專利名稱：副溶血性弧菌雙重實時熒光pcr檢測引物、探針、檢測試劑盒和檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及重要的食源性病原菌副溶血性弧菌 (Vibrio Parahemolyticus)的雙重實時熒光PCR檢測引物、探針、檢測試劑盒和檢測方法， 適合于進(jìn)出口食品檢驗、疾病控制中心、質(zhì)量監(jiān)督部門使用。
背景技術(shù)：
副溶血弧菌(VibrioParahaemolyticus)是一種革蘭氏陰性嗜鹽桿菌，是沿海國 家的重要食物中毒致病菌之一，可導(dǎo)致患者腹瀉、腸痙攣、惡心、嘔吐、發(fā)燒等典型胃腸炎反 應(yīng)。副溶血性弧菌主要存在于海水及海產(chǎn)品中，在日本由該菌引起的食物中毒占細(xì)菌性食 物中毒的40% 60%，位居首位。另外，美國、澳大利亞、英國、比利時、法國、韓國和東南亞 地區(qū)，都有該菌引起食物中毒爆發(fā)的報告。我國從1998年以來的資料顯示，副溶血弧菌引 發(fā)的食物中毒的發(fā)生規(guī)模及人群暴露規(guī)模呈明顯上升趨勢，均已超過沙門氏菌食物中毒， 躍居細(xì)菌性中毒的首位。副溶血性弧菌傳統(tǒng)的檢測方法是基于形態(tài)特征、染色特征、生化特征、血清分型等 表型特征來鑒定。這些常規(guī)的方法在副溶血性弧菌研究工作中起到了重要作用，但現(xiàn)代科 學(xué)技術(shù)的發(fā)展，傳統(tǒng)的依靠表型特征來鑒定副溶血性弧菌的方法，已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足對該菌 的快速診斷以及流行病學(xué)研究的需要，暴露出許多不足之處操作繁瑣，鑒定周期長，不利 于急性中毒的快速診斷和口岸快速通關(guān)的要求；副溶血性弧菌的致病機(jī)理復(fù)雜且多樣化， 不含毒力因子的菌株不一定致病，而傳統(tǒng)的培養(yǎng)鑒定法短時間內(nèi)無法確定該菌的毒力強(qiáng) 弱，還需繼續(xù)增加其他特殊的生化等鑒定實驗，這無疑使鑒定周期更加漫長。因此，迫切急 需研究出能夠更加快速、準(zhǔn)確無誤、檢測通量更高、人為影響因素盡可能減少，而且能獲得 分離的病原體基因型別、毒力基因分布等多重信息的檢測方法。用于副溶血性弧菌分子檢測比較常見的主要有常規(guī)PCR、單一實時熒光PCR以及 基因芯片等。雖然，常規(guī)PCR具有高靈敏度、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，但是需要對產(chǎn)物進(jìn)行后處理， 容易污染，同時，染色劑、紫外光等對操作人員身體健康有威脅，不易自動化和標(biāo)準(zhǔn)化；基因 芯片技術(shù)具有高特異性、高通量等優(yōu)點(diǎn)，但是需要先擴(kuò)增再雜交，技術(shù)還不是很穩(wěn)定，尤其 是儀器設(shè)備昂貴，不利于推廣應(yīng)用。實時熒光PCR技術(shù)充分結(jié)合了 PCR擴(kuò)增和探針雜交的 優(yōu)勢，具有高靈敏度、高特異性，重復(fù)性和穩(wěn)定性良好的優(yōu)點(diǎn)，一次上機(jī)即可完成結(jié)果檢測， 容易自動化。實時熒光PCR技術(shù)根據(jù)熒光能量傳遞原理，融合了 PCR技術(shù)的高效擴(kuò)增、探針技術(shù) 的高特異性、光譜技術(shù)的高敏感性和高精確性等優(yōu)點(diǎn)。它是利用熒光信號伴隨著PCR產(chǎn)物 的增加而增強(qiáng)的原理，在PCR擴(kuò)增過程中，連續(xù)不斷地檢測反應(yīng)體系中熒光光信號的變化。 根據(jù)熒光信號基線的平均值和平均標(biāo)準(zhǔn)差，在99. 7%的置信度時計算出大于平均值的熒光 信號即閾值，然后收集熒光信號增強(qiáng)到預(yù)定閾值時的PCR循環(huán)次數(shù)(即Ct值)。該參數(shù)和 PCR反應(yīng)體系中起始DNA模板量的對數(shù)值之間有嚴(yán)格的線性關(guān)系。