專利名稱：糧食及其加工副產(chǎn)物中脂肪酶活力的快速測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及糧食精深加工領(lǐng)域，特指一種稻米、小麥、大豆及其加工副產(chǎn)物中脂肪酶活力的快速檢測(cè)方法，可廣泛應(yīng)用于糧食加工企業(yè)、倉儲(chǔ)企業(yè)及糧油檢測(cè)機(jī)構(gòu)的品質(zhì)檢驗(yàn)與控制。
背景技術(shù)：
稻谷、小麥?zhǔn)侨祟愔饕澄镔Y源，在加工過程中會(huì)產(chǎn)生大量的副產(chǎn)品一一胚芽、麩皮、糠等，這些副產(chǎn)物含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)也富含脂肪酶、脂肪氧化酶等，在酶的催化作用下這些副產(chǎn)物很容易水解酸敗，因而目前主要作為飼料出售，附加值較低。為了充分利用糧食資源，需要對(duì)糧食及其加工副產(chǎn)物的品質(zhì)進(jìn)行酶的鈍化處理， 其中脂肪酶活力的準(zhǔn)確測(cè)定是制定穩(wěn)定化處理工藝的基礎(chǔ)。谷物脂肪酶的活力測(cè)定一般分為三個(gè)步驟首先是從谷物中提取脂肪酶；然后往酶提取液中加入底物并均質(zhì)化，培育游離脂肪酸；最后對(duì)生成的游離脂肪酸進(jìn)行檢測(cè)，求出酶活力。即先進(jìn)行脂肪酶的提取與純化，再將酶與底物的混合培育脂肪酸，最后進(jìn)行脂肪酸的測(cè)定。人們已經(jīng)開發(fā)了一系列谷物游離脂肪酸的測(cè)定方法，如滴定法、比色法和色譜法等，其中最為常用的是滴定法和比色法。比色法測(cè)定快速、靈敏度高且儀器價(jià)格便宜，受到人們青睞，尤其是銅皂比色法常用于測(cè)定樣品中游離脂肪酸含量。迄今，該方法已歷經(jīng)了數(shù)次創(chuàng)新，Baker利用5%醋酸銅試劑與谷物中脂肪酸反應(yīng)生成銅皂，通過吸光值求得谷物中游離脂肪酸含量；Dimcombe使用 Cu(NO3) ·3Η20和三乙醇胺為銅試劑和顯色試劑；Lowry等使用乙酸銅一吡啶作為銅試劑，省去了顯色試劑；Kwon等人用異辛烷取代苯提取游離脂肪酸，改進(jìn)后的方法省去了溶劑蒸發(fā)步驟，簡(jiǎn)化了測(cè)定過程。綜上，銅皂比色法用于糧食游離脂肪酸的測(cè)定已發(fā)展得較為成熟，但該法用于谷物脂肪酶活力的測(cè)定尚有兩大限制因素。首先是谷物脂肪酶的提取與純化過程繁瑣；其次脂肪酶水溶液與水不溶性底物難以混合均勻。脂肪酶只能在油水接觸面上起作用，水不溶性底物(如橄欖油)與酶液在混合反應(yīng)時(shí)，由于均質(zhì)條件的差異，其形成的乳化液往往不穩(wěn)定，且乳液顆粒大小也不均衡，造成測(cè)定結(jié)果重現(xiàn)性差。2003年，Goffman等人先用磷酸鹽緩沖溶液浸提米糠脂肪酶，然后將粗酶液加入橄欖油乳化液中培養(yǎng)18h，再用銅皂比色法測(cè)定脂肪酶活力。該法雖省去了脂肪酶的純化步驟，但其培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)，不能適應(yīng)脂肪酶活力快速測(cè)定的要求。2003年，F(xiàn). EI Amrani等發(fā)明了一種低水分體系下測(cè)定脂肪酶活度的方法，具體步驟如下圖。該法將待測(cè)樣品粉碎后，再與橄欖油混合，培養(yǎng)一段時(shí)間，然后采用滴定法測(cè)定游歷脂肪酸含量。