專(zhuān)利名稱(chēng)：生物途徑制備肉桂酰胺的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及化工領(lǐng)域，具體地涉及生物途徑制備肉桂酰胺的方法。本發(fā)明提供了新的生產(chǎn)肉桂酰胺的微生物及使用該微生物生產(chǎn)肉桂酰胺或其鹽或衍生物的方法。
背景技術(shù)：
肉桂酰胺是ー種重要的化學(xué)原料。作為有機(jī)合成中間體，肉桂酰胺廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥合成及精細(xì)化工等領(lǐng)域。肉桂酰胺是白色結(jié)晶物質(zhì)，不溶于冷水，微溶于熱水，溶于こ醚和ニ硫化碳。肉桂酰胺還可以作為脊椎、非脊椎害物的趨避劑，并對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)有一定的抑制作用，從而減少害物對(duì)植作物的危害。肉桂酰胺可抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，是ー個(gè)具有開(kāi)發(fā)前景的抗腫瘤化合物。肉桂酰胺的衍生物可作為腦神經(jīng)保護(hù)劑、受體拮抗劑等。目前，肉桂酰胺是通過(guò)化學(xué)合成的方法得到的。エ業(yè)上，大都通過(guò)肉桂酸和ニ氯亞砜加熱反應(yīng)生成肉桂酰氯，再通過(guò)濃氨水和肉桂酰氯反應(yīng)經(jīng)處理而生成。肉桂酰胺傳統(tǒng)生成エ藝存在安全性較低、對(duì)設(shè)備要求高、能耗高、污染大、分離困難等缺點(diǎn)。另外，肉桂酰胺的生產(chǎn)很大程度上受制于原料肉桂酸的供應(yīng)。通過(guò)生物法合成肉桂酰胺可以改善化學(xué)法合成的種種弊端，這些弊端包括原料來(lái)源限制、試劑環(huán)境污染、副產(chǎn)物較多、分離提純困難等。生物發(fā)酵法的原料具有可再生性，不受季節(jié)和自然環(huán)境的影響、價(jià)格低廉、可批量生產(chǎn)，具有安全、清潔、無(wú)污染、低能耗等優(yōu)點(diǎn)，因而生物合成法已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。肉桂酰胺在生物合成方面的研究很少。1969年，G. S. BEZAN等發(fā)現(xiàn)利用輪絲鏈霉菌(Streptomyces vorticillatus) ATCC 13495可生成少量肉桂酰胺，并采用14C標(biāo)記L-苯丙氨酸上的羰基碳進(jìn)行其代謝途徑的研究(J Microb, 1970,16 :147-52.)。結(jié)果表明，在該ATCC 13495菌種的代謝途徑中，L-苯丙氨酸部分生成肉桂酸，然后得到肉桂酰胺。2004年,Mara Brunati等發(fā)現(xiàn)鏈霉菌可以生物催化肉桂酸生成肉桂酰胺。但這些過(guò)程的產(chǎn)物得率較低(10-40mg/L)，副產(chǎn)物比較多，制約了生物途徑制備肉桂酰胺的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程，應(yīng)用前景有限。另外，有報(bào)道對(duì)羥基肉桂酸可通過(guò)生物或化學(xué)途徑生成生物燃料對(duì)羥基苯こ烯。這提示，從肉桂酰胺轉(zhuǎn)化生成肉桂酸進(jìn)而生成苯こ烯是可行的，因此生物合成的肉桂酰胺還可能在生物燃料領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。因此，大規(guī)模エ業(yè)化生產(chǎn)迫切需求開(kāi)發(fā)高效率生產(chǎn)肉桂酰胺的微生物和相應(yīng)的生
產(chǎn)エ藝
發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的就是提供ー種高效生產(chǎn)肉桂酰胺的微生物和方法。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種放線(xiàn)菌鏈霉菌屬的微生物，所述的微生物的保藏號(hào)是 CGMCC NO. 4487。