利用陽性梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)檢測樣品的Ct值就可以準(zhǔn)確地測定靶標(biāo)病原菌的起始 模板拷貝數(shù)。實時熒光定量PCR的化學(xué)原理包括探針類和非探針類兩種，探針類是利用與靶序 列特異雜交的探針來指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，非探針類則是利用熒光染料或者特殊設(shè)計的引 物來指示擴(kuò)增的增加。前者由于增加了探針的識別步驟，特異性更高，但后者則簡便易行。目前副溶血性弧菌的熒光PCR檢測上，文獻(xiàn)報道以gyrase為目的基因就無法區(qū)分 副溶血性弧菌和溶藻弧菌，tlh和tdh為靶基因容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。副溶血性弧菌在我 妻氏瓊脂上引起β-溶血，稱為神奈川現(xiàn)(KP現(xiàn)象)。KP現(xiàn)象是鑒定副溶血性弧菌致病性 和非致病性菌株的一項重要指標(biāo)，其主要是熱穩(wěn)定性溶血素tdh基因引起，tdh基因是副溶 血性弧菌的主要毒力因子，具有致死毒性、心臟毒性、細(xì)胞毒性和腸毒素作用。最近的研究 還表明，tdh基因家族也廣泛存在于人類致病性弧菌中，如部分霍利斯弧菌(V.hollisae)， 某些擬態(tài)弧菌菌株中也有tdh基因，非01群霍亂弧菌中也存在同源性約為93% 96%的 tdh相關(guān)基因。因此，以單獨(dú)以tdh基因為目標(biāo)基因就無法準(zhǔn)確鑒定出副溶血性弧菌。在單一熒光PCR基礎(chǔ)上的多重實時熒光PCR方法，可針對多個基團(tuán)為目的基因進(jìn) 行檢測。多重實時熒光PCR法用于病原菌的檢測，無論在國內(nèi)還是在國外都剛剛起步，目前 尚無副溶血性弧菌的多重實時熒光PCR的檢測試劑盒問世。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種快速、可靠、靈敏度高、特異性強(qiáng)的副溶血性弧菌雙重實 時熒光PCR檢測引物、探針、檢測試劑盒和檢測方法，通過一次反應(yīng)就能完成副溶血性弧菌 的特異性檢測和毒力基因檢測。本發(fā)明利用雙重實時熒光PCR方法，以副溶血性弧菌的toxR基因和tdh基因作為 靶基因，toxR基因用于特異性檢測副溶血性弧菌，tdh基因用于檢測是否攜帶毒力基因，優(yōu) 化設(shè)計引物、探針和反應(yīng)條件，使得在一次擴(kuò)增反應(yīng)中對副溶血性弧菌進(jìn)行特異性檢測的 同時檢測其毒力基因，達(dá)到簡便、快速、準(zhǔn)確可靠和安全的目的，從而實現(xiàn)了本發(fā)明的目的。本發(fā)明的副溶血性弧菌雙重實時熒光PCR檢測引物，其特征在于，所述的檢測引 物如下所示針對toxR 基因5~ -AGCAGTACGCAAATCGGTAG-3~ ；(如 SEQ ID NO. 1 所示)5:CAATCGTTGAACCAGAAGCG-3~ ；(如 SEQ ID N0. 2 所示)針對tdh 基因5~ -GGCTGACATCCTACATGACTG-3“；(如 SEQ ID N0. 3 所示)5~-AGAATGACCGTGCTTATAGCC-3、；(如 SEQ ID N0. 4 所示)本發(fā)明的副溶血性弧菌雙重實時熒光PCR檢測探針，其特征在于，所述的檢測探 針如下所示toxR 基因的探針5~-AGGATTCACAGCAGAAGCCACAGG-3、；(如 SEQ ID N0. 5 所示)tdh 基因的探針5~ -CAGACACCGCTGCCATTGTATAGTCTT-3、；(如 SEQ ID N0. 6 所示)探針的5、端標(biāo)記有熒光報告基團(tuán)，3、端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)，兩探針的5、端標(biāo)記 的熒光報告基團(tuán)是不同的熒光報告基團(tuán)。所述的熒光報告基團(tuán)優(yōu)選為FAM、HEX或VIC，所述的熒光淬滅基團(tuán)優(yōu)選為BHQl。本發(fā)明的副溶血性弧菌雙重實時熒光PCR檢測試劑盒，包括實時熒光定量PCR反