該法雖不用提取脂肪酶，但存在兩個(gè)缺點(diǎn)培養(yǎng)時(shí)間72h，太費(fèi)時(shí)，如此長(zhǎng)時(shí)間的主要目的是為了產(chǎn)生足夠數(shù)量的游離脂肪酸，這是因?yàn)殡娢坏味y(cè)定游離脂肪酸的靈敏度低(相對(duì)于銅皂比色法)；其二需要用到恒PH自動(dòng)電位滴定儀(目前國內(nèi)還沒有廠家生產(chǎn)該類儀器，需進(jìn)口)。糧食中游離脂肪酸是有機(jī)弱酸的混合物，其滴定終點(diǎn)突變不明顯，同時(shí)在糧食游離脂肪酸提取過程中，部分色素進(jìn)入提取液，進(jìn)一步增加了終點(diǎn)判斷的難度，使得個(gè)體間終點(diǎn)判斷差異增大。該法通過精密電位滴定儀準(zhǔn)確判定終點(diǎn)或色譜法，但儀器都比較昂貴。2006年，Devin等人發(fā)明了一種低水分體系下測(cè)定小麥和麩皮中脂肪酶活度的方法。該法無需提取及純化脂肪酶，直接往脫脂小麥麩皮中加入水和底物，經(jīng)過一段時(shí)間培養(yǎng)之后，通過銅皂比色法測(cè)定游離脂肪酸含量來計(jì)算脂肪酶活力。Devin的方法僅探討了水和橄欖油添加量對(duì)小麥脂肪酶活力的影響，但未說明以下問題其一，Devin在測(cè)定麥麩脂肪酶活力時(shí)，其原始水分為15%，在此基礎(chǔ)上實(shí)驗(yàn)得出優(yōu)化的加水量，而原始含水量不同的谷物，該研究獲得的絕對(duì)加水量便失去了參考價(jià)值；其二，樣品、水和橄欖油三者混合程度對(duì)測(cè)定結(jié)果的重現(xiàn)性的影響極大，因?yàn)榧尤氲酱郎y(cè)樣品中的水和橄欖油量相對(duì)很少，若采用常規(guī)方法難以充分混勻，這樣會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果重現(xiàn)性差。而如何將樣品、水和橄欖油有效混勻，研究人員沒有明確指出。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有方法在測(cè)定谷物脂肪酶活力時(shí)，脂肪酶的提取與純化過程繁瑣，測(cè)定體系內(nèi)各組分混合不勻?qū)е陆Y(jié)果重現(xiàn)性差，無法適應(yīng)不同原始含水量的樣品，耗時(shí)長(zhǎng)等缺陷，本發(fā)明立足于水分活度這個(gè)對(duì)酶活力起重要作用的影響因子，提供一種在低水分體系下快速測(cè)定谷物脂肪酶活力的方法，可推廣到糧食加工企業(yè)與儲(chǔ)藏企業(yè)，用于糧食加工及其副產(chǎn)物品質(zhì)的實(shí)時(shí)評(píng)估。本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是
首先將糧食及其加工副產(chǎn)物等待測(cè)樣品用有機(jī)溶劑進(jìn)行部分脫脂，并根據(jù)其原始水分含量大小加入適量蒸餾水(或30°c以下低溫烘干)，調(diào)節(jié)至一定水分活度，然后往其中加入適量橄欖油，并混合均勻，培養(yǎng)一段時(shí)間后，最后由銅皂比色法測(cè)定其增加的游離脂肪酸量，換算得到糧食及其加工副產(chǎn)物中脂肪酶的活力。本發(fā)明的方法具體按照下述步驟進(jìn)行
(1)待測(cè)糧食及其加工副產(chǎn)物樣品經(jīng)粉碎后，過30目篩，取篩下物，加入5 10倍體積的有機(jī)溶劑置于氣浴搖床中，以100 250rpm振蕩脫脂20 120min ；
(2)傾斜倒出脫脂的溶酶后，將樣品置于烘箱中，20 60°C熱風(fēng)烘干0.5 池去除殘余溶酶，取出放入干燥器中；
