專利名稱：超聲波輔助花粉介導(dǎo)植物轉(zhuǎn)基因方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種改良的植物花粉介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因方法。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)基因技術(shù)能夠使優(yōu)良基因跨物種交流，從而實現(xiàn)對農(nóng)作物的品質(zhì)和產(chǎn)量等性狀 進(jìn)行定向、精確的改良。轉(zhuǎn)基因作物在產(chǎn)量、抗逆性和營養(yǎng)品質(zhì)等方面較傳統(tǒng)作物有顯著改 進(jìn)，還能大大降低生產(chǎn)成本，減少農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的環(huán)境污染。但目前大面積應(yīng)用到農(nóng)業(yè)生產(chǎn) 中的轉(zhuǎn)基因作物品種只有玉米、大豆、油菜、棉花、番茄等少數(shù)幾種作物，對絕大多數(shù)植物而 言，轉(zhuǎn)基因技術(shù)還只停留在實驗室階段。目前植物轉(zhuǎn)基因研究主要采用的兩種經(jīng)典方法，一 是農(nóng)桿菌介導(dǎo)法；二是基因槍轟擊法。這兩種方法都需要經(jīng)過冗長繁瑣的植物組培過程， 需要花費(fèi)大量的人力、物力、財力和時間。一些植物種或品種的組織培養(yǎng)再生困難而使得這 兩種方法具有很大基因型依賴性，因而受到很大的局限。同時由于植物組織培養(yǎng)過程中易 造成體細(xì)胞變異、再生苗移栽過程中夭亡等，使本已不高的轉(zhuǎn)化率又大打折扣，這些缺陷都 大大限制了植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的廣泛應(yīng)用。其他一些植物轉(zhuǎn)基因方法，如，脂質(zhì)體法、PEG法、 電激法、顯微注射法、超聲波法、離子束介導(dǎo)法、激光微束穿孔法、碳化硅纖維法等，雖然都 有成功的報道，但均因操作繁瑣或效率較低等原因而很少有人使用；因此簡化植物轉(zhuǎn)化方 法是不少相關(guān)研究人員的努力方向。由周光宇提出的花粉管通道法已在我國得到了一定的 應(yīng)用，并用該法培育出一些轉(zhuǎn)基因株系或品種。該法的最大優(yōu)點是不依賴組織培養(yǎng)和植株 再生過程，技術(shù)簡單，不需要裝備精良的實驗室，常規(guī)育種工作者易于掌握。其主要缺點是 轉(zhuǎn)化效率低，后期需要對大量的轉(zhuǎn)化處理后代進(jìn)行篩選。迄今，植物基因工程的“瓶頸”問 題仍然是植物轉(zhuǎn)基因方法。孫毅等發(fā)明了一種“利用超聲波處理花粉介導(dǎo)植物基因轉(zhuǎn)化方 法”(中國專利號99121152. 9)，該發(fā)明使用超聲波細(xì)胞粉碎儀以200—300W功率的超聲波 處理花粉懸浮液，花粉為新鮮花粉，溶液為5—15 %蔗糖溶液加入不低于40 μ g/L外源DNA， 超聲波每次處理5秒，間隔10秒，共處理5—8次，收集超聲波處理后的花粉授于植物柱頭 上，并從受體上收獲種子，在后代中篩選轉(zhuǎn)化植株。該方法不需經(jīng)過冗長繁瑣的組織培養(yǎng)過 程，具有簡便、有效、快速和經(jīng)濟(jì)等特點，因此實用性強(qiáng)，能夠與常規(guī)育種方法有機(jī)結(jié)合被廣 大作物育種工作者直接應(yīng)用。但該方法的主要缺點之一是授粉后結(jié)實率較低，這顯然是由 于經(jīng)過超聲波處理的花粉大多數(shù)喪失了生活力，無法正常完成受精過程。因此，提高結(jié)實率 是使該方法具有更廣泛應(yīng)用前景的關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是克服上述已有技術(shù)的不足，提供一種可顯著提高超聲波處理花粉授 粉后植株的結(jié)實率、進(jìn)而提高每次處理獲得的轉(zhuǎn)化體數(shù)的超聲波輔助花粉介導(dǎo)植物轉(zhuǎn)基因 方法。實驗發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)過通氣和低溫預(yù)處理的蔗糖溶液及整個處理花粉過程的冰浴操作 可以有更高比例的花粉粒保持活力，因而將處理花粉授到植物柱頭(玉米花絲)上，可以獲
