專利名稱：炭疽芽孢桿菌檢測試劑盒及其使用方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物檢測試劑，具體涉及一種炭疽芽孢桿菌檢測試劑盒及其使用方法。
背景技術：
炭疽芽孢桿菌屬于需氧芽胞桿菌屬，能引起羊、牛、馬等動物及人類的炭疽病，并 能造成環(huán)境的廣泛污染。由于炭疽芽孢具有對外界環(huán)境極強的抵抗力，造成這種污染常持 續(xù)存在。因此準確、快速地檢測炭疽芽孢桿菌具有十分重要的意義。傳統(tǒng)炭疽芽孢桿菌檢測方法，由于其檢測周期長、程序復雜、所需試劑繁多等缺點 已遠遠不能滿足現(xiàn)代檢測要求。以聚合酶鏈式反應(PCR)技術為代表的病原核酸檢測技術 在實際應用中存在一些問題，如普通聚合酶鏈式反應(PCR)技術需要專門的儀器，而且存在 容易交叉污染和操作過程煩瑣的缺點。而熒光實時定量聚合酶鏈式反應(real time PCR) 技術雖然較好地解決了交叉污染的問題，并簡化了操作過程，但卻需要更復雜的定量測定 儀器，因此不適用于現(xiàn)場快速檢測。而且實時定量聚合酶鏈式反應PCR技術中熒光探針的 成本較高，加大了推廣應用的難度。免疫學檢測技術快速簡便成本低廉，但要求高質量高穩(wěn) 定性的單克隆抗體，否則因準確性不夠，目前只能是輔助檢測手段。所以及時運用生物技 術發(fā)展的最新成果對滿足病原微生物檢測要求的不斷提高具有重要意義。其中恒溫擴增 (Isothermal Amplification)核酸快速檢測技術是病原核酸檢測技術上的長足進步，現(xiàn)已 建立起來的環(huán)介導恒溫擴增技術(LAMP)具有很多的優(yōu)越性。因此，需要一種檢測效果更全面、特異性高、漏檢率低的炭疽芽孢桿菌檢測試劑盒 及其使用方法以解決上述問題。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術的不足之處而提供一種檢測效果更全面、特異性 高、漏檢率低的炭疽芽孢桿菌檢測試劑盒。本發(fā)明的目的可以通過以下技術措施實現(xiàn)一種炭疽芽孢桿菌檢測試劑盒，所述 的炭疽芽孢桿菌檢測試劑盒包括以炭疽芽孢桿菌的/ 基因為靶基因、基于環(huán)介導恒溫擴 增技術設計的兩對引物內引物FIP/BIP和外引物F3/B3。本發(fā)明檢測的是/ 基因。該/ 基因是炭疽芽孢桿菌保護性抗原基因。與NCBI網站nt數(shù)據(jù)庫的BLAST比對結果顯示，除炭疽芽孢桿菌外，無其它菌帶有 該基因。作為本發(fā)明炭疽芽孢桿菌檢測試劑盒的優(yōu)選實施方式，所述的兩對引物為 外引物 F3 :(SEQ ID NO 1)
CTGATAGTCAAACGAGAACAA
外引物 B3 :(SEQ ID NO 2)
AGTTCTTTCCCCTGCTAGA內引物 FIP (SEQ ID NO 3)
CGCATGCACTTCTGCATTTCTTTTAATACTTCTACAAGTAGGACACAT 內引物 BIP :(SEQ ID NO 4)
TCGTTCTTTGATATTGGTGGGAGTTTTTGATAGTGAATGATCAATTGCGAC。作為本發(fā)明炭疽芽孢桿菌檢測試劑盒的優(yōu)選實施方式，所述的炭疽芽孢桿菌檢測 試劑盒還包括ifeiDNA聚合酶、反應液、穩(wěn)定液、樣品預處理液、顯色液和陽性對照液。作為本發(fā)明炭疽芽孢桿菌檢測試劑盒的更優(yōu)選實施方式， 所述的fei DNA聚合酶酶濃度4-10 U/ μ L ；
所述的反應液含1. 6 2mmol/L dNTP、20 25mmol/L Tris-HCl、10 12. 5mmol/L KCl、10 12. 5mmol/L (NH4)2SO4,8 10mmol/L MgS04、0. 1 0· 125 體積％ TritonX-100、 0.8 lmol/L甜菜堿；
所述的樣品預處理液含10 20 mmol/L pH 8.0的Tris- HC1、1 2 mmol/L EDTA和 1 1. 2 體積 % Triton X-100 ；
所述的顯色液為SYBR Green I或Eva Green ； 所述穩(wěn)定液為石蠟油；
所述的陽性對照為炭疽芽孢桿菌基因組DNA ；