(3)稱取步驟2干燥后的樣品適量，分別置于兩試管中，一只空白Ai,另一只為Af，往每只試管中分別加入0 2. 5倍質(zhì)量的蒸餾水(或30°C以下低溫烘干0. 5 他)，調(diào)節(jié)其水分活度為0. 6 0. 9，優(yōu)選0. 7 0. 8 ；再加入0. 2 2. 5倍質(zhì)量的橄欖油，將三者充分?jǐn)嚢杈鶆颍?br> (4)取步驟3空白管Ai中的試樣，立即加入廣10倍體積的有機(jī)溶劑，渦旋振蕩30秒， 然后5000rpm離心3min，上清液倒入圓底燒瓶中，反復(fù)提取2 3次；
(5)取步驟3樣品管Af中的試樣，25 75°C下，優(yōu)選30 55°C，培養(yǎng)1 他，優(yōu)選2 4h后，取出，加入1 10倍體積的有機(jī)溶劑，振蕩30秒，然后5000rpm轉(zhuǎn)速下離心3min，上清液倒入圓底燒瓶中，反復(fù)提取2 3次；
(6)將步驟4、5得到的提取液在40°C以下減壓蒸發(fā)，除去有機(jī)溶劑。剩余固形物溶于0. 5 3倍樣品質(zhì)量的異辛烷后，加入1 2倍異辛烷體積的5%醋酸銅溶液(用吡啶調(diào)節(jié)其至pH5. 5 6. 5)，振蕩lmin，4000rpm離心2 lOmin，獲得有機(jī)相與水相；
(7)經(jīng)過步驟(6)獲得的有機(jī)相，在715nm下測(cè)其吸光度值，試樣吸光值與油酸異辛烷標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光值做比較；
(8)將步驟(7)中得到的吸光度值，代入下式計(jì)算脂肪酶活力
權(quán)利要求
1.糧食及其加工副產(chǎn)物中脂肪酶活力的快速測(cè)定方法，其特征在于按照下述步驟進(jìn)行(1)待測(cè)糧食及其加工副產(chǎn)物樣品經(jīng)粉碎后，過30目篩，取篩下物，加入5 10倍體積的有機(jī)溶劑置于氣浴搖床中，以100 250rpm振蕩脫脂20 120min ；(2)傾斜倒出脫脂的溶酶后，將樣品置于烘箱中，20 60°C熱風(fēng)烘干0.5 池去除殘余溶酶，取出放入干燥器中；(3)稱取步驟(2)干燥后的樣品適量，分別置于兩試管中，一只空白Ai,另一只為Af，往每只試管中分別加入0 2. 5倍質(zhì)量的蒸餾水或30°C以下低溫烘干0. 5 他，調(diào)節(jié)其水分活度為0. 6 0. 9 ；再加入0. 2 2. 5倍質(zhì)量的橄欖油，將三者充分?jǐn)嚢杈鶆颍?4)取步驟(3)空白管Ai中的試樣，立即加入廣10倍體積的有機(jī)溶劑，渦旋振蕩30秒， 然后5000rpm離心3min，上清液倒入圓底燒瓶中，反復(fù)提取2 3次；(5)取步驟(3)樣品管Af中的試樣，25 75°C下，培養(yǎng)1 他后，取出，加入1 10 倍體積的有機(jī)溶劑，振蕩30秒，然后5000rpm轉(zhuǎn)速下離心3min，上清液倒入圓底燒瓶中，反復(fù)提取2 3次；(6)將步驟(4)、(5)得到的提取液在40°C以下減壓蒸發(fā)，除去有機(jī)溶劑；剩余固形物溶于0. 5 3倍樣品質(zhì)量的異辛烷后，加入1 2倍異辛烷體積的5%醋酸銅溶液振蕩lmin， 4000rpm離心flOmin，獲得有機(jī)相與水相，其中所述的5%醋酸銅溶液使用前用吡啶調(diào)節(jié)其至 ρΗ5· 5 6. 5 ；(7)經(jīng)過步驟(6)獲得的有機(jī)相，在715nm下測(cè)其吸光度值，試樣吸光值與油酸異辛烷標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光值做比較；(8)將步驟(7)中得到的吸光度值，代入下式計(jì)算脂肪酶活力LA= 1000---&tis其中LA =脂肪酶活動(dòng)度(U/g); 1000為從mol/L到μ mol/mL的轉(zhuǎn)換系數(shù)； 4為用于重溶油脂的異辛烷的體積(mL)； ν為加入橄欖油的體積(mL)； Af為在715nm下經(jīng)過培養(yǎng)的樣品的吸光度； Ai為在715 