3得更高的結(jié)實率。而且采集新鮮花粉，低溫(0—4°C)干燥條件下保存以及在2 48小時 之間使用均有利于保持花粉活力。本方法是以攜帶外源基因片段的農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒、大腸桿菌質(zhì)粒或其它DNA載體為 基因供體，以植物的雄配子體花粉為受體，在植物傳粉受精過程中通過超聲波輔助處理花 粉介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移。利用超聲波的瞬間釋放高能和空化作用，先將外源DNA導(dǎo)入植物花粉中， 之后再隨著花粉管的生長進(jìn)入到植物雌配子體胚囊中，并進(jìn)而參與合子的形成，最終整合 到目標(biāo)植物基因組中。取新鮮花粉在經(jīng)過通氣和低溫處理的、5_50%的蔗糖溶液中與DNA 片段混合，通過超聲波輔助作用使外源基因進(jìn)入花粉中；然后將花粉懸浮液略微靜置后倒 掉上清液，進(jìn)而用細(xì)刷或毛筆將沉淀的處理花粉授到植物雌蕊柱頭上，并在籽粒成熟時予 以收獲。在隨后的生長季將轉(zhuǎn)化處理花粉授粉后收獲的種子播種，通過對萌發(fā)種子和幼苗 的篩選、對成苗株樣本DNA的PCR擴(kuò)增及Southern雜交，進(jìn)一步確定轉(zhuǎn)化株。在加入花粉和外源DNA片段前，需要對蔗糖溶液進(jìn)行通氣和低溫預(yù)處理，使用空 氣泵給蔗糖溶液連續(xù)通氣20分鐘以上，使蔗糖溶液中的空氣(氧)含量達(dá)到飽和狀態(tài)，同時 將蔗糖溶液置于0—4°C冰浴或冰箱中預(yù)處理；加入花粉和外源DNA片段后，形成花粉懸浮 液？，并在以后的操作過程中始終將花粉懸浮液置于0—4°C冰浴中。對花粉懸浮液進(jìn)行超 聲波處理，需要在加入外源DNA前、后分別對花粉懸浮液進(jìn)行超聲波處理，處理功率強(qiáng)度為 50—500W,時間為5秒一2分鐘?？諝獗每梢圆捎檬惺鄣男⌒退逑溆每諝獗?。新鮮花粉是在0—4°C保存5天以內(nèi)的花粉。將處理花粉授到植物柱頭上，并在籽 粒成熟時予以收獲。在隨后的生長季，將轉(zhuǎn)化處理花粉授粉后得到的種子播種，并根據(jù)植物 轉(zhuǎn)化載體上攜帶的篩選標(biāo)記基因利用篩選劑對萌發(fā)種子及其長出的幼苗的進(jìn)行初步篩選， 所用篩選劑可以是但不局限于為抗生素或除草劑?；蛘唠S后根據(jù)插入的外源DNA序列利用 PCR擴(kuò)增或Southern雜交方法對成苗株樣本DNA進(jìn)行篩選，并在隨后的世代中對篩選到的 轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行連續(xù)自交和篩選，直至獲得穩(wěn)定純合的轉(zhuǎn)基因品系。本發(fā)明是經(jīng)過改良的超聲波輔助花粉介導(dǎo)植物轉(zhuǎn)基因方法，可以顯著提高授粉植 株結(jié)實率，進(jìn)而提高每次處理獲得的轉(zhuǎn)化體數(shù)。該方法可將外源基因直接轉(zhuǎn)移到后代種子 基因組中，避開了繁冗、操作要求高的植物組織培養(yǎng)過程，大大縮短獲得轉(zhuǎn)化種子的周期 性。具有后代植株中基因轉(zhuǎn)化效率高、重復(fù)性好、發(fā)生嵌合體幾率少、超聲波設(shè)備便宜和無 物種及基因型依賴性、適用范圍廣等特點，可以提高超聲波輔助植物花粉介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因方法 的結(jié)實率，進(jìn)而提高每次處理獲得的轉(zhuǎn)化體數(shù)，節(jié)省人力和物力，有利于生產(chǎn)實踐的應(yīng)用。
具體實施例方式下面是本發(fā)明為改良原方法應(yīng)用于玉米基因轉(zhuǎn)化的具體實例
花粉喪失活力的原因除超聲波作用損傷不可避免外，花粉在懸浮液中也有一定比例的 損傷，其原因一是花粉破裂，二是大部分不破裂的花粉也喪失了萌發(fā)能力，因此從花粉的懸 浮條件入手提高花粉的生活力。懸浮液的三個主要因素為蔗糖濃度(滲透壓)、溫度和空氣 (氧氣)含量。針對以上因素，采用玉米品種鄭58做了下列試驗，結(jié)果見表1 表8 實施例1 玉米花粉在懸浮液中浸泡時間對花粉體外萌發(fā)有顯著影響。表1玉米花粉在懸浮液中浸泡時間對花粉體外萌發(fā)的影響
權(quán)利要求