在另ー優(yōu)選例中，所述的微生物是鏈霉菌(Streptomyces turgidiscabies)在本發(fā)明的第二方面，提供了本發(fā)明第一方面中所述的微生物的用途，它被用于生產(chǎn)肉桂酰胺或其鹽或其衍生物。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種生產(chǎn)肉桂酰胺或其鹽的方法，包括以下步驟(a)在20-55 V，pH5. 0-9. O條件下，培養(yǎng)保藏號(hào)CGMCC NO. 4487的鏈霉菌(Streptomyces sp.),從而產(chǎn)生肉桂酰胺或其鹽；(b)從發(fā)酵產(chǎn)物中分離出肉桂酰胺或其鹽。在另ー優(yōu)選例中，還包括步驟將步驟(b)中獲得的肉桂酰胺進(jìn)行成鹽反應(yīng)，形成肉桂酰胺鹽。
在另ー優(yōu)選例中，步驟(a)中用液體培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵。在另ー優(yōu)選例中，步驟(a)的發(fā)酵時(shí)間為1-20天。在另ー優(yōu)選例中，所述的發(fā)酵時(shí)間為I. 5-10天。在另ー優(yōu)選例中，步驟(b)中所述的分離包括從發(fā)酵液中分離肉桂酰胺和/或從菌體分離肉桂酰胺。在另ー優(yōu)選例中，所述的分離包括以發(fā)酵液為原料，經(jīng)硅藻土吸附抽濾，ニ氯甲烷萃取，重結(jié)晶，從而獲得肉桂酰胺。在另ー優(yōu)選例中，步驟(a)的發(fā)酵條件包括采用含碳源和氮源的液態(tài)基礎(chǔ)培養(yǎng)基，初始pH控制在5. 0-9. O之間，并在20-45°C下?lián)u床培養(yǎng)。在另ー優(yōu)選例中，發(fā)酵條件還包括將搖床轉(zhuǎn)速控制在180_250rpm，溫度控制在25-35°C, pH 控制在 7. 0-7. 5。在另ー優(yōu)選例中，在步驟(a)中還包括用NaOH或HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至6. 5-8。在本發(fā)明的第四方面，提供了通過(guò)上述生物途徑制備的放線(xiàn)菌次級(jí)代謝產(chǎn)物肉桂酰胺。在另ー優(yōu)選例中，所述的肉桂酰胺是以液體培養(yǎng)基對(duì)放線(xiàn)菌鏈霉菌屬進(jìn)行發(fā)酵，取發(fā)酵液為原料，經(jīng)硅藻土吸附抽濾，ニ氯甲烷萃取，蒸除溶剤，重結(jié)晶等分離提取步驟而得到的提取物，為白色固體。應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再
累述。


圖I顯示了根據(jù)16S rDNA全序列的相似性原理，構(gòu)建的放線(xiàn)菌菌株CGMCC 4487的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。圖2顯示了對(duì)本發(fā)明方法制備的肉桂酰胺的HPLC檢測(cè)的譜圖，其中橫坐標(biāo)為時(shí)間；縱坐標(biāo)為峰面積響應(yīng)值。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，通過(guò)傳統(tǒng)的微生物篩選方法獲得了一株新的微生物，它可高效地產(chǎn)生肉桂酰胺，這ー菌株被命名為鏈霉菌(Streptomyces sp·)。在此菌株的基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。菌株本發(fā)明的菌株于2010年12月17日保存在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(中國(guó)，北京)，編號(hào)為CGMCC NO. 4487。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“本發(fā)明菌株”或“本發(fā)明微生物”指編號(hào)為CGMCC NO. 4487的鏈霉菌。 該菌株為從土壌中分離篩選出的放線(xiàn)菌鏈霉菌屬，經(jīng)過(guò)對(duì)菌株進(jìn)行形態(tài)觀察和生理生化特征的研究，以及16S rDNA的核苷酸全序列進(jìn)行分析測(cè)序，進(jìn)而構(gòu)建的生物進(jìn)化樹(shù)暫時(shí)將該菌株歸屬為Streptomyces turgidiscabies。