專利名稱：煙草腺毛cDNA表達(dá)譜芯片及其制備與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因芯片領(lǐng)域，具體涉及一種煙草腺毛CDNA表達(dá)譜芯片及其制備與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物腺毛作為植物表皮細(xì)胞的特化結(jié)構(gòu)，因其在植物病蟲(chóng)害防御、抵抗逆境脅迫以及次生產(chǎn)物合成等過(guò)程中所起的重要作用而倍受關(guān)注。隨著功能基因組學(xué)技術(shù)的進(jìn)步， 利用芯片技術(shù)研究植物腺毛的發(fā)育、代謝和分泌的分子機(jī)制逐漸成為植物生物學(xué)研究領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)。擬南芥因其完整的基因組信息和完善的芯片產(chǎn)品，其腺毛的分子生物學(xué)研究存在諸多有利條件。但由于擬南芥屬于典型非分泌型腺毛，因而這些有利條件無(wú)法在腺毛物質(zhì)代謝和分泌領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。煙草腺毛屬于典型的分泌型腺毛，其主要分泌物是糖脂和二萜類化合物，與煙葉的品質(zhì)和抗性密切相關(guān)。目前關(guān)于煙草腺毛的研究多集中在腺毛類型、密度、組織結(jié)構(gòu)、化學(xué)成分等方面，而對(duì)于煙草腺毛的生長(zhǎng)發(fā)育及物質(zhì)代謝的分子機(jī)制還缺乏深入研究。雖有一些利用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)煙草腺毛的特異基因進(jìn)行克隆和表達(dá)的報(bào)道，但目前對(duì)煙草腺毛的基因表達(dá)模式進(jìn)行全景式分析仍缺乏有效的途徑。這與煙草基因組龐大，測(cè)序尚未完成，Genebank中煙草基因信息缺乏，商業(yè)化煙草基因芯片不完善有關(guān)。目前，市場(chǎng)上出現(xiàn)的 Agilent和Nibergen的煙草芯片主要是根據(jù)美國(guó)及歐洲煙草基因組計(jì)劃中的EST序列進(jìn)行設(shè)計(jì)的。這些芯片缺乏相應(yīng)的注釋信息，同時(shí)也缺乏腺毛中特有的EST序列，因而不適用于煙草腺毛的基因表達(dá)譜研究。目前關(guān)于煙草腺毛基因表達(dá)譜的研究報(bào)道，主要是采用cDNA 文庫(kù)隨機(jī)測(cè)序技術(shù)方法來(lái)完成的。例如最近發(fā)表的“鉻對(duì)煙草腺毛基因表達(dá)的影響研究” (Harada, 2010)該文章作者建立了兩個(gè)腺毛cDNA文庫(kù)(處理和對(duì)照)，并對(duì)兩個(gè)文庫(kù)分別進(jìn)行隨機(jī)測(cè)序，通過(guò)對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)和分析，找到處理和對(duì)照之間的基因表達(dá)差異。這種方法的主要缺點(diǎn)是要對(duì)不同cDNA文庫(kù)進(jìn)行分別測(cè)序，因而測(cè)序成本高，不適用于對(duì)大量樣品進(jìn)行研究。表達(dá)i普基因芯片(DNA microarrays for geneexpression profiles)是基因芯片的一種，對(duì)不同細(xì)胞或組織來(lái)源的mRNA在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中分別用不同顏色的熒光標(biāo)記成探針(目前常用Cy3 - dUTP(綠色)標(biāo)記對(duì)照組rnRNA，Cy5 一 dUTP(紅色)標(biāo)記樣品組 mRNA)，探針混合后與芯片或微陣列板上的基因進(jìn)行嚴(yán)格雜交，再通過(guò)不同波長(zhǎng)的熒光掃描芯片，將掃描所得每一點(diǎn)熒光信號(hào)值自動(dòng)輸入計(jì)算機(jī)并進(jìn)行信息處理，給出每個(gè)點(diǎn)在不同波長(zhǎng)下的熒光強(qiáng)度值及其比值(ratio值)，同時(shí)計(jì)算機(jī)還給出直觀的顯色圖。