專利名稱：一種弧菌bs02的培養(yǎng)基及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物培養(yǎng)基，尤其涉及一種弧菌BS02的培養(yǎng)基及其制備方法。
背景技術(shù)：
隨著現(xiàn)代工業(yè)化的快速發(fā)展和人口的增多，大量的工農(nóng)業(yè)廢水和生活污水不經(jīng)任何處理直接排放到海洋中，引起海洋水體富營養(yǎng)化加劇，赤潮頻繁發(fā)生(1、Hallegraeff GM. A reviewof harmful algal blooms and their apparent global increase[J]. Phycologia. 1993,32 :79-99)。有害赤潮已成為全球性的海洋災(zāi)害，嚴重制約了沿海經(jīng)濟的發(fā)展，破壞海洋生態(tài)環(huán)境和威脅人類健康，因而如何有效的防治赤潮成為當前國內(nèi)外急需解決的難題。在海洋生態(tài)系統(tǒng)中，微生物在海洋生物多樣性、海洋生物豐度及海洋循環(huán)系統(tǒng)中占據(jù)重要的地位。海洋微生物在赤潮生消的過程中所扮演的重要角色也越來越受到相關(guān)研究人員的關(guān)注。研究報道較多的是殺藻細菌通過分泌胞外殺藻活性物質(zhì)殺藻，細菌可以通過分泌胞外物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、抗生素、羥胺和含氮化合物等殺死藻細胞 (2、Amaro AM, Fuentes MS, Ogalde SR, et al.Identification and characterization of potentially algal-lytic marinebacteria strongly associated with the toxic dinoflagellate Alexandrium catenella[J]. J EukaryotMicrobiol,2005,52 (3) 191-200)。目前，利用殺藻細菌控制赤潮的研究還處于起步階段，而且赤潮災(zāi)害具有復雜性和多樣性的特點，必須在了解殺藻細菌的殺藻機制的基礎(chǔ)上進一步優(yōu)化其發(fā)酵條件，從而生產(chǎn)高效的殺藻劑。目前，對大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)殺藻物質(zhì)進行殺藻正處于初始階段，因此須對殺藻微生物的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，以及對該培養(yǎng)條件進行放大，從而達到工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用級別，為今后應(yīng)用微生物殺藻打下一個堅實的基礎(chǔ)。微生物發(fā)酵是一個極其復雜的生物過程，涉及到許多相互影響的因素，產(chǎn)物生物合成水平除受微生物內(nèi)部代謝機理、調(diào)控機制等影響外，適宜的培養(yǎng)基配方成為微生物發(fā)酵的關(guān)鍵因素，而一般的培養(yǎng)基種類多且各成分的相互作用復雜，因此，培養(yǎng)基的優(yōu)化工作顯得尤為重要。目前比較成熟的優(yōu)化培養(yǎng)基的方法有Plackett-Burman(PB) 設(shè)計法、單因素法、正交設(shè)計法、均勻設(shè)計法、響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計法等。人們努力尋找一種試驗次數(shù)少、周期短，求得的回歸方程精度高、能研究因素間交互作用的回歸分析方法。 Plackett-Burman(PB)設(shè)計法和響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計法能減少實驗的次數(shù)，很好的擬合因素與響應(yīng)間的全局函數(shù)關(guān)系，有助于快速建模，縮短優(yōu)化時間和提高應(yīng)用可信度。Plackett-Burman (PB)設(shè)計法是一種兩水平的試驗設(shè)計方法，它試圖用最少試驗次數(shù)達到使因素的主效果得到盡可能精確的估計，適用于從眾多的考察因素中快速有效地篩選出最為重要的幾個因素，供進一步研究用(3、Xia Li, Tongcheng Xu, Xiaohang Ma et al. Optimiz ationof culture conditions for production of cis-epoxysuccinic acid hydrolase using response surfacemethodology. Bioresource Technology. 2008,99,