本發(fā)明菌株的部分生理生化特征如下可以產(chǎn)生蛋白酶，使牛奶胨化；能產(chǎn)生淀粉酶；能夠利用明膠；對(duì)硝酸鹽具有還原能力。但不能產(chǎn)生酪氨酸激酶和纖維素酶；生長(zhǎng)過(guò)程中不能產(chǎn)生h2s。應(yīng)理解，本發(fā)明菌株不僅包括CGMCC NO. 4487，還包括其衍生菌株。發(fā)酵生產(chǎn)肉桂酰胺本發(fā)明的菌株CGMCC NO. 4487可用于通過(guò)生物法制備肉桂酰胺或其鹽或其衍生物。其中，所述的鹽包括(但并不限于)鹽酸鹽，硫酸鹽，磷酸鹽、醋酸鹽，檸檬酸鹽、其他有機(jī)羧酸鹽等。一方面，發(fā)酵會(huì)產(chǎn)生肉桂酰胺及其鹽或衍生物，此外對(duì)于獲得的肉桂酰胺可進(jìn)行成鹽反應(yīng)或衍生反應(yīng)，從而形成肉桂酰胺鹽或衍生物。本發(fā)明的生產(chǎn)方法，除了生產(chǎn)菌不同之外，其他條件與現(xiàn)有技術(shù)中發(fā)酵生產(chǎn)的方法基本相同，例如對(duì)肉桂酰胺粗品的重結(jié)晶エ藝。本發(fā)明菌株的發(fā)酵條件與一般的鏈霉菌相近，即在含碳源、氮源和微量元素的培養(yǎng)基中，在pH5. 0-9. 0(較佳地pH7. 0-7. 5)和20-45。。(較佳地25_40°C )發(fā)酵。在本發(fā)明中，“菌絲體”、“發(fā)酵液”或“培養(yǎng)液”可通過(guò)在適合生長(zhǎng)的條件下培養(yǎng)本發(fā)明菌株，使其生長(zhǎng)至一定的菌絲體濃度來(lái)獲得。用于培養(yǎng)本發(fā)明菌株的培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)源沒(méi)有特別的限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)公知的技術(shù)來(lái)選擇合適的碳源、氮源和其他營(yíng)養(yǎng)源。例如，碳源可以是淀粉、糊精、葡萄糖、果糖、蔗糖、甘油、肌醇、甘露醇等。氮源可以是胨、大豆粉、黃豆餅粉、肉膏、蛋白粉、麥皮、米糖、酵母粉、玉米漿、銨鹽以及其他有機(jī)物或無(wú)機(jī)含氮化合物。另外，培養(yǎng)基中還可適當(dāng)加入ー些無(wú)機(jī)鹽類(lèi)，如氯化鈉、磷酸鹽(如磷酸ニ氫鉀和磷酸氫ニ鉀等)、硫酸錳、硫酸銨、硫酸鎂、碳酸鈣等金屬鹽。通?？刹捎酶鞣N已知的常規(guī)培養(yǎng)基，如LB瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、葡萄糖酵母膏瓊脂培養(yǎng)基和牛肉浸汁瓊脂培養(yǎng)基等對(duì)本菌株進(jìn)行斜面固體培養(yǎng)并4°C環(huán)境下進(jìn)行初歩保藏。在ー個(gè)具體實(shí)施方案中，用于培養(yǎng)本發(fā)明菌株的培養(yǎng)基具有以下組成(％表示質(zhì)量/體積)葡萄糖O. 1% 3%、可溶性淀粉O. 1% 3%、蛋白胨O 3%、黃豆餅粉O. I % 3 %、酵母粉O. 01 % I %、牛肉膏O. 01 % O. 5%、NaCl O. I % 3%、K2HPO4O. 01% 0.5%、pH 6. 8 7. 4。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明并不局限于本文中列舉的這些具體培養(yǎng)基配方。培養(yǎng)本發(fā)明中的菌株的溫度、pH、氣液比、罐壓、轉(zhuǎn)速等條件沒(méi)有特別嚴(yán)格的限制，只要該條件適合該菌的生長(zhǎng)即可。
在培養(yǎng)時(shí)可采用豆油等消泡劑進(jìn)行消泡。在一些較佳的實(shí)施方案中，pH宜控制在