在樣品中呈高表達(dá)的基因其雜交點(diǎn)呈紅色，相反，在對(duì)照組中高表達(dá)的基因其雜交點(diǎn)呈綠色，在兩組中表達(dá)水平相當(dāng)?shù)娘@黃色，這些信號(hào)就代表了樣品中基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況?；虮磉_(dá)譜可直接檢測(cè)mRNA的種類及豐度，可以同時(shí)分析上萬(wàn)個(gè)基因的表達(dá)變化，來(lái)揭示基因之間表達(dá)變化的相互關(guān)系。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種煙草腺毛cDNA表達(dá)譜芯片，可利用該芯片進(jìn)行腺毛基因表達(dá)研究，從而鑒定煙草腺毛特異基因的表達(dá)，同時(shí)還給出了煙草腺毛cDNA 表達(dá)譜芯片的制備與應(yīng)用方法。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是
一種煙草腺毛cDNA表達(dá)譜芯片，包括載片，在其平面上包覆有帶正電荷的膜，在該膜的表層設(shè)有點(diǎn)陣，點(diǎn)陣上排布樣點(diǎn)，其特征在于，在該點(diǎn)陣上排布有含來(lái)源于煙草腺毛cDNA 克隆的PCR產(chǎn)物，且含有陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照樣點(diǎn)。所述所述煙草腺毛cDNA克隆的PCR產(chǎn)物是通過(guò)以下方法制得
(1)腺毛總RNA提取挑選發(fā)育良好、健康的煙草葉片，采用凍刷法收集葉面腺毛，凍純存后提取煙草腺毛總RNA ；
(2)cDNA文庫(kù)構(gòu)建采用SMART法構(gòu)建出煙草腺毛的全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)；
(3)cDNA文庫(kù)隨機(jī)測(cè)序及EST文庫(kù)建立隨機(jī)挑選cDNA克隆，利用ADI3700進(jìn)行5，端測(cè)序，得到煙草有效序列，再采用lOObp，90%的原則對(duì)其歸并unigene，得到unigene數(shù)，通過(guò)Blastx對(duì)EST進(jìn)行序列比對(duì)和功能注釋，挑出ESTs對(duì)應(yīng)克隆，以M13+和M13-為通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用異丙醇純化法對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。所述樣點(diǎn)為矩陣排布，單個(gè)矩陣排布76X114個(gè)樣點(diǎn)，每個(gè)樣點(diǎn)在芯片矩陣內(nèi)設(shè)
置3次重復(fù)。所述陽(yáng)性對(duì)照樣點(diǎn)為煙草actin基因。所述陰性對(duì)照樣點(diǎn)為與煙草無(wú)同源性的人基因及空白點(diǎn)樣稀釋液。
上述煙草腺毛cDNA表達(dá)譜芯片的制備方法如下
(1)腺毛總RNA提取挑選發(fā)育良好、健康的煙草葉片，采用凍刷法收集葉面腺毛，凍純存后提取煙草腺毛總RNA ；
(2)cDNA文庫(kù)構(gòu)建采用SMART法構(gòu)建出煙草腺毛的全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)；
(3)cDNA文庫(kù)隨機(jī)測(cè)序及EST文庫(kù)建立隨機(jī)挑選cDNA克隆，利用ADI3700進(jìn)行5，端測(cè)序，得到煙草有效序列，再采用lOObp，90%的原則對(duì)其歸并unigene，得到unigene數(shù)，通過(guò)Blastx對(duì)EST進(jìn)行序列比對(duì)和功能注釋，挑出ESTs對(duì)應(yīng)克隆，以M13+和M13-為通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用異丙醇純化法對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化；
