專利名稱：一種預(yù)測干擾素治療慢性乙型肝炎療效的血漿miRNA譜及檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。更具體地，涉及血漿miRNA表達水平預(yù)測干擾素治療慢性乙肝療效。本發(fā)明還涉及檢測miRNA水平的方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
乙型肝炎病毒(HBV)感染能引起慢性肝臟疾病并顯著增加罹患肝細胞癌的風(fēng)險。 雖然已廣泛使用乙肝表面抗原重組抗原疫苗預(yù)防感染，HBV感染仍然是世界各國的重要健康問題。干擾素α與核苷類似物，如拉米夫定、阿德福韋、恩替卡維、替比夫定等是HBV感染的主要治療藥物。干擾素治療通常只能在有限的病人中獲得完全應(yīng)答，中止治療后容易復(fù)發(fā)。近年來應(yīng)用聚乙二醇化干擾素(又稱長效干擾素，主要有PEG-IFNa 2a，PEG-IFNa 2b兩種)顯著提高了 e抗原血清轉(zhuǎn)換(PEG-IFNa 2a 32%，PEG-IFN a 2b 36%)和一小部分病人表面抗原血清轉(zhuǎn)換(2. 9%，PEG-IFNa 2a)。然而，長效干擾素容易引發(fā)如流感樣癥狀、抑郁、性格改變等副作用。核苷類似物，如拉米夫定、阿德福韋、恩替卡維、替比夫定等，是乙肝逆轉(zhuǎn)錄聚合酶的有效抑制劑，能阻斷病毒基因組復(fù)制。但是，這類藥物治療不能獲得較高的血清轉(zhuǎn)換率，且有很大一部分病人在停止用藥后復(fù)發(fā)。另外，長期使用容易引起耐藥突變的形成。盡管近些年在慢性乙肝的治療手段、病毒血清轉(zhuǎn)換率和病毒學(xué)應(yīng)答方面都有了顯著提高，慢性乙肝的治療效果仍不夠理想。特別是長效干擾素對于發(fā)展中國家的低收入家庭非常昂貴。因此，目前急需能夠在治療前預(yù)測干擾素治療效果的方法，從而為個人化治療提供解決方案。目前已知的與治療預(yù)后相關(guān)的因素有I.治療前ALT水平，2.治療前HBVDNA, 3.性別，4.肝臟組織學(xué)狀態(tài)，5.治療過程中HBsAg低度變化動態(tài)。然而，目前的指標(biāo)的預(yù)測能力有限，急需一種能在血液中中檢測的，有較高預(yù)測準(zhǔn)確度的分子標(biāo)記。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是確定一種能在血液中中檢測的，有較高預(yù)測準(zhǔn)確度的分子標(biāo)記。近年來的研究顯示小非編碼RNA(約22和核苷酸)，又稱小RNA(microRNA，miRNA)。小RNA存在于各類組織中，能通過與靶mRNA3’未翻譯末端核苷酸配對促進其降解或抑制翻譯。miRNA是由長前體RNA進行轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生，并被Drosha (—種核酸酶)預(yù)處理后通過exportin-5介導(dǎo)的出核過程轉(zhuǎn)運到細胞漿。miRNA進一步被DICER酶剪切，最后形成17-24個核苷酸的成熟miRNA，并與RISC復(fù)合體結(jié)合，執(zhí)行基因沉默功能。小RNA是一類在血漿中存在的短核苷酸，已有報道證明可以作為肝臟損傷和妊娠的非常敏感的分子標(biāo)記。本發(fā)明經(jīng)過大量研究，確定了一種預(yù)測干擾素治療慢性乙型肝炎療效的血漿miRNA譜，該miRNA譜包括SEQ ID NO 1_11中一個或多個miRNA。