6.5 8. O之間，培養(yǎng)溫度宜在25 40°C之間應(yīng)理解，本發(fā)明的發(fā)酵可以是連續(xù)發(fā)酵，也可以是間歇式發(fā)酵。在本發(fā)明的一個(gè)較佳的實(shí)施方案中，通過(guò)以下方法培養(yǎng)所述放線(xiàn)菌來(lái)得到發(fā)酵液和菌絲體在含有碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，發(fā)酵溫度在20 35°C之間、轉(zhuǎn)速在IOOrpm或以上，其中所述碳源選自葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉和大米粉中的I種或幾種，所述氮源選自牛肉膏、蛋白胨、蛋白粉、酵母粉、花生餅粉和黃豆餅粉中的I種或幾種，所述無(wú)機(jī)鹽包括常規(guī)的無(wú)機(jī)鹽，如 NaCl、MgS04、(NH4) 2S04、MgCl2、KCl、KH2P04、K2HPO4 和 CaC03。分離純化本發(fā)明還提供了從發(fā)酵產(chǎn)物中分離純化放線(xiàn)菌次級(jí)代謝產(chǎn)物肉桂酰胺的方法，以及所得到的肉桂酰胺。在一個(gè)優(yōu)選例中，將本發(fā)明菌株在液態(tài)培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，取發(fā)酵液為原料，經(jīng)娃藻土吸附抽濾，ニ氯甲烷萃取，旋蒸除溶劑，重結(jié)晶的分離提取步驟而得到的提取物，經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定為肉桂酰胺。在另ー優(yōu)選例中，肉桂酰胺的制備方法包括以下步驟(I)采用固態(tài)或液態(tài)培養(yǎng)基(優(yōu)選液態(tài)培養(yǎng)基)對(duì)該放線(xiàn)菌CGMCC No. 4487進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；(2)發(fā)酵后，將發(fā)酵液中添加硅藻土(以50ml發(fā)酵液添加2_20g硅藻土的比例)，混合均勻，真空抽濾，得濾液；或者對(duì)發(fā)酵液用離心機(jī)離心處理，轉(zhuǎn)速4000-8000rpm,離心時(shí)間10_30min,離心后獲
得上清液；(3)將濾液或上清液，用ニ氯甲烷萃取，萃取3-5次；(4)取有機(jī)相，添加無(wú)水硫酸鎂除水，過(guò)濾，取濾液，蒸除溶劑，得到肉桂酰胺粗品。(5)采用こ醚和こ醇溶劑將肉桂酰胺粗品進(jìn)行重結(jié)晶，即得到白色肉桂酰胺純品。分離提取所得到的肉桂酰胺采用常規(guī)的HPLC等檢測(cè)方法對(duì)其含量進(jìn)行分析。產(chǎn)業(yè)應(yīng)用和優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明不僅提供了合適的微生物菌株，還通過(guò)培養(yǎng)基的優(yōu)化以及發(fā)酵過(guò)程的調(diào)控，進(jìn)ー步提高微生物發(fā)酵生產(chǎn)肉桂酰胺的效率。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了通過(guò)放線(xiàn)菌發(fā)酵制備高產(chǎn)量的次級(jí)代謝產(chǎn)物肉桂酰胺，具有重要的研究意義和實(shí)用價(jià)值，經(jīng)濟(jì)效益可觀。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)包括(a)本發(fā)明菌株可高效地生產(chǎn)肉桂酰胺，產(chǎn)量可高達(dá)約560ppm/L。(b)在可基礎(chǔ)培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，不必添加昂貴的原料，從而大幅降低生產(chǎn)成本。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)ー步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)■ (New York Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例I肉桂酰胺生產(chǎn)菌株的獲得和鑒定