(4)點(diǎn)制芯片將上步所得PCR產(chǎn)物溶于點(diǎn)樣稀釋液中，再以點(diǎn)樣儀將其按點(diǎn)樣方案點(diǎn)制于點(diǎn)樣基片上；點(diǎn)樣完成的芯片置點(diǎn)樣儀中進(jìn)行水合、干燥，再經(jīng)封閉液封閉、水沖洗、室溫干燥后放4°C保存?zhèn)溆谩?上述煙草腺毛cDNA表達(dá)譜芯片在篩選煙草腺毛特異表達(dá)基因上的應(yīng)用，具體包括以下步驟
(1)RNA提取和純化采用Trizol —步法分別提取煙草腺毛和去腺毛葉片總RNA ；
(2)熒光探針標(biāo)記逆轉(zhuǎn)錄標(biāo)記cDNA探針并純化，在一鏈合成中摻入熒光標(biāo)記dCTP，用 Cy5-dCTP標(biāo)記腺毛樣品，Cy3-dCTP標(biāo)記去腺毛葉片樣品，同時(shí)進(jìn)行反標(biāo)，DNA純化后真空抽干，備用；
(3)芯片雜交采用常規(guī)方法進(jìn)行芯片雜交；
(4)數(shù)據(jù)收集用激光掃描儀掃描雜交后的芯片，并對(duì)芯片所獲得的原始信號(hào)進(jìn)行整體校準(zhǔn)和數(shù)據(jù)均一化處理，計(jì)算每個(gè)基因點(diǎn)在本試驗(yàn)中的表達(dá)差異值Rati0，Rati0 > 2. 0為上調(diào)表達(dá)，Ratio ( 0. 5為下調(diào)表達(dá)，由此篩選出差異表達(dá)基因。本發(fā)明具有積極有益的效果
1.本發(fā)明制備出的芯片具有高通量、高精確性、特異性強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，因而可以一次檢測(cè)大量基因的表達(dá)模式，并可在在相同試驗(yàn)條件下，綜合分析多個(gè)樣品的基因表達(dá)變化規(guī)律， 適用于煙草腺毛與栽培措施、環(huán)境脅迫等關(guān)系方面的研究，與cDNA測(cè)序手段相比，具有高效、經(jīng)濟(jì)、快速的特點(diǎn)。2.設(shè)立了可檢測(cè)的質(zhì)量控制系統(tǒng)，如陰性、陽(yáng)性、空白對(duì)照，保證了檢測(cè)結(jié)果的特異性，可達(dá)到高效、靈敏、準(zhǔn)確、高通量平行檢測(cè)的效果。3.本發(fā)明的煙草腺毛cDNA表達(dá)譜芯片建立在煙草腺毛cDNA文庫(kù)基礎(chǔ)之上，并對(duì)大部分序列進(jìn)行了功能注釋，與其它煙草EST來(lái)源的芯片相比，在候選基因方面具有針對(duì)性、精確性和可釋性，并且提高了分離到腺毛中特異表達(dá)的低豐度基因可能性，是煙草腺毛基因表達(dá)研究和新基因挖掘的有力工具。


圖1為煙草腺毛cDNA表達(dá)譜芯片掃描圖。圖2為本發(fā)明基因芯片表達(dá)結(jié)果與RT-PCR結(jié)果比較圖譜。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下述實(shí)施例中的試驗(yàn)方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法；下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料及試劑，如無(wú)特別說(shuō)明，均購(gòu)自常規(guī)生化試齊Ll商店。實(shí)施例1 一種煙草腺毛cDNA表達(dá)譜芯片，包括載片，在其平面上包覆有帶正電荷的膜，在該膜的表層設(shè)有點(diǎn)陣，點(diǎn)陣上排布樣點(diǎn)，在該點(diǎn)陣上排布有含來(lái)源于煙草腺毛 2830個(gè)cDNA克隆的PCR產(chǎn)物，其長(zhǎng)度在400 1000 bp,并含有陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照；樣點(diǎn)為矩陣排布，單個(gè)矩陣排布76X114個(gè)樣點(diǎn)，每個(gè)樣點(diǎn)在芯片矩陣內(nèi)設(shè)置3次重復(fù)。陽(yáng)性對(duì)照為煙草actin基因，陰性對(duì)參照是與煙草無(wú)同源性的人基因及空白點(diǎn)樣稀釋液。上述煙草腺毛cDNA表達(dá)譜芯片的制備方法，具體包括以下步驟 (1)煙草腺毛的收集和腺毛總RNA提取