35391-5396)。PB方法主要通過對每個因子取兩水平來進行分析，通過比較各個因子兩水平的差異與整體的差異來確定因子的顯著性。篩選試驗設(shè)計不能區(qū)分主效應(yīng)與交互作用的影響，但對顯著影響的因子可以確定出來，從而達到篩選的目的，避免在后期的優(yōu)化試驗中由于因子數(shù)太多或部分因子不顯著而浪費試驗資源。響應(yīng)曲面分析法(response surface analysis, RSA)是一種尋找多因素系統(tǒng)中最佳條件的數(shù)學統(tǒng)計方法，是數(shù)學方法和統(tǒng)計方法結(jié)合的產(chǎn)物，它可以用來對人們受多個變量影響的響應(yīng)問題進行數(shù)學建模與統(tǒng)計分析， 并可以將該響應(yīng)進行優(yōu)化，其目的是優(yōu)化這個響應(yīng)，確定系統(tǒng)的最優(yōu)進行條件或確定因素空間中滿足進行規(guī)范的區(qū)域。響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計法目前已成為降低成本、優(yōu)化加工條件的一種有效方法，廣泛地應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、生物、食品、化學等領(lǐng)域(4、李銘，楊亞力，楊順楷.響應(yīng)面法優(yōu)化固定粘紅酵母細胞條件及生物轉(zhuǎn)化制L-苯丙氨酸.應(yīng)用與環(huán)境生物學報.2010， 16(2) =279-284)。其中最常用的是Box-Behnken設(shè)計法(BBD)和中心組合設(shè)計法(Central composite design, CCD)。其中，與中心復合試驗相比，Box-Behnken試驗設(shè)計不存在軸向點，因而在實際操作時其水平設(shè)置不會超出安全操作范圍，并且在因素數(shù)相同時比中心復合設(shè)計所需的試驗次數(shù)少。Box-Behnken設(shè)計法可以進行因素數(shù)在3 7個范圍內(nèi)的試驗， 試驗次數(shù)一般為15 62次。通過將上述主要適用范圍不同的優(yōu)化設(shè)計進行合理的聯(lián)用可大大加快目標最優(yōu)值的獲得。目前較為常用的是Plackett-Burman(PB)設(shè)計法和響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計法的聯(lián)用，可通過搖瓶驗試先用PB設(shè)計法從多種培養(yǎng)基中確定重要因素，然后用響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計法得到個重要因素的最佳水平值(5、褚以文.微生物培養(yǎng)基優(yōu)化方法及其OPTI優(yōu)化軟件[J].國外醫(yī)藥抗生素分冊，1999，2(K2) :58-66) 0這兩種方法的聯(lián)用能減少實驗的次數(shù)，很好的擬合因素與響應(yīng)間的全局函數(shù)關(guān)系，有助于快速建模，縮短優(yōu)化時間和提高應(yīng)用可信度。其基本思路為通過Plackett-Burman (PB)法篩選出主要的影響因素，然后通過最陡爬坡實驗快速尋找最優(yōu)區(qū)域，然后利用區(qū)域中心點進行中心組合設(shè)計法(CCD)或 Box-Behnken設(shè)計法(BBD)建立回歸方程，最后對方程求極值得到最優(yōu)組合。周海鷗等人應(yīng)用PB設(shè)計法對影響桑黃發(fā)酵的培養(yǎng)基組成進行篩選，再采用中心組合設(shè)計法(CCD)或 Box-Behnken設(shè)計法(BBD)結(jié)合響應(yīng)面對影響菌絲得率的關(guān)鍵因素最佳水平進行了深入研究，并通過二次方程回歸求解得到最優(yōu)化條件。朱會霞等人(6、朱會霞，孫金旭.Nisin液體發(fā)酵工藝條件的響應(yīng)面分析優(yōu)化.中國乳品工業(yè).2009，37 (8) 31-34)應(yīng)用PB設(shè)計法對影響乳鏈菌肽液體發(fā)酵培養(yǎng)基組分進行了篩選，然后采用最陡爬坡實驗逼近3個關(guān)鍵因素的最大響應(yīng)區(qū)域，找到了最優(yōu)化的水平。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種適合于培養(yǎng)弧菌BS02 (Vibrio sp. BS02)，可顯著提高其細胞生物量和殺藻活性物質(zhì)產(chǎn)量的弧菌BS02的培養(yǎng)基。本發(fā)明的另一目的在于提供弧菌BS02(Vibrio sp. BS02)的培養(yǎng)基的制備方法。所述弧菌BS02 (Vibrio sp. BS02)已于2010年09月3日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址為中國武漢，武漢大學(郵編430072)，保藏中心保藏編號為CCTCC N0 M2010217。所述弧菌BS02 (Vibrio sp. BS02)是一種殺藻菌。