I.微生物的分離篩選從中國(guó)各地采集得到的土壌樣本以10_2_10_6稀釋然后鋪于平板上，平板于28°C恒溫培養(yǎng)7-10天。共約1，500個(gè)菌株被分離出來(lái)用于搖瓶篩選。其中有I株從土壤分離所得的放線(xiàn)菌菌株顯示能高效產(chǎn)生肉桂酰胺。2.菌株特性2. I形態(tài)特征在以果糖為碳源的固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)特征為菌落突起、大致呈圓型、直徑小、絲狀有褶皺。2. 2培養(yǎng)特征 配制固體斜面培養(yǎng)基，菌株接種過(guò)程中應(yīng)注意只接種孢子或菌種本身，以避免帶入其他碳源，干擾試驗(yàn)結(jié)果。其中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為無(wú)碳源培養(yǎng)基，成分為(NH) 2S04 2. 6g ；K2HP04 5. 65g ；MgSO4 · 7H20 Ig ;CuS04 · 5H20 0. 0064g ;FeS04 · 7H20 0. OOllg ；MnCl2 · 4H200. 0079g ；ZnSO4 · 7H20 0. 0015g ;瓊脂18g ;蒸餾水IL ；pH :7. 2-7. 4。選用的碳源有阿拉伯糖，葡萄糖，鼠李糖，木糖，果糖，蔗糖，棉子糖，甘露糖，肌醇。每種碳源均按基礎(chǔ)培養(yǎng)基的1%加入。將待測(cè)菌株分別接種于空白基礎(chǔ)培養(yǎng)基、分別添加9種不同碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，其中空白基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為對(duì)照組。培養(yǎng)箱中28°C恒溫培養(yǎng)，7-12天后觀察，分別紀(jì)錄生長(zhǎng)利用情況。若待測(cè)菌株在含碳培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況明顯超過(guò)空白基礎(chǔ)培養(yǎng)基，則試驗(yàn)結(jié)果定為陽(yáng)性。結(jié)果如下表
碳源利用_^_
L-阿拉伯糖+
D-葡萄糖+++
L-鼠李糖+
D-木糖1++ロ
D-果糖+++
蔗糖++
棉子糖++
D-甘露醇+++
L-肌醇+2. 3生理生化特征可以產(chǎn)生蛋白酶，使牛奶胨化；能產(chǎn)生淀粉酶；能夠利用明膠；對(duì)硝酸鹽具有還原能力。但不能產(chǎn)生酪氨酸激酶和纖維素酶；生長(zhǎng)過(guò)程中不能產(chǎn)生h2s。2. 4菌種鑒定結(jié)果抽提該菌株的DNA，對(duì)16S rDNA的核苷酸全序列進(jìn)行分析測(cè)序和分析。結(jié)果如圖I所示，基于構(gòu)建的生物進(jìn)化樹(shù)，暫時(shí)將該菌株歸屬為Streptomycesturgidiscabies中的一支。應(yīng)理解，這種歸屬是對(duì)本發(fā)明的保護(hù)范圍無(wú)影響。本實(shí)施例中分離和鑒定的菌株于2010年12月17日保存在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(中國(guó)，北京)，編號(hào)為CGMCC NO. 4487。實(shí)施例2肉桂酰胺的制備本實(shí)施例中，從發(fā)酵液中分離肉桂酰胺步驟一、以液體培養(yǎng)基對(duì)放線(xiàn)菌CGMCC No. 4487進(jìn)行液體發(fā)酵，“2_3菌落個(gè)數(shù)/50ml液體培養(yǎng)基”的接種量，發(fā)酵培養(yǎng)基成分為可溶性淀粉10g，葡萄糖20g，黃豆粉25g，酵母粉4g，牛肉浸膏l(xiāng)g，NaCl 2g, K2HPO4 O. 05g，離子水1000ml，ρΗ7· 0，搖瓶發(fā)酵，裝量50ml/250ml三角瓶，溫度28_30°C，搖床轉(zhuǎn)速220rpm，培養(yǎng)4天。
步驟ニ、取發(fā)酵液為原料，添加硅藻土(以50ml發(fā)酵液添加IOg硅藻土的比例)，搖床150rpm，IOmin混合均勻，將混合液采用真空泵進(jìn)行抽濾，取得濾液，并對(duì)濾餅用適量去離子水沖洗。步驟三、合井上步驟ニ中的濾液，用ニ氯甲烷進(jìn)行萃取，萃取3-5次。步驟四、取有機(jī)相，添加無(wú)水硫酸鎂除水，恒壓過(guò)濾，取濾液上旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，進(jìn)而得到肉桂酰胺粗品。步驟五、采用こ醚和こ醇溶劑將肉桂酰胺粗品進(jìn)行重結(jié)晶，即得到白色肉桂酰胺純品。