以煙草品種為材料，挑選發(fā)育良好、健康葉片，采用凍刷法(Erming，2001)進(jìn)行葉面腺毛的收集，收集前用清水沖洗所選葉片。葉片在液氮中凍存五分鐘，選用硬度適中的鬃毛刷子，沿主脈從葉基向葉尖方向刷取腺毛于凍存管里，液氮罐中保存。腺毛總RNA提取按照GIBCO BRL公司的1Trizol reagent說(shuō)明書上的操作規(guī)程進(jìn)行。將0. 56g腺毛組織放入碾缽，在液氮中研磨至粉末狀，轉(zhuǎn)至勻漿管，加入5. 5 mL Trizol勻漿；氯仿抽提，異丙醇沉淀，75%乙醇洗滌沉淀晾干，MilliQ水溶解沉淀，紫外分析及電泳檢測(cè)后備用。(2)煙草葉面腺毛cDNA文庫(kù)構(gòu)建
采用 SMART (Switching Mechanism At 5，end of RNA Transcript )技術(shù)構(gòu)建煙草腺毛的全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)。LD PCR法合成雙鏈cDNA，按照試劑盒(Clontech，SMART cDNA Library Construction Kit，634901)說(shuō)明添加試劑和引物，反應(yīng)在已預(yù)熱到95°C的HYBAID PCREXPRESS PCR儀上進(jìn)行，95°C變性15 sec，68°C延長(zhǎng)6 min，共30個(gè)循環(huán)。取反應(yīng)產(chǎn)物5 mL 在1. 瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)。吸取50 mL擴(kuò)增的dscDNA (2 ;3mg)至0. 5 mL滅菌的離心管中，加入蛋白酶 K，經(jīng)酚氯仿異戊醇抽提、乙醇沉淀后，用限制性內(nèi)切酶分Y I酶切，然后通過(guò)CHROMA SPIN-400柱子分離純化，依次收集經(jīng)分離純化的cDNA共10管，1. 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) cDNA含量及片段大小。^pBluescript II SK載體進(jìn)行改造，將EcoR I和Not I之間的序列改造為Sfi I A和Sfi I B接頭序列。酶切以后，將分離純化后的cDNA定向連接到該載體上(Sfi I A —Sfi I B)。連接反應(yīng)按試劑盒(Fermentas，T4 DNA Ligase, #EL0012)說(shuō)明進(jìn)行，cDNA 與載體濃度按照1 3進(jìn)行混合。取200 mL感受態(tài)宿主菌(DH-5 α)至滅菌的50mL離心管中，加入上述IuL連接液，輕輕混勻后冰浴45 min, 42 °C水浴熱激90 sec,加入2 mL LB培養(yǎng)基，37 "C培養(yǎng)45min后，3000rpm 離心10 min收集菌體，250 mL LB培養(yǎng)基重懸。取200 mL菌液涂布于含有Apr-IPTG/x-gal的LB固體培養(yǎng)基，37 V過(guò)夜， 計(jì)算菌落數(shù)及藍(lán)白斑比例，并根據(jù)菌落數(shù)計(jì)算文庫(kù)的重組率、庫(kù)容量和文庫(kù)滴度
ο為了對(duì)文庫(kù)進(jìn)行快速鑒定，隨即選取M個(gè)克隆進(jìn)行5’末端測(cè)序，并對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行unigene歸并。在得到的24條有效序列中，有23條為unigene，unigene比例為95. 8%。 同時(shí)對(duì)序列進(jìn)行全長(zhǎng)分析，在M條序列中有21條序列有相關(guān)同源信息，其中14條為全長(zhǎng)， 完整性比率為66. 7%。說(shuō)明所構(gòu)建的煙草腺毛cDNA文庫(kù)具有較高的質(zhì)量。煙草葉面腺毛cDNA文庫(kù)構(gòu)建方法還可參見(jiàn)文獻(xiàn)“煙草腺毛全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)的構(gòu)建” (廈門大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2006年11月，第45卷第6期，859-861)。(3) cDNA文庫(kù)隨機(jī)測(cè)序及EST文庫(kù)建立