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所述弧菌BS02的培養(yǎng)基的組成為，在IL的蒸餾水中含有胰蛋白胨1.5 2.7g;酵母粉0.75 2.25g;葡萄糖0.5 l.Og;NaCl20 30g，MgSO4 · 7H20 0.1 0.3g;KCl1 3g;KBr0· 1 0. 5g ；K2HPO4 · 3H20 0· 07 0. 21g ；CaCl2 · 2H20 0· 25 1. Og ；Fe2 (SO4) 30. 02 0. 04g。所述弧菌BS02的培養(yǎng)基的組成最好為，在IL的蒸餾水中含有胰蛋白胨2. 7g ；酵母粉2. 95g ；葡萄糖0. 17g ；NaCl25g ；MgSO4 · 7H20 0. 2g ；KCl2g ；K2HPO4 · 3H20 0. 14g ；CaCl2 · 2H20 1. 15g ；Fe2 (SO4) 30.03。所述弧菌BS02的培養(yǎng)基的制備方法為將胰蛋白胨、酵母粉、葡萄糖、NaCUMgSO4· 7H20、KCUK2HPO4 · 3H20、CaCl2 · 2H20、 !^e2 (SO4)3加入蒸餾水中定容至1L，滅菌后即得弧菌BS02的培養(yǎng)基。所述滅菌，可采用高壓滅菌，所述高壓滅菌的條件可為12rC，20min。微生物發(fā)酵是一個極其復雜的生物過程，涉及到許多相互影響的因素，產(chǎn)物生物合成水平除受微生物內(nèi)部代謝機理、調(diào)控機制等影響外，適宜的培養(yǎng)基配方成為微生物發(fā)酵的關(guān)鍵因素。LB培養(yǎng)基作為分離、培養(yǎng)海洋細菌的傳統(tǒng)培養(yǎng)基在實踐中具有重要作用，但不同的細菌有不同的營養(yǎng)需求。故要對弧菌培養(yǎng)基配方進行優(yōu)化，從而促進殺藻物質(zhì)的產(chǎn)生和殺藻劑的研制。本發(fā)明以LB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，考察了培養(yǎng)基組分和添加量對弧菌 BS02搖瓶培養(yǎng)的影響，并利用Plackett-Burman(PB)設(shè)計法和響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計法對培養(yǎng)基進行優(yōu)化，開發(fā)出了一個適合高密度培養(yǎng)弧菌BS02的復合培養(yǎng)基。


圖1為本發(fā)明中弧菌BS02的生物量與殺藻效果相應(yīng)曲線圖。在圖1中，橫坐標為培養(yǎng)時間(h)，左縱坐標為波長在600nm下的光密度值0D·，右縱坐標為半致死率LD5tl(W)； 柱狀圖為0D·，折線圖為半致死率LD5tlt5圖2為不同培養(yǎng)基對Vibrio sp. BS02生長及殺藻效果的影響圖。在圖2中，橫坐標為不同培養(yǎng)基種類，從左到右依次為2216E、B培養(yǎng)基、BK培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、PY培養(yǎng)基、胰蛋白胨NaCl培養(yǎng)基、牛肉膏瓊脂培養(yǎng)基，左縱坐標為波長在600nm下的光密度值0D_，右縱坐標為半致死率LD5tl)；柱狀圖為0D_，折線圖為半致死率LD5tlt5圖3為根據(jù)回歸模型做出的酵母粉和葡萄糖的響應(yīng)面圖。在圖3中，X軸代表& 酵母粉(g/L)，Y軸代表波長在600nm下的光密度值0D_，Z軸代表\葡萄糖(g/L)。圖4為根據(jù)回歸模型做出的酵母粉和葡萄糖的等高線圖。在圖4中，橫坐標軸為 X2酵母粉(g/L)，縱坐標為\葡萄糖(g/L)。圖5根據(jù)回歸模型做出的酵母粉和CaCl2 ·2Η20的響應(yīng)面圖。在圖4中，X軸代表 X2酵母粉(g/L)，Y軸代表波長在600nm下的光密度值OD6tltl, Z軸代表X9CaCl2 · 2H20(g/L)。圖6根據(jù)回歸模型做出的酵母粉和CaCl2 ·2Η20的等高線圖。在圖6中，橫坐標軸為 X2 酵母粉(g/L)，縱坐標為 X9CaCl2 · 2H20(g/L)。圖7根據(jù)回歸模型做出的葡萄糖(X3)和CaCl2*2H200y的響應(yīng)面圖。在圖7中，X軸代表&葡萄糖(g/L)，Y軸代表波長在600nm下的光密度值OD·，Z軸代表 X9CaCl2 · 2H20 (g/L)。圖8為根據(jù)回歸模型做出的葡萄糖(X3)和CaCl2 · 2H20(X9)的等高線圖。