并且，根據(jù)該miRNA譜提供了一種預(yù)測干擾素治療慢性乙型肝炎療效的試劑盒，該試劑盒含有針對SEQ ID NO 1-11中一個或多個miRNA特異性探針核苷酸。同時，提供了一種預(yù)測干擾素治療慢性乙型肝炎療效的芯片，該芯片含有針對SEQID NO 1-11中一個或多個miRNA特異性探針核苷酸。本發(fā)明還提供了一種預(yù)測干擾素治療慢性乙型肝炎療效的方法，即檢測SEQ IDNO 1-11中一個或多個miRNA在使用干擾素前血漿、血清樣品中表達水平，對樣品中表達水平與標(biāo)準(zhǔn)水平差異利用統(tǒng)計方法分析預(yù)測干擾素療效。所述miRNA中至少一種的表達水平高于或者低于已知的標(biāo)準(zhǔn)水平。 具體的，該方法包括步驟(I)血漿、血清樣本小RNA的抽提，(2) 核酸樣本與具有如SEQ ID No. 1-11中一個或多個miRNA特異性探針的芯片進行雜交，(3)對雜交信號與對照樣本的雜交結(jié)果進行比較。所述的統(tǒng)計方法是分析樣品中表達水平與標(biāo)準(zhǔn)水平差異的顯著性。所述的統(tǒng)計方法包括miRNA表達譜通過最大關(guān)聯(lián)度最小冗余度分析對每個miRNA評分；利用近鄰分類算法作為預(yù)測引擎進行類別判斷；特征值遞增分析法和留一法交叉驗證優(yōu)化入選miRNA的數(shù)量。本發(fā)明中，乙肝病人治療前部分miRNA的表達譜能夠預(yù)測干擾素α治療效果，并據(jù)此公開了相關(guān)miRNA的檢測方法、預(yù)測模型建立的方法及檢測試劑盒。本發(fā)明提供了一個獨特的能夠區(qū)分HBV患者是否對長效干擾素或普通干擾素治療應(yīng)答(初期病毒學(xué)應(yīng)答，治療12周大于21og HBVDNA降低)的miRNA表達譜。此表達譜由 hsa-let-7a SEQID NO. 1/11，hsa_miR-30a SEQID NO. 2/11, hsa-miR-1290 SEQIDNO. 3/11, hsa-miR-106b SEQID NO. 4/11, hsa-miR-1224_5p SEQID NO. 5/11, hsa-miR-939SEQID NO.6/11, hsa-miR-1281 SEQID NO.7/11, hsa-miR-198 SEQID NO.8/11,hsa-let-7f SEQID NO. 9/11, hsa-miR-22 SEQID NO. 10/11, hsa-miR-638 SEQID N011/11組成。本發(fā)明提供了血清miRNA表達譜的檢測方法，具體而言，該方法包括步驟，(I)抽提血漿總RNA，(2)利用微陣列結(jié)束檢測總RNA中特定miRNA的表達譜?？梢园凑毡绢I(lǐng)域的常規(guī)方法操作。所述的統(tǒng)計方法使用logistic回歸分析結(jié)合miRNA SVM預(yù)測模型進行類別判斷。所述的統(tǒng)計方法包括下列各項中的一個或者幾個(l)miRNA表達譜通過OneR方法對每個miRNA評分，(2)支持向量機(Support Vector Machine)作為預(yù)測引擎進行類別判斷，(3)特征值遞增分析法(IFS)和留一法交叉驗證優(yōu)化入選miRNA的數(shù)量。利用本發(fā)明的miRNA表達譜分析了 66例接受長效干擾素治療的HBV患者樣本，其敏感度為73. 3%和特異度75%。此miRNA譜由11個特異的核苷酸序列組成，其表達在無應(yīng)答和快速應(yīng)答組中有顯著差異。本發(fā)明進一步在28例接受普通干擾素治療的HBV患者中驗證了此預(yù)測模型，并取得71. 4%的準(zhǔn)確度。 本發(fā)明提供了一種miRNA表達譜，能夠以較高準(zhǔn)確度預(yù)測預(yù)測干擾素治療慢性乙型肝炎療效。與其他已知與療效相關(guān)因素相比，此表達譜是一個獨立的預(yù)測因素。此表達譜與HBV耐藥突變分析結(jié)合將有助于個體化治療方案的開展，最終降低治療費用并提高完全應(yīng)答的比例。相應(yīng)的檢測方法方便、快速，成本較低。本發(fā)明同時還提供了高效、低廉的相應(yīng)的檢測試劑盒和芯片。


圖I.優(yōu)化能夠預(yù)測干擾素療效的miRNA譜流程圖。圖2.干擾素療效預(yù)測的IFS(遞增特征值)曲線圖。X軸，特征值的數(shù)量，Y軸，去一交互檢驗準(zhǔn)確度。在選取10個特征值時到達準(zhǔn)確度達到最高。圖3. A.各臨床參數(shù)與miRNA預(yù)測系統(tǒng)的優(yōu)勢比；B.單獨miRNA模型(上圖)和加入ALT后(下圖)logistic回歸模型的分類圖。