隨機(jī)挑選cDNA克隆，利用ADI3700進(jìn)行5，端測(cè)序。根據(jù)phred軟件QClO標(biāo)準(zhǔn)、載體屏蔽(參數(shù)為-minmatch 14 -penalty -2 - minscore 30)，取長(zhǎng)度嘗500，得到煙草有效序列5139條。再采用lOObp，90%的原則對(duì)這5139條序列歸并unigene，得到unigene數(shù)為觀30條。通過(guò)Blastx對(duì)EST進(jìn)行序列比對(duì)和功能注釋。結(jié)果發(fā)現(xiàn)觀31個(gè)unigene中，987 個(gè)(34. 9 %)無(wú)法找到匹配序列，其功能未知；將其它1844(65. 1 %)個(gè)基因提交到amigo網(wǎng)站(http://amigo.geneontology.org)進(jìn)行功能注釋和分類，發(fā)現(xiàn)其中61.5% ESTs編碼與代謝相關(guān)的蛋白，與生物調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)運(yùn)、刺激反應(yīng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、發(fā)育、生長(zhǎng)相關(guān)的序列分別占 16. 8%、16· 1%、12· 9%、6· 5%、4· 4% 和 0. 6%。(4)點(diǎn)樣制片
將觀30個(gè)ESTs對(duì)應(yīng)克隆挑出，以M13+和M13-為通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR體系體積為80 μ 1，其中dNTP終濃度為0. 2mM，引物終濃度為0. 2 μ Μ,Mg2+終濃度為1. 5mM,rTaq酶 4U, cDNA克隆2-IOng左右。PCR反應(yīng)程序如下
①940C30 sec ；
②940C30 sec ；
③560C30sec ；⑤ go to ②35Cycles ；
⑦ 10°C (或 4°C)for ever οPCR完畢，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)PCR產(chǎn)物的質(zhì)量和產(chǎn)量。用異丙醇純化法對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化步驟如下分別取8 μ 1 NaAc (ρΗ=7. 0，3mol/L)和85 μ 1異丙醇依次加入PCR產(chǎn)物板中，混勻，于_20°C冰柜或冰箱中沉淀過(guò)夜(或-20°C靜置3 hr以上)，沉淀完畢，將96孔板置于離心機(jī)，4500 rpm離心 30min，棄去上清液，倒置5min，每孔中加入75%的乙醇100 μ ，輕輕混勻后置96孔板離心機(jī)中4500 rpm離心20min，棄去上清液，室溫靜置干燥4hr以上。點(diǎn)制芯片將96孔PCR板中干燥的PCR產(chǎn)物溶于16μ1左右點(diǎn)樣稀釋液(上海博星基因芯片公司)中，充分溶解。用十二道微量移液器將96孔PCR板中的樣品按一定順序移至 384孔板(Genetix公司)中。打開(kāi)OmniGrid點(diǎn)樣儀，裝上MicroQuill 2000點(diǎn)樣針(Majer Precision公司)，按點(diǎn)樣方案設(shè)計(jì)程序，放上384孔樣品板及待點(diǎn)樣基片(上海博星基因芯片公司)，運(yùn)行程序開(kāi)始點(diǎn)樣。點(diǎn)樣完成的芯片置點(diǎn)樣儀中水合30 min、室溫干燥2 hr ；以封閉液(上海博星基因芯片公司)封閉15min、水沖洗、室溫干燥后備用。每個(gè)克隆在同一個(gè)基片不同位置重復(fù)點(diǎn)樣三次，以煙草actin基因做陽(yáng)性對(duì)照， 與煙草無(wú)同源性的人基因做陰性對(duì)照，芯片質(zhì)檢合格后放4°C保存?zhèn)溆?。利用上述煙草腺毛cDNA芯片篩選腺毛特異表達(dá)基因的方法 (I)RNA提取和純化