結(jié)果，獲得了白色肉桂酰胺純品，胞外產(chǎn)率可達(dá)180mg/L。實(shí)施例3肉桂酰胺的制備本實(shí)施例中，從發(fā)酵液和菌絲體中分離肉桂酰胺。步驟一、如實(shí)施例2。步驟ニ、取發(fā)酵液，4000rpm離心后得到發(fā)酵上清液和菌絲體部分。菌絲體部分用80%的丙酮水溶液以體積比I : I的用量浸提12小時(shí)(預(yù)處理)，浸提后5000rpm冷凍離心，過(guò)濾后除去濾渣，減壓濃縮至除去丙酮剩含水混合物。發(fā)酵液部分添加硅藻土(以50ml發(fā)酵液添加IOg娃藻土的比例)，搖床150rpm, IOmin混合均勻,將混合液采用真空泵進(jìn)行抽濾，取得濾液，并對(duì)濾餅用適量去離子水沖洗。步驟三、合井上步驟ニ中的濾液，用ニ氯甲烷進(jìn)行萃取，萃取3-5次。步驟四、取有機(jī)相，添加無(wú)水硫酸鎂除水，恒壓過(guò)濾，取濾液上旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，進(jìn)而得到肉桂酰胺粗品。步驟五、采用こ醚和こ醇溶劑將肉桂酰胺粗品進(jìn)行重結(jié)晶，即得到白色肉桂酰胺純品。結(jié)果，獲得了白色肉桂酰胺純品，產(chǎn)率可達(dá)360mg/L。這表明，肉桂酰胺存在于發(fā)酵液和菌絲體中。實(shí)施例4肉桂酰胺的制備制備方法如下步驟一、以液體培養(yǎng)基對(duì)放線(xiàn)菌CGMCC No. 4487進(jìn)行發(fā)酵，“2_3菌落個(gè)數(shù)/50ml液體培養(yǎng)基”的接種量，發(fā)酵培養(yǎng)基成分為可溶性淀粉10g，酵母粉4g，牛肉浸膏l(xiāng)g，NaCl 2g，K2HPO4O. 05g,肉桂酸O. 25g，離子水1000ml，pH7. 0，搖瓶發(fā)酵，裝量50ml/250ml三角瓶，溫度28-300C，搖床轉(zhuǎn)速220rpm，培養(yǎng)4天。步驟ニ至五、如實(shí)施例2。結(jié)果，獲得了白色肉桂酰胺純品，胞外產(chǎn)率可達(dá)290mg/L。實(shí)施例5肉桂酰胺的制備方法如下步驟一、以液體培養(yǎng)基對(duì)放線(xiàn)菌CGMCC No. 4487進(jìn)行發(fā)酵，“2-3菌落個(gè)數(shù)/50ml 液體培養(yǎng)基”的接種量，發(fā)酵培養(yǎng)基成分為可溶性淀粉I %，葡萄糖2%，黃豆粉4%，牛肉浸膏O. 1%，酵母粉0.6%，NaCl O. 3%，去離子水1000ml，接種pH值6. 8。搖瓶發(fā)酵，裝量50ml/250ml三角瓶，溫度28_32°C，搖床轉(zhuǎn)速220rpm，培養(yǎng)4天。步驟ニ至五、如實(shí)施例3。結(jié)果，獲得了白色肉桂酰胺純品，產(chǎn)率可達(dá)560mg/L。實(shí)施例6肉桂酰胺的HPLC分析檢測(cè)方法將實(shí)施例1-5中的分離提取所得到的肉桂酰胺采用HPLC的檢測(cè)方法對(duì)其含量進(jìn)行分析。本實(shí)例中采用高效液相色譜儀(HPLC):安捷倫1200液相色譜儀(MWD檢測(cè)器)，chemoffice 工作站，Agilent Eclipse XDB C18 柱(4. 6mmX 250mm, 5 μ m), 20 μ L 定量環(huán)。流動(dòng)相采用一定比例的こ腈和蒸餾水混合溶剤，采用梯度洗脫的方式進(jìn)行HPLC分析。具體分析條件如表I。表I. IHPLC的分析條件
編號(hào)時(shí)間__H2Q
1O 分鐘O100%
26 分鐘40%60%
312 分鐘100%O
414 分鐘100%O
516 分鐘O100%采用270nm的紫外吸收下進(jìn)行檢測(cè)，制備的肉桂酰胺在此分析條件下出峰時(shí)間為
9.103分鐘,與標(biāo)準(zhǔn)品相同。具體HPLC譜圖如圖2所示。實(shí)施例7代謝生成肉桂酰胺途徑的研究重復(fù)實(shí)施例1，不同點(diǎn)在于，在發(fā)酵過(guò)程中添加0_656mg/L的L-苯丙氨酸。結(jié)果，肉桂酰胺的最終產(chǎn)量為160_180mg/L，沒(méi)有顯著提高。此外，對(duì)篩選所得的菌株CGMCC 4487代謝生成肉桂酰胺途徑的初歩研究中，發(fā)現(xiàn)在菌株生長(zhǎng)和肉桂酰胺的代謝生成過(guò)程的跟蹤中，沒(méi)有檢測(cè)到肉桂酸的存在，提示該菌株可能是通過(guò)其他途徑合成或產(chǎn)生肉桂酰胺。
