述發(fā)酵培養(yǎng)條件為發(fā)酵溫度25 °C,搖床轉速220rpm,裝瓶量為30ml/250ml,接種量為I %。在本發(fā)明上述方法得到的纖維素酶粗酶液中所含纖維素酶系的最適溫度為60°C,最適pH為4. 4。如本發(fā)明所用,高效纖維素酶的制備方法得到的粗酶液中酶活力單位的檢測方法如下(I)濾紙酶活(FPase)測定取50mg(lcmX6cm)新華定性濾紙,加入適當稀釋酶液lml,加入Iml朽1檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH 4. 8),于50°C反應60分鐘,加入I. 5ml DNS試劑終止反應,然后沸水浴顯色10分鐘。然后立即在冷水中冷卻,定容至10ml,以蒸餾水為參比,于540nm處測吸光度,根據(jù)葡萄糖標準曲線得反應產(chǎn)生的還原糖含量。(2)羧甲基纖維素酶活(CMCase)測定取適當稀釋酶液lml,加入Iml 0. 625 % CMC-Na溶液,于50°C反應30分鐘,加入
I.5ml DNS試劑終止反應,然后沸水浴顯色10分鐘。然后立即在冷水中冷卻,定容至10ml,以蒸餾水為參比,于540nm處測吸光度,根據(jù)葡萄糖標準曲線得反應產(chǎn)生的還原糖含量。以沸水浴煮沸10分鐘的酶液作為空白對照。酶活定義以每分鐘產(chǎn)生I μ mol葡萄糖所需的酶量為I個酶活力單位(IU)。根據(jù)酶活定義,得酶活力單位的計算公式
權利要求
1.一種高效纖維素酶的制備方法,其特征在于,所述的方法包括步驟 (I)將尖鐮孢菌(Fusarium oxysporum)接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進行培養(yǎng),得到纖維素酶; 以所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的總重量計,其中含有l(wèi)-2w/w%碳源,O. 5-5w/w%氮源,和O. 15-0. 25w/w%無機鹽; 所述尖鐮孢菌(Fusarium oxysporum)是保藏編號為CGMCC3. 1790的。
2.如權利要求I所述的制備方法,其特征在于,所述的碳源選自羧甲基纖維素鈉(CMC)、微晶纖維素、廢紙漿、稻草粉、或麩皮。
3.如權利要求2所述的制備方法,其特征在于,所述的碳源選自羧甲基纖維素鈉(CMC)或微晶纖維素。
4.如權利要求I所述的制備方法,其特征在于,所述的氮源選自有機氮源和/或無機氮源;所述的有機氮源選自麩皮、魚粉蛋白胨、黃豆餅粉、燕麥粉、酵母膏、或魚粉蛋白胨;所述的無機氮源選自硝酸銨、硫酸銨或氯化銨。
5.如權利要求4所述的制備方法,其特征在于,所述的有機氮源選自麩皮、黃豆餅粉、或燕麥粉。
6.如權利要求I所述的制備方法,其特征在于,所述的無機鹽選自磷酸氫鉀和硫酸鎂。
7.如權利要求1-6任一所述的制備方法,其特征在于,所述發(fā)酵培養(yǎng)基pH4.0-6. O。
8.如權利要求7所述的制備方法,其特征在于,在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)3-6天。
9.如權利要求I所述的制備方法,其特征在于,以所述發(fā)酵培養(yǎng)基的總重量計,所述發(fā)酵培養(yǎng)基中含有的羧甲基纖維素鈉(CMC)和麩皮的總量為I. 0w/w%,其中羧甲基纖維素鈉(CMC)的含量大于等于0.7w/w% ;所述發(fā)酵培養(yǎng)基中含有的硝酸銨和氯化銨的總量為O. 55w/w%,其中硝酸銨的含量大于等于O. 5w/w%,或氯化銨的含量大于等于O. 5w/w%。
10.如權利要求9所述的制備方法,其特征在于,所述發(fā)酵培養(yǎng)基pH4.0。
11.如權利要求I所述的制備方法,其特征在于,所述尖鐮孢菌是經(jīng)過種子培養(yǎng)基培養(yǎng)的。
12.如權利要求11所述的制備方法,其特征在于,所述尖鐮孢菌經(jīng)種子培養(yǎng)基培養(yǎng)28-32小時。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高效纖維素酶的制備方法,所述的方法包括步驟(1)將尖鐮孢菌(Fusarium oxysporum)接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進行培養(yǎng),得到纖維素酶;以所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的總重量計,其中含有1-2w/w%碳源,0.5-5w/w%氮源,和0.15-0.25w/w%無機鹽。
文檔編號C12N9/42GK102643788SQ20111004091
公開日2012年8月22日 申請日期2011年2月21日 優(yōu)先權日2011年2月21日
發(fā)明者張春英, 朱寶泉, 胡海峰 申請人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院