采用Trizol —步法分別提取腺毛和去腺毛葉片總RNA。采用QIAGEN RNeasy試劑盒純化總RNA，RNA的線性放大采用Ambion公司生產(chǎn)的MessageAmpTM 11 aRNA Amplification Kit, RNA Amplification for Array Analysis 試劑盒。嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書操作。(2)熒光探針標(biāo)記具體步驟如下
①在滅菌的1. 5 mL Eppendorf管內(nèi)依次加入以下試劑(反應(yīng)終體積為50 μ L，以下試劑均為RNase-free) ddH2023 μ L
隨機(jī)引物 5 μ L aRNA3 μ g
振蕩混勻，置于70°C水浴10 min，取出后，迅速置于冰上。②分別加入以下試劑 逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液10 μ L DTT 5 μ L
dNTPs 4 yL
③而后在暗室中加入以下試劑
逆轉(zhuǎn)錄酶2 μL
Cy5-dCTP 或 Cy3-dCTP 3 yL④用手指彈打管壁以混勻樣品，手浴2 min0將Eppendorf管置于42°C水浴2 hr。⑤依次在Eppendorf管中加入標(biāo)記試劑I 4 μ1，65 水浴10 min后加入標(biāo)記試劑II 4 μ 1，混勻，合并對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組，避光，真空抽干至50 μ L左右。⑥使用DNA純化柱(或乙醇沉淀)純化DNA。⑦加入標(biāo)記試劑III 8 μ 1，真空抽干。逆轉(zhuǎn)錄標(biāo)記cDNA探針并純化，在一鏈合成中摻入熒光標(biāo)記dCTP，用Cy5_dCTP標(biāo)記腺毛樣品，Cy3-dCTP標(biāo)記去腺毛葉片樣品，同時(shí)進(jìn)行反標(biāo)。DNA純化后真空抽干，備用。(3)芯片雜交具體步驟如下
①在抽干的探針管中加6. 5μ L雜交試劑I，充分混勻，使探針溶解。再加入6. 5μ L雜交試劑II，混勻備用。②將預(yù)雜交的玻片取出，用ddH20沖去蓋玻片。③將探針置于95°C水浴中變性2 min ；玻片置于95°C水浴中變性30 sec,玻片取出浸無(wú)水乙醇30 sec，探針取出后迅速置于冰上。④將探針置于芯片上，用蓋玻片覆蓋，置于雜交艙中，用Parafilm密封，放入 42°C雜交箱內(nèi)雜交過(guò)夜(16 18 h)。⑤用0. 5%的洗滌液1沖洗玻片，去除蓋玻片。⑥準(zhǔn)備兩個(gè)染色缸，分別裝有0. 5%的洗片試劑1 +洲的洗片試劑2、5%的洗片試劑3，放入60°C水浴鍋中。⑦將玻片依次浸入以上兩個(gè)染色缸中洗滌10 min。⑧用0. 5%的洗滌液1沖洗玻片，晾干后掃描。 (4)數(shù)據(jù)收集
芯片用kanArray4000激光掃描儀進(jìn)行掃描，得圖1所示的掃描圖。采用GenePix Pro 3. 0圖像分析軟件(Axon Instruments公司)對(duì)芯片圖像進(jìn)行分析，芯片雜交掃描后，用分析軟件對(duì)芯片所獲得的原始信號(hào)進(jìn)行整體校準(zhǔn)和數(shù)據(jù)均一化處理。均一化處理依據(jù)以下2 個(gè)原則篩選有效基因點(diǎn)第一，該基因點(diǎn)的Cy3、Cy5信號(hào)值皆大于200，或者其中之一大于 800;第二，該基因點(diǎn)的Ratio值在0. 1 10之間，然后求出r=ln (Ratio)，再算出全部有效基因點(diǎn)r的平均值R，試驗(yàn)的均一化系數(shù)就等于R的倒數(shù)即EXP(R)。所有基因點(diǎn)的Cy3 信號(hào)值乘上均一化系數(shù)，得出調(diào)整后的Cy3*，計(jì)算每個(gè)基因點(diǎn)在本試驗(yàn)中的表達(dá)差異值 Ratio=Cy5 / Cy3*，Ratio彡2. 0為上調(diào)表達(dá)，Ratio ^ 0. 5為下調(diào)表達(dá)，由此篩選出差異表達(dá)基因。(5)差異基因RT-PCR驗(yàn)證