在圖8 中，橫坐標軸為葡萄糖(g/L)，縱坐標為X9CaCl2 · 2H20(g/L)。圖9優(yōu)化前后弧菌BS02培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)生物量及殺藻效果對比結(jié)果圖。在圖9 中，橫坐標為優(yōu)化前后的培養(yǎng)基，左縱坐標為波長在600nm下的光密度值0D_，右縱坐標為半致死率LD5CI(% )；柱狀圖為0D_，折線圖為半致死率LD5tlt具體實施例方式以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，但本發(fā)明不限于下述實施例。本發(fā)明所用菌種、藻種、培養(yǎng)基和測定方法為菌種弧菌BS02由廈門大學應(yīng)用與環(huán)境微生物研究所依常規(guī)方法從漳江口云霄紅樹林沉積物中分離的一株具有較強殺藻活性的細菌，初步鑒定此菌為弧菌屬(Vibrio sp.) ο藻種Alexandrium tamarense (AT)無菌株，藻種購自暨南大學水生生物研究所， 經(jīng)本申請人無菌藻技術(shù)除菌得到的塔瑪亞歷山大藻無菌株。藻類所用培養(yǎng)基為f/2培養(yǎng)基。藻類置于室內(nèi)三角瓶中培養(yǎng)，溫度為20士 1°C，光照條件為1 光照/1 黑暗。培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)基Q216E)蛋白胨(P印tone) 5g，酵母提取物(Yeast Extract) lg，磷酸高鐵O. Ig,瓊脂粉IOg (固體培養(yǎng)基)，pH7. 6 7. 8，陳海水定容到1L?；A(chǔ)培養(yǎng)基(LB)牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，KBr 0. lg，陳海水定容到1L， pH 7. 5。以下給出濁度和殺率的測定方法1)濁度取適當原液或是稀釋的菌體發(fā)酵液，以2216E培養(yǎng)基為對照，采用分光光度計在波長600nm下測定光密度(OD6J值。2)殺藻率取發(fā)酵培養(yǎng)后的無細胞濾液，按照的比例加入測試藻類中，作用 24h后用魯戈氏液固定染色，在光學顯微鏡下計數(shù)。殺藻率(％) = (Nc-Nt)/NeX 100，式中，Nc表示對照組中的活細胞數(shù)，Nt表示實驗組中的活細胞數(shù)。
實施例1篩選合適的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，選取合適的培養(yǎng)基成分，利用Plackett-Burman(PB)設(shè)計法篩選顯著因子，通過最陡爬坡試驗尋找顯著因子的最優(yōu)區(qū)域，然后采用Box-Behnken 設(shè)計法建立回歸方程，最后對方程求極值得到最優(yōu)組合。本發(fā)明中的實驗設(shè)計、數(shù)據(jù)分析采用Minitab 13. O數(shù)據(jù)處理軟件。1)生物量與殺藻效果的關(guān)系將活化的BS02菌株按接種量轉(zhuǎn)接到裝有IOOmL 2216E的三角瓶中，3個平行。 每4h取樣測定0D·，離心去除細胞，4°C冰箱保存以測定殺藻效果。結(jié)果表明，在菌株生長的指數(shù)期大約8到20h內(nèi)，隨著菌株生物量的增加，殺藻效果也在逐漸的增加。24h以后，菌株的生長達到穩(wěn)定期，隨后的殺藻效果均達到71%以上， 變化較小(參見圖1)因此選取培養(yǎng)時間為12h，可以選用生物量0D_來代替波動性較大的半致死劑量LD5tl作為響應(yīng)值進行以后的優(yōu)化試驗。2)基礎(chǔ)培養(yǎng)基的選擇分別配制各種培養(yǎng)基胰蛋白胨-NaCl，牛肉膏瓊脂，B培養(yǎng)基，PY培養(yǎng)基，BK培養(yǎng)基，LB培養(yǎng)基和2216E培養(yǎng)基7種培養(yǎng)基，選用250mL的三角瓶，分裝IOOmL/瓶，115°C滅菌30min，備用。將活化好的BS02 (OD6tltl = 1. 125)菌液按1 %的比例接入上述7種培養(yǎng)基中，各3 個平行，150rpmJ8°C搖床培養(yǎng)12h。取樣測定0D·，剩余樣品7000rpm離心取上清，用于測定其殺藻活性，以滅菌的蒸餾水做為對照，計算不同培養(yǎng)基對塔瑪亞歷山大藻的半數(shù)致死劑量(LD5tl)。實驗結(jié)果顯示，該菌在LB培養(yǎng)基中，其生物量和殺藻率可達到較高值，故以LB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基進一步優(yōu)化(參見圖2)。