5應(yīng)液、耐熱DNA聚合酶、檢測引物和檢測探針，其特征在于，所述的檢測引物包括兩對(1)針對 toxR 基因5~ -AGCAGTACGCAAATCGGTAG-3~ ；(如 SEQ ID NO. 1 所示)5:CAATCGTTGAACCAGAAGCG-3~ ；(如 SEQ ID NO. 2 所示)(2)針對 tdh 基因5:GGCTGACATCCTACATGACTG-3~ ；(如 SEQ ID NO. 3 所示)5~-AGAATGACCGTGCTTATAGCC-3、；(如 SEQ ID NO. 4 所示)所述的檢測探針包括(1) toxR基因的探針5~ -AGGATTCACAGCAGMGCCACAGG-3、；(如 SEQ ID N0. 5所示)(2) tdh 基因的探針5~ -CAGACACCGCTGCCATTGTATAGTCTT-3、；(如 SEQ ID N0. 6 所 示)探針的5、端標(biāo)記有熒光報告基團(tuán)，3、端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)，兩探針的5、端標(biāo)記 的熒光報告基團(tuán)是不同的熒光報告基團(tuán)。本發(fā)明的副溶血性弧菌雙重實時熒光PCR檢測方法，用于檢測食品或海產(chǎn)品，其 特征在于，包括以下步驟(1)對樣品進(jìn)行增菌培養(yǎng)，提取增菌液中菌體的基因組DNA作為模板；(2)使用上述針對toxR基因和tdh基因的檢測引物及其檢測探針，與實時熒光 PCR擴(kuò)增用的反應(yīng)液及耐熱DNA聚合酶混合形成擴(kuò)增反應(yīng)體系；(3)將擴(kuò)增反應(yīng)體系在熒光PCR儀上進(jìn)行實時熒光PCR反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù) 探針標(biāo)記的熒光報告基團(tuán)記錄的熒光信號，讀取并記錄各檢測樣品的PCR擴(kuò)增循環(huán)次數(shù) (Ct)；(4)根據(jù)各樣品的Ct值，按照建立的判斷標(biāo)準(zhǔn)，判斷樣品中是否含有副溶血性弧 菌，以及該副溶血性弧菌是否含有毒力基因tdh基因。所述的步驟O)的擴(kuò)增反應(yīng)體系優(yōu)選為
權(quán)利要求
1.一種副溶血性弧菌(Vibrio Parahaemolyticus)雙重實時熒光PCR檢測引物，其特 征在于，所述的檢測引物如下所示針對 toxR 基因5~ -AGCAGTACGCAAATCGGTAG-3~ ； -CAATCGTTGAACCAGAAGCG-3~ ；針對 tdh 基因5~ -GGCTGACATCCTACATGACTG-3~ ； -AGAATGACCGTGCTTATAGCC-3~。
2.一種副溶血性弧菌雙重實時熒光PCR檢測探針，其特征在于，所述的檢測探針如下 所示toxR 基因的探針5~-AGGATTCACAGCAGAAGCCACAGG-3~ ；tdh 基因的探針5:CAGACACCGCTGCCATTGTATAGTCTT-3—；探針的5、端標(biāo)記有熒光報告基團(tuán)，3、端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)，兩探針的5、端標(biāo)記的熒 光報告基團(tuán)是不同的熒光報告基團(tuán)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的副溶血性弧菌雙重實時熒光PCR檢測探針，其特征在于，所述 的熒光報告基團(tuán)為FAM、HEX或VIC，所述的熒光淬滅基團(tuán)為BHQl。