菌種保藏本發(fā)明的菌株于2010年12月17日保存在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(中國(guó)，北京)，編號(hào)為CGMCC NO. 4487。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每ー篇文獻(xiàn)被単獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種放線(xiàn)菌鏈霉菌屬的微生物，其特征在于，所述的微生物的保藏號(hào)是CGMCCNO. 4487。
2.如權(quán)利要求I所述的微生物的用途，其特征在于，用于生產(chǎn)肉桂酰胺或其鹽或其衍生物。
3.—種生產(chǎn)肉桂酰胺或其鹽的方法，其特征在于，包括以下步驟 (a)在20-55°C, pH5. 0-9. O條件下，培養(yǎng)保藏號(hào)CGMCC NO. 4487的鏈霉菌(Streptomyces sp.),從而產(chǎn)生肉桂酰胺或其鹽； (b)從發(fā)酵產(chǎn)物中分離出肉桂酰胺或其鹽。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(a)中用液體培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(a)的發(fā)酵時(shí)間為1-20天。
6.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(b)中所述的分離包括從發(fā)酵液中分離肉桂酰胺和/或從菌體分離肉桂酰胺。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在干，所述的分離包括以發(fā)酵液為原料，經(jīng)硅藻土吸附抽濾，ニ氯甲烷萃取，重結(jié)晶，從而獲得肉桂酰胺。
8.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(a)的發(fā)酵條件包括采用的含碳源和氮源的液態(tài)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，初始PH控制在5. 0-9. O之間，并在20-45°C下?lián)u床培養(yǎng)。
9.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在干，發(fā)酵條件還包括將搖床轉(zhuǎn)速控制在180-250rpm，溫度控制在 25_35°C，pH 控制在 7. 0-7. 5。
10.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，在步驟(a)中還包括用NaOH或HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至6. 5-8。
全文摘要
本發(fā)明提供了通過(guò)生物途徑合成肉桂酰胺的方法。具體地，本發(fā)明提供了一種新的生產(chǎn)肉桂酰胺或其鹽的微生物及使用該微生物生產(chǎn)肉桂酰胺的方法。本發(fā)明的微生物鏈霉菌(Streptomyces sp.)CGMCC NO.4487是從土壤中篩選所得的一株放線(xiàn)菌鏈霉菌屬菌種。該菌株通過(guò)發(fā)酵產(chǎn)生的高效地產(chǎn)生肉桂酰胺。本發(fā)明還提供了高效、簡(jiǎn)便的制備和分離提取肉桂酰胺的方法，從而實(shí)現(xiàn)了通過(guò)生物途徑生產(chǎn)肉桂酰胺。
文檔編號(hào)C12R1/465GK102643759SQ201110041278
公開(kāi)日2012年8月22日 申請(qǐng)日期2011年2月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月18日
發(fā)明者廖聘, 徐文平, 徐曉勇, 李忠, 滕青衫, 錢(qián)旭紅, 陶黎明 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)