根據(jù)芯片雜交結(jié)果分析選擇部分基因進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證。根據(jù)引物設(shè)計(jì)軟件ft~imer5 設(shè)計(jì)引物如表1。采用superscript One-Step體系進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，操作按照說(shuō)明書程序進(jìn)行。25 μ L體系，30個(gè)循環(huán)，反應(yīng)條件如下94° C變性1 min, 50 55° C退火2 min, 72° C延伸2 min。用Actin基因作內(nèi)標(biāo)。芯片表達(dá)結(jié)果與RT-PCR結(jié)果比較見(jiàn)附圖2。表1 RT-PCR引物序列表
權(quán)利要求
1.一種煙草腺毛CDNA表達(dá)譜芯片，包括載片，在其平面上包覆有帶正電荷的膜，在該膜的表層設(shè)有點(diǎn)陣，點(diǎn)陣上排布樣點(diǎn)，其特征在于，在該點(diǎn)陣上排布有含來(lái)源于煙草腺毛 cDNA克隆的PCR產(chǎn)物，且含有陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照樣點(diǎn)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的煙草腺毛cDNA表達(dá)譜芯片，其特征在于，所述煙草腺毛cDNA 克隆的PCR產(chǎn)物是通過(guò)以下方法制得(1)腺毛總RNA提取挑選發(fā)育良好、健康的煙草葉片，采用凍刷法收集葉面腺毛，凍純存后提取煙草腺毛總RNA ；(2)cDNA文庫(kù)構(gòu)建采用SMART法構(gòu)建出煙草腺毛的全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)；(3)cDNA文庫(kù)隨機(jī)測(cè)序及EST文庫(kù)建立隨機(jī)挑選cDNA克隆，利用ADI3700進(jìn)行5，端測(cè)序，得到煙草有效序列，再采用lOObp，90%的原則對(duì)其歸并unigene，得到unigene數(shù)，通過(guò)Blastx對(duì)EST進(jìn)行序列比對(duì)和功能注釋，挑出ESTs對(duì)應(yīng)克隆，以M13+和M13-為通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用異丙醇純化法對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的煙草腺毛cDNA表達(dá)譜芯片，其特征在于，所述樣點(diǎn)為矩陣排布，單個(gè)矩陣排布76X114個(gè)樣點(diǎn)，每個(gè)樣點(diǎn)在芯片矩陣內(nèi)設(shè)置3次重復(fù)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的煙草腺毛cDNA表達(dá)譜芯片，其特征在于，所述陽(yáng)性對(duì)照樣點(diǎn)為煙草actin基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的煙草腺毛cDNA表達(dá)譜芯片，其特征在于，所述陰性對(duì)照樣點(diǎn)為與煙草無(wú)同源性的人基因及空白點(diǎn)樣稀釋液。