具體實施例方式實施例I :miRNA表達譜的檢測 一·實驗材料
本發(fā)明從94例接受長效干擾素和普通干擾素的慢性乙肝患者中獲得血漿和血清樣本。本研究通過了倫理委員會的審核，所有病人都簽署了知情同意書。訓(xùn)練集包括66例接受EG-IFN a 2a (180yg/周)或PEG-1FN a 2b (100 μ g/周)的HBV患者，測試集中包括28例接受普通干擾素(IFN_a2b或IFN-a lb，3_5MU/qod)的HBV患者。入組病人的基本臨床數(shù)據(jù)表I所示，其中81.9%為e抗原陽性，平均病毒載量為7. 05 Iog10拷貝/毫升。入組排除標(biāo)準(zhǔn)入組的HBV患者在開始治療前6個月未接受核苷類似物或干擾素治療，病毒載量在5 X IO4拷貝/ml以上，肝臟谷丙轉(zhuǎn)氨酶不正常(>1.0 ULN).排除標(biāo)準(zhǔn)包括HIV或HCV共感染。所有病人都檢測了 HBV表面抗原，e抗原(雅培AXSYM HBsAg (正常值O - 2S/N) and HBe 2. O MEIA Kit (正常值O - I. 0S/C0)，病毒載量通過定量PCR檢測(匹基生物)?？焖賾?yīng)答定義為在治療開始后12周HBVDNA有大于21og的降低，小于21og的降低定義為無應(yīng)答。
二.實驗方法
RNA抽提和miRNA芯片
使用mirVana PARIS (Ambion, Austin, TX)試劑盒,從400 μ I血衆(zhòng)樣本中抽取總RNA。RNA濃度通過NanoDrop 1000 光譜儀定量(NanoDrop Technologies, Waltham, MA)。從福爾馬林固定石臘包埋標(biāo)本(FFPE)中抽提RNA使用Qiagen RNAeasy FFPE試劑盒。簡要操作步驟如下用手術(shù)刀將FFPE標(biāo)本從載玻片上刮下，并用二甲苯脫蠟，離心去除二甲苯后，加入100%乙醇去除殘留二甲苯。經(jīng)全速離心和空氣干燥后，F(xiàn)FPE標(biāo)本通過的蛋白酶K分別在55°C消化15分鐘，80°C消化15分鐘。經(jīng)過gDNA離心柱去除基因組DNA后，樣本再經(jīng)過RNeasy柱，洗滌兩遍后用無核酸酶水洗脫。
miRNA芯片檢測
本發(fā)明使用人miRNA芯片(Agilent Technologies, Santa Clara, CA)比較了 94份血漿標(biāo)本和13份FFPE標(biāo)本.此芯片包含Sanger數(shù)據(jù)庫V12. O 851種人類miRNA。將樣本總RNA通過Cy3標(biāo)記,并與芯片雜交，經(jīng)洗漆后芯片通過G2505C ((Agilent Technologies,Santa Clara, CA)掃描儀進行掃描。標(biāo)記和雜交過程都按照agilent miRNA芯片系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)操作進行。芯片圖像信息通過掃描軟件Rev. 5. O (Agilent Technologies, SantaClara, CA)進行分析,轉(zhuǎn)化為強度信息。通過背景去除,芯片信號導(dǎo)出到GeneSpring GXlO軟件(Agilent Technologies, Santa Clara, CA)進行標(biāo)準(zhǔn)化再進行進一步分析。
三.實驗結(jié)果
對94例接受干擾素治療的HBV病人進行了 miRNA表達譜檢測。本發(fā)明區(qū)分不同初始病毒學(xué)應(yīng)答的策略如圖I所示。一共66例信息充分的病例入組為訓(xùn)練組，通過將miRNA表達譜經(jīng)訓(xùn)練后模型在28例的測試病例中進行驗證。兩組病人的基本臨床水平相似(表I )，兩組的初始應(yīng)答率分別為45. 5%和35.7% (P值0.4948，F(xiàn)isher’ s exact test)。 表I.病人的臨床基本數(shù)據(jù)。