所述的內引物FIP/BIP各為0. 2 0. 25 μ mol/L,外引物F3/B3的濃度各為1. 2 2. 0 μ mol/L。作為本發(fā)明炭疽芽孢桿菌檢測試劑盒的最優(yōu)選實施方式， 所述的fei DNA聚合酶酶濃度8 U/ μ L ；
所述的反應液含2mmol/L dNTP、25mmol/L Tris-HCl、12. 5mmol/L KC1、12. 5mmol/L (NH4) 2S04UOmmol/L MgS04、0. 125 體積 ％ TritonX-100、lmol/L 甜菜堿；
所述的樣品預處理液含20 mmol/L pH 8. 0的Tris- HCl,2 mmol/L EDTA和1. 2體 積 % Triton X-100 ；
所述的顯色液為STOR Green I ；
所述的內引物FIP/BIP的濃度為0. 2 μ mol/L ；
所述的外引物F3/B3的濃度為1.6 μ mol/L。作為本發(fā)明炭疽芽孢桿菌檢測試劑盒的優(yōu)選實施方式，所述的炭疽芽孢桿菌檢測 試劑盒還包括反應管，所述的反應管由管體和管蓋兩部分組成，管體內腔的下部設有將其 分隔成A、B兩個空腔的縱向延伸的隔板。作為本發(fā)明炭疽芽孢桿菌檢測試劑盒的更優(yōu)選實施方式，所述的A、B兩個空腔中 分別裝有工作液或顯色液，兩個空腔中的液體上層均由穩(wěn)定液封存，所述工作液為反應液 和fei DNA聚合酶的混合而成。本發(fā)明還提供一種炭疽芽孢桿菌檢測試劑盒的使用方法，該方法包括如下步驟
(1)將待測樣品離心，去上清，得到沉淀；
(2)將步驟(1)的沉淀加入樣品預處理液，混合均勻，沸水浴滅活后冰上冷卻，高速離 心，上清即為樣品模板DNA;
(3)在反應容器中加入feiDNA聚合酶0. 9 1. 8體積份數(shù)、反應液38 40體積份數(shù)、 穩(wěn)定液52 54. 5體積份數(shù)、樣品模板DNA 4. 5、體積份數(shù)、內引物FIP/BIP各2體積份數(shù)、外引物F3/B3各4體積份數(shù)，恒溫反應；
(4)在上述反應容器和陽性對照中分別加入顯色液，混勻，樣品組顯色與對照組相同則 為陽性，否則為陰性；
所述步驟(3)中的內引物FIP/BIP和外引物F3/B3為以炭疽芽孢桿菌的/ 基因為靶 基因、基于環(huán)介導恒溫擴增技術設計的兩對引物。作為本發(fā)明使用炭疽芽孢桿菌檢測試劑盒的方法的優(yōu)選實施方式，所述的兩對引 物為
外引物 F3 :(SEQ ID NO 1) CTGATAGTCAAACGAGAACAA 外引物 B3 :(SEQ ID NO 2) AGTTCTTTCCCCTGCTAGA 內引物 FIP :(SEQ ID NO 3)
CGCATGCACTTCTGCATTTCTTTTAATACTTCTACAAGTAGGACACAT 內引物 BIP :(SEQ ID NO 4)
TCGTTCTTTGATATTGGTGGGAGTTTTTGATAGTGAATGATCAATTGCGAC。作為本發(fā)明使用炭疽芽孢桿菌檢測試劑盒的方法的優(yōu)選實施方式，步驟(3)中，恒 溫反應的反應條件為溫度63 65°C，反應時間45 90min。本發(fā)明所說的基于環(huán)介導恒溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplication of DNA,簡稱LAMP)快速檢測炭疽芽孢桿菌的方法，是利用feiDNA聚合酶和 根據(jù)靶基因序列設計的兩對特殊的內、外引物(即內引物FIP/BIP和外引物F3/B3)，特異性 識別靶序列上的六個獨立區(qū)域，啟動循環(huán)鏈置換反應，在靶標DNA區(qū)啟動互補鏈合成，結果 在同一鏈上互補序列周而復始形成有很多環(huán)的花椰菜結構的莖-環(huán)DNA混合物。LAMP反 應過程中，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應溶液中的Mg2+結合，產生副產物——焦磷酸 鎂乳白色沉淀，即可通過肉眼觀察判定結果。LAMP反應是在恒溫(63 65°C)條件下45 90分鐘內完成。這種比較溫和的溫度條件以及沒有溫度循環(huán)使所需儀器簡單化，克服了傳 統(tǒng)PCR固有的檢測時間長、容易污染及檢測成本高等缺點。