6.權(quán)利要求1所述煙草腺毛cDNA表達(dá)譜芯片的制備方法，包括以下步驟(1)腺毛總RNA提取挑選發(fā)育良好、健康的煙草葉片，采用凍刷法收集葉面腺毛，凍純存后提取煙草腺毛總RNA ；(2)cDNA文庫(kù)構(gòu)建采用SMART法構(gòu)建出煙草腺毛的全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)；(3)cDNA文庫(kù)隨機(jī)測(cè)序及EST文庫(kù)建立隨機(jī)挑選cDNA克隆，利用ADI3700進(jìn)行5，端測(cè)序，得到煙草有效序列，再采用lOObp，90%的原則對(duì)其歸并unigene，得到unigene數(shù)，通過(guò)Blastx對(duì)EST進(jìn)行序列比對(duì)和功能注釋，挑出ESTs對(duì)應(yīng)克隆，以M13+和M13-為通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用異丙醇純化法對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化；(4)點(diǎn)制芯片將上步所得PCR產(chǎn)物溶于點(diǎn)樣稀釋液中，再以點(diǎn)樣儀將其按點(diǎn)樣方案點(diǎn)制于點(diǎn)樣基片上；點(diǎn)樣完成的芯片置點(diǎn)樣儀中進(jìn)行水合、干燥，再經(jīng)封閉液封閉、水沖洗、室溫干燥后放4°C保存?zhèn)溆谩?br> 7.權(quán)利要求1所述煙草腺毛cDNA表達(dá)譜芯片在篩選煙草腺毛特異表達(dá)基因上的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，包括以下步驟(1)RNA提取和純化采用Trizol—步法分別提取煙草腺毛和去腺毛葉片總RNA ；(2)熒光探針標(biāo)記逆轉(zhuǎn)錄標(biāo)記cDNA探針并純化，在一鏈合成中摻入熒光標(biāo)記dCTP，用 Cy5-dCTP標(biāo)記腺毛樣品，Cy3-dCTP標(biāo)記去腺毛葉片樣品，同時(shí)進(jìn)行反標(biāo)，DNA純化后真空抽干，備用；(3)芯片雜交(4)數(shù)據(jù)收集用激光掃描儀掃描雜交后的芯片，并對(duì)芯片所獲得的原始信號(hào)進(jìn)行整體校準(zhǔn)和數(shù)據(jù)均一化處理，計(jì)算每個(gè)基因點(diǎn)在本試驗(yàn)中的表達(dá)差異值Rati0，Rati0 > 2. O為上調(diào)表達(dá)，Ratio ( 0. 5為下調(diào)表達(dá)，由此篩選出差異表達(dá)基因。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種煙草腺毛cDNA表達(dá)譜芯片及其制備與應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)分離煙草葉面腺毛，提取總RNA，構(gòu)建煙草腺毛cDNA文庫(kù)；對(duì)cDNA文庫(kù)進(jìn)行隨機(jī)測(cè)序，獲得煙草腺毛EST數(shù)據(jù)庫(kù)，利用PCR擴(kuò)增EST序列，制備出煙草腺毛cDNA表達(dá)譜芯片；該芯片對(duì)煙草腺毛和去腺毛葉片基因表達(dá)進(jìn)行分析，獲得腺毛中表達(dá)上調(diào)的ESTs，篩選出特異表達(dá)基因。本發(fā)明制備出的芯片具有高效、靈敏、高通量、高精確性、特異性強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，可一次檢測(cè)大量基因的表達(dá)模式，并在在相同試驗(yàn)條件下，綜合分析多個(gè)樣品的基因表達(dá)變化規(guī)律，適用于煙草腺毛與栽培措施、環(huán)境脅迫等關(guān)系方面的研究。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102154484SQ201110041870
公開(kāi)日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2011年2月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月22日
發(fā)明者冀浩, 劉國(guó)順, 葉協(xié)鋒, 崔紅, 張松濤, 楊慧娟, 肖炳光, 靳超 申請(qǐng)人:河南農(nóng)業(yè)大學(xué)