nm下空白樣品的吸光度； ε為油酸在715 nm下的摩爾吸光系數(shù)(M 1^cm O ； t為培養(yǎng)時(shí)間(h)； 1為路徑長(zhǎng)度(cm); s為樣品干重(g)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的糧食及其加工副產(chǎn)物中脂肪酶活力的快速測(cè)定方法，其特征在于其中上述測(cè)定過程中所用的橄欖油需要進(jìn)行預(yù)先純化，按照下述步驟進(jìn)行往橄欖油中邊攪拌邊加入約10 30% (W/V)的氧化鋁，Ih內(nèi)每隔10 15分鐘攪拌混合物一次； 靜置，待氧化鋁沉淀后，過濾獲得純化的橄欖油；取一定量純化橄欖油，加入1 3倍橄欖油體積的乙醚和1 3倍橄欖油體積的95%乙醇，以酚酞為指示劑，用0. 05N的NaOH滴定，如果堿的用量超過橄欖油體積的1/10，重復(fù)純化橄欖油一次。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的糧食及其加工副產(chǎn)物中脂肪酶活力的快速測(cè)定方法，其特征在于其中所述步驟(3)中調(diào)節(jié)其水分活度為0. 7 0. 8 ；其中所述步驟(5)中樣品管Af中的試樣，30 55°C，培養(yǎng)2 4h后，取出，加入1 10倍體積的有機(jī)溶劑，振蕩30秒，然后5000rpm轉(zhuǎn)速下離心3min，上清液倒入圓底燒瓶中，反復(fù)提取2 3次；根據(jù)權(quán)利要求1所述的糧食及其加工副產(chǎn)物中脂肪酶活力的快速測(cè)定方法，其特征在于其中所述的有機(jī)溶劑是指正己烷、乙醚或乙酸乙酯。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的糧食及其加工副產(chǎn)物中脂肪酶活力的快速測(cè)定方法，其特征在于其中所述的檢測(cè)對(duì)象、橄欖油和蒸餾水三者混合方法是采用白式研磨儀或電動(dòng)勻漿機(jī)混合儀器進(jìn)行混和。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的糧食及其加工副產(chǎn)物中脂肪酶活力的快速測(cè)定方法，其特征在于其中所述的糧食及其加工副產(chǎn)物為小麥、稻谷、玉米、大豆、小麥胚芽、麩皮、米糠、糙米、玉米胚芽或大豆胚芽。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種稻米、小麥及其加工副產(chǎn)物中脂肪酶活力的快速檢測(cè)方法，涉及糧食精深加工領(lǐng)域。首先將米糠等待測(cè)樣品進(jìn)行部分脫脂，并根據(jù)其原始水分含量大小加入適量蒸餾水、調(diào)節(jié)至一定水分活度，然后往其中加入適量橄欖油，培養(yǎng)一段時(shí)間，最后由銅皂比色法測(cè)定其增加的游離脂肪酸量，換算得到米糠脂肪酶活力。該方法省去了脂肪酶的提取及純化步驟，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，可廣泛應(yīng)用于糧食加工企業(yè)、倉儲(chǔ)企業(yè)及糧油檢測(cè)機(jī)構(gòu)的糧油品質(zhì)檢驗(yàn)與控制。
文檔編號(hào)C12Q1/44GK102175633SQ20111004391
公開日2011年9月7日 申請(qǐng)日期2011年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月24日
發(fā)明者任曉鋒, 徐斌, 李波, 苗文娟, 董英 申請(qǐng)人:江蘇大學(xué)