1.一種超聲波輔助花粉介導(dǎo)植物轉(zhuǎn)基因方法，其特征是以攜帶外源基因片段的農(nóng)桿菌 Ti質(zhì)粒、大腸桿菌質(zhì)粒或其它DNA載體為基因供體，以植物的雄配子體花粉為受體，在經(jīng)過 通氣和低溫處理的濃度為5—50%的蔗糖溶液中使花粉與DNA片段混合，通過超聲波輔助作 用使外源基因轉(zhuǎn)移到受體花粉中；然后將花粉懸浮液略微靜置后倒掉上清液，將并用細(xì)刷 將沉淀的處理花粉授到植物柱頭上，并在籽粒成熟時予以收獲；在隨后的生長季將轉(zhuǎn)化處 理花粉授粉后收獲的種子播種，通過對萌發(fā)種子和幼苗的篩選，對成苗株樣本DNA的PCR擴(kuò) 增及Southern雜交，進(jìn)一步確定轉(zhuǎn)化株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的超聲波輔助花粉介導(dǎo)植物轉(zhuǎn)基因方法，其特征是所述的花粉 是在0— 4 °C保存5天以內(nèi)的花粉。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的超聲波輔助花粉介導(dǎo)植物轉(zhuǎn)基因方法，其特征是在加入花粉 和外源DNA片段前對蔗糖溶液進(jìn)行通氣和低溫處理，使用空氣泵給蔗糖溶液連續(xù)通氣20分 鐘以上，使蔗糖溶液中的空氣含量達(dá)到飽和狀態(tài)，同時將蔗糖溶液置于0—4°C冰浴或冰箱 中預(yù)處理；加入花粉和外源DNA片段后，形成花粉懸浮液？，并在以后的操作過程中始終將 該花粉懸浮液置于0—4°C冰浴中。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的超聲波輔助花粉介導(dǎo)植物轉(zhuǎn)基因方法，其特征是在加入外源 DNA前后，分別對花粉懸浮液進(jìn)行超聲波處理，所用超聲波功率為50—500W，每次處理時間 為5秒一2分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的超聲波輔助花粉介導(dǎo)植物轉(zhuǎn)基因方法，其特征是根據(jù)植物轉(zhuǎn) 化載體上攜帶的篩選標(biāo)記基因利用篩選劑進(jìn)行篩選。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的超聲波輔助花粉介導(dǎo)植物轉(zhuǎn)基因方法，其特征是根據(jù)插入的 外源DNA序列利用PCR擴(kuò)增或Southern雜交方法進(jìn)行篩選。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的超聲波輔助花粉介導(dǎo)植物轉(zhuǎn)基因方法，其特征是對篩選到的 轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行連續(xù)自交和篩選，直至獲得穩(wěn)定純合的轉(zhuǎn)基因品系。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的超聲波輔助花粉介導(dǎo)植物轉(zhuǎn)基因方法，其特征是所用篩選劑 為抗生素或除草劑。
全文摘要
一種改良的超聲波輔助花粉介導(dǎo)植物轉(zhuǎn)基因方法，目的目的是顯著提高超聲波處理花粉授粉后植株的結(jié)實率，進(jìn)而提高每次處理獲得的轉(zhuǎn)化體數(shù)；本發(fā)明方法以攜帶外源基因片段的農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒、大腸桿菌質(zhì)?；蚱渌麯NA載體為基因供體，以植物花粉為受體，在經(jīng)過通氣和低溫處理的5—50%的蔗糖溶液中使花粉與外源DNA混合，通過超聲波輔助作用使外源基因轉(zhuǎn)移到受體花粉中；然后將處理花粉授到植物柱頭上，并在籽粒成熟時予以收獲；在隨后的生長季將轉(zhuǎn)化處理花粉授粉后收獲的種子播種，并通過對萌發(fā)種子和幼苗的篩選，對成苗株樣本DNA的PCR擴(kuò)增及Southern雜交，進(jìn)一步確定轉(zhuǎn)化株。本發(fā)明方法不需進(jìn)行組織培養(yǎng)，沒有物種及基因型依賴性，能縮短轉(zhuǎn)基因育種年限并節(jié)省人力和物力。
文檔編號C12N15/82GK102127567SQ20111004148
公開日2011年7月20日 申請日期2011年2月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月18日
發(fā)明者孫毅, 崔貴梅, 張麗君, 張婷婷, 張紅梅, 杜建中, 楊利艷, 王亦學(xué), 王銘, 郝曜山 申請人:山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心