權(quán)利要求
1.一種預(yù)測干擾素治療慢性乙型肝炎療效的血漿miRNA譜，其特征在于，該miRNA譜包括SEQ ID NO 1-11中一個或多個miRNA。
2.一種預(yù)測干擾素治療慢性乙型肝炎療效的試劑盒，其特征在于，該試劑盒含有針對SEQ ID NO 1-11中一個或多個miRNA特異性探針核苷酸。
3.一種預(yù)測干擾素治療慢性乙型肝炎療效的芯片，其特征在于，該芯片含有針對SEQID NO 1-11中一個或多個miRNA特異性探針核苷酸。
4.如權(quán)利要求3所述的芯片，其特征在于，該芯片含有針對SEQID NO 1_11的miRNA特異性探針核苷酸。
5.一種預(yù)測干擾素治療慢性乙型肝炎療效的方法，其特征在于，在使用干擾素前，檢測血漿、血清樣品中SEQ ID NO 1-11中一個或多個miRNA的表達水平，與治療前ALT水平比較，預(yù)測干擾素療效。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述miRNA中至少一種的表達水平高于或者低于已知的標(biāo)準(zhǔn)水平。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，ALT水平高于或者低于已知的標(biāo)準(zhǔn)水平。
8.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，該方法包括步驟(I)血漿、血清樣本小RNA的抽提，(2)核酸樣本與具有如SEQ ID No. 1-11中一個或多個miRNA特異性探針的芯片進行雜交，(3)對雜交信號與對照樣本的雜交結(jié)果進行比較。
9.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，利用統(tǒng)計方法分析樣品中表達水平與標(biāo)準(zhǔn)水平差異的顯著性。
10.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的統(tǒng)計方法包括(DmiRNA表達譜通過OneR方法對每個miRNA評分，(2)支持向量機作為預(yù)測引擎進行類別判斷，(3)特征值遞增分析法和留一法交叉驗證優(yōu)化入選miRNA的數(shù)量。
11.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的統(tǒng)計方法使用logistic回歸分析結(jié)合miRNA SVM預(yù)測模型進行類別判斷。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明提供了一種預(yù)測干擾素治療慢性乙型肝炎療效的血漿miRNA譜及檢測試劑盒，該miRNA譜包括SEQIDNO1-11中一個或多個miRNA。同時提供了相應(yīng)的、高效、低廉的試劑盒和檢測芯片以及檢測方法。本發(fā)明檢測血漿、血清中miRNA水平，適合應(yīng)用于臨床判斷干擾素治療的有效性。與其他已知與療效相關(guān)因素相比，此表達譜是一個獨立的預(yù)測因素。將此預(yù)測譜與病人治療前ALT水平結(jié)合可獲得更高的預(yù)測準(zhǔn)確率。此表達譜與HBV耐藥突變分析結(jié)合將有助于個體化治療方案的開展，最終降低治療費用并提高完全應(yīng)答的比例。
文檔編號C12N15/11GK102643803SQ20111004146
公開日2012年8月22日 申請日期2011年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月21日
發(fā)明者吳景迪, 張占卿, 張小楠, 張欣欣, 張繼明, 王介非, 袁正宏, 鄔敏, 陳曉蓉, 陳良, 黃濤 申請人:上海市公共衛(wèi)生臨床中心