實施例2根據(jù)前期實驗，基于響應(yīng)面分析法對弧菌BS02的培養(yǎng)基進行優(yōu)化l)Plackett-Burman 試驗設(shè)計Plackett-Burman設(shè)計法是一種以不完全平衡塊(balanced incomplete blocks) 為原理的部分析因?qū)嶒炘O(shè)計法，是一種兩水平的試驗設(shè)計方法，它試圖用最少試驗次數(shù)達到使因素的主效果得到盡可能精確的估計，適用于從眾多的考察因素中快速有效地篩選出最為重要的幾個因素，供進一步研究用。對于N次實驗至多可研究(N-I)個因素，但實際因素應(yīng)該要少于N-I個，至少要有1個虛構(gòu)變量用以估計誤差。每個因素取兩個水平低水平為原始培養(yǎng)條件，高水平約取低水平的1. 25倍。結(jié)合上述結(jié)果，采用生物量(0D_)最大，殺藻效果最好(LD5tl)的LB培養(yǎng)基做為基礎(chǔ)培養(yǎng)基進一步優(yōu)化。通過minitabl3.0軟件進行試驗設(shè)計，本實驗選取影響因素10個， 預留3個空項(Dummy)作誤差分析，選用了 N = 16的PB試驗設(shè)計表。各參數(shù)所代表因素及水平見表格(參見表1、表2)。表1中X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8, X9，和X10分別代表胰蛋白胨，酵母粉，葡萄糖，NaCl，MgSO4 · 7H20，KCl，KBr，K2HPO4 · 3H20，CaCl2 · 2H20，F(xiàn)e2 (SO4) 3 ； X11' Xi2和X13代表空項；Y代表OD6tltl平均值。表權(quán)利要求
1. 一種弧菌BS02的培養(yǎng)基，其特征在于所述弧菌BS02已于2010年09月03日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏中心保藏編號為CCTCC NO :M2010217 ；所述弧菌BS02的培養(yǎng)基的組成是在IL的蒸餾水中含有胰蛋白胨1. 5 2. 7g ；酵母粉0. 75 2. 25g ；葡萄糖0. 5 1. Og ；NaCl20 30g，MgSO4 · 7H200. 1 0. 3g ；KCl1 3g ；KBr0. 1 0. 5g ；K2HPO4 · 3Η20 0. 07 0. 2Ig ； CaCl2 · 2H20 0. 25 1. Og ； Fe2 (SO4) 30.02 0.04g。
2.如權(quán)利要求1所述的一種弧菌BS02的培養(yǎng)基，其特征在于所述弧菌BS02的培養(yǎng)基的組成是在IL的蒸餾水中含有胰蛋白胨2. 7g ；酵母粉2. 95g葡萄糖0. 17gNaCl25g ；MgSO4 · 7H200. 2g ；KCl2g；K2HPO4 · 3H200. 14g ；CaCl2 · 2H201. 15g ；Fe2 (SO4) 30. 03。
3.如權(quán)利要求1所述的一種弧菌BS02的培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于其具體步驟為將胰蛋白胨、酵母粉、葡萄糖、NaCl、MgS04 ·7Η20、Κα、Κ2ΗΡ04 ·3Η20,CaCl2 ·2H20,Fe2(SO4)3 加入蒸餾水中定容至1L，滅菌后即得弧菌BS02的培養(yǎng)基。
4.如權(quán)利要求3所述的一種弧菌BS02的培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于所述滅菌的條件為溫度121°C，時間20min。
全文摘要
一種弧菌BS02的培養(yǎng)基及其制備方法。涉及微生物培養(yǎng)基，提供一種適合于培養(yǎng)弧菌BS02，可顯著提高其細胞生物量和殺藻活性物質(zhì)產(chǎn)量的培養(yǎng)基。將胰蛋白胨、酵母粉、葡萄糖、NaCl、MgSO4·7H2O、KCl、K2HPO4·3H2O、CaCl2·2H2O、Fe2(SO4)3加入蒸餾水中定容至1L，滅菌后即得弧菌BS02的培養(yǎng)基。以LB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，考察了培養(yǎng)基組分和添加量對弧菌BS02搖瓶培養(yǎng)的影響，并利用Plackett-Burman(PB)設(shè)計法和響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計法對培養(yǎng)基進行優(yōu)化，開發(fā)出了一個適合高密度培養(yǎng)弧菌BS02的復合培養(yǎng)基。
文檔編號C12R1/63GK102154181SQ20111004094
公開日2011年8月17日 申請日期2011年2月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月18日
發(fā)明者傅麗君, 安新麗, 田蘊, 鄭天凌 申請人:廈門大學