4.一種副溶血性弧菌雙重實時熒光PCR檢測試劑盒，包括實時熒光定量PCR反應(yīng)液、耐 熱DNA聚合酶、檢測引物和檢測探針，其特征在于，所述的檢測引物包括兩對(1)針對toxR 基因5~ -AGCAGTACGCAAATCGGTAG-3~ ； -CAATCGTTGAACCAGAAGCG-3~ ；(2)針對tdh 基因5~ -GGCTGACATCCTACATGACTG-3~ ；5—-AGAATGACCGTGCTTATAGCC-3、；所述的檢測探針包括(1) toxR 基因的探針5~ -AGGATTCACAGCAGAAGCCACAGG-3、；U) tdh 基因的探針5:CAGACACCGCTGCCATTGTATAGTCTT-3、；探針的5、端標(biāo)記有熒光報告基團(tuán)，3、端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)，兩探針的5、端標(biāo)記的熒 光報告基團(tuán)是不同的熒光報告基團(tuán)。
5.一種副溶血性弧菌雙重實時熒光PCR檢測方法，用于檢測食品或海產(chǎn)品，其特征在 于，包括以下步驟(1)對樣品進(jìn)行增菌培養(yǎng)，提取增菌液中菌體的基因組DNA作為模板；(2)使用權(quán)利要求1所述的針對toxR基因和tdh基因的檢測引物和權(quán)利要求2所述的 toxR基因和tdh基因的檢測探針，與實時熒光PCR擴(kuò)增用的反應(yīng)液及耐熱DNA聚合酶混合 形成擴(kuò)增反應(yīng)體系；(3)將擴(kuò)增反應(yīng)體系在熒光PCR儀上進(jìn)行實時熒光PCR反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)探針標(biāo) 記的熒光報告基團(tuán)記錄的熒光信號，讀取并記錄各檢測樣品的PCR擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)(Ct)；(4)根據(jù)各樣品的Ct值，按照建立的判斷標(biāo)準(zhǔn)，判斷樣品中是否含有副溶血性弧菌，以 及該副溶血性弧菌是否含有毒力基因tdh基因。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的副溶血性弧菌雙重實時熒光PCR檢測方法，其特征在于，所述 的步驟O)的擴(kuò)增反應(yīng)體系為
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的副溶血性弧菌雙重實時熒光PCR檢測方法，其特征在于， 所述步驟(3)的進(jìn)行實時熒光PCR反應(yīng)，其反應(yīng)參數(shù)為95°C 30s,93°C 5s,60°C 30s、40個 循環(huán)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種副溶血性弧菌雙重實時熒光PCR檢測引物、探針、檢測試劑盒和檢測方法。本發(fā)明利用雙重實時熒光PCR方法，以副溶血性弧菌的toxR基因和tdh基因作為靶基因，toxR基因用于特異性檢測副溶血性弧菌，tdh基因用于檢測是否攜帶毒力基因，優(yōu)化設(shè)計引物、探針和反應(yīng)條件，使得在一次擴(kuò)增反應(yīng)中對副溶血性弧菌進(jìn)行特異性檢測的同時檢測其毒力基因，檢測快速，8-10小時可以完成從制備樣品到出具檢測結(jié)果的過程，不受假陽性和交叉污染等干擾，結(jié)果可靠，且靈敏度高、特異性強(qiáng)，為副溶血性弧菌進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查提供了有利工具。適用于食品以及海產(chǎn)品的檢驗檢疫，可供檢驗檢疫局、疾病預(yù)防控制中心和質(zhì)量監(jiān)督部門對樣品進(jìn)行簡便、快速、準(zhǔn)確的檢測。
文檔編號C12Q1/68GK102146469SQ20111004348
公開日2011年8月10日 申請日期2011年2月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月22日
發(fā)明者凌莉, 張旺, 易敏英, 相大鵬, 袁慕云, 許龍巖, 鄒志飛, 陽靜 申請人:廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心