此外，這種檢測方法對檢測人員 的技術素質要求較低，實際操作極為簡便，不需要特殊的試劑和儀器設備，有利于建立成本 低廉的快速篩選體系。LAMP法是一種簡便、快速、高度特異性的基因擴增法。將恒溫基因 擴增技術與PCR技術(包括熒光實時定量PCR技術)進行比較，可以發(fā)現(xiàn)該技術在靈敏度、特 異性和檢測范圍等方法學指標上相當于或優(yōu)于PCR技術，且不依賴任何專門的儀器設備即 可實現(xiàn)現(xiàn)場高通量快速檢測，而且檢測成本遠低于熒光定量PCR技術。目前國家標準中以 微生物分離培養(yǎng)和形態(tài)學鑒定為主、結合生化分析和血清學分型鑒定的通行方法，初步鑒 定需2 3天，完成鑒定報告需10 15天；采用本發(fā)明的檢測試劑盒僅需2小時。并且， 本發(fā)明的反應體系中加入了顯色液，鑒定結果更為直觀清晰。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果1.本發(fā)明的檢測試劑盒只需一個恒 定溫度就能擴增反應，不需要特殊試劑與設備，檢測成本低；2.本發(fā)明的基因快速診斷試 劑盒應用六個區(qū)段，四條引物，根據(jù)是否擴增就能判斷靶標物質的存在與否，因此具有高 特異性；3.本發(fā)明的檢測試劑盒擴增快速且高效，在不到1小時即可完成擴增，且產率高； 4.本發(fā)明的檢測試劑盒靈敏度高，擴增模板僅需10拷貝或更少；5.本發(fā)明的基因快速診斷試劑盒鑒定簡便，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應溶液中的Mg2+結合，產生副產物—— 焦磷酸鎂沉淀，可通過肉眼觀察鑒定，并且加入顯色液后，陰陽性結果顯色差異顯著，驗證 率高，更加明顯可靠；6.由于選擇了高保守性的/ 基因作為靶基因設計引物，使得本發(fā)明 的檢測試劑盒檢測炭疽芽孢桿菌的準確率更高；7.在本發(fā)明檢測試劑盒中采用特制的反 應管，減少了氣溶膠污染的可能性，同時方便操作。
具體實施例方式為使本發(fā)明更加容易理解，下面將進一步闡述本發(fā)明的具體實施例。下列縮略語適用于本發(fā)明
LAMP loop-mediated isothermal amplification,環(huán)介導恒溫擴增
dNTP :deoxyribonucleoside triphosphate,脫氧核苷三憐酸
Bst 酶Bst DNA polymerase (large fragment), Bst DNA 聚合酶(大片段)
EDTA :ethylenediamine tetraacetic acid,乙二胺四乙酸
DNA deoxyribonucleic acid，脫氧核糖核酸
Betaine 甜菜堿
Triton X-100 聚乙二醇辛基苯基醚 PA基因炭疽芽孢桿菌保護性抗原基因 實施例1試劑盒的制備
(1)按以下序列經DNA合成儀合成寡聚脫氧核酸引物 外引物F3
CTGATAGTCAAACGAGAACAA 外引物B3
AGTTCTTTCCCCTGCTAGA 內引物FIP
CGCATGCACTTCTGCATTTCTTTTAATACTTCTACAAGTAGGACACAT 內引物BIP
TCGTTCTTTGATATTGGTGGGAGTTTTTGATAGTGAATGATCAATTGCGAC。(2)購置DNA聚合酶-.Bst DNA聚合酶置于容器；
(3)配制反應液和引物反應液含有2mmol/LdNTP、25mmol/L Tris-Cl、12. 5mmol/L KCl、12. 5mmol/L (NH4)2SO4UOmmo 1/L MgS04、0. 125 體積 ％ TritonX-100、lmol/L 甜菜堿、內 引物FIP/BIP各0· 2 μ mol/L和外引物F3/B3各0. 25 μ mol/L,置于容器；
(4)配制樣品預處理液樣品預處理液含有20mmol/L Tris- HCl (pH 8.0),2 mmol/ L EDTA 和 1. 2 體積 % Triton X-100，置于容器；
(5)購置穩(wěn)定液石蠟油，置于容器；
(6)購置顯色液STORGreen I，置于容器；
(7)提取陽性對照提取炭疽芽孢桿菌基因組DNA，置于容器；
(8)將上述7個容器裝成試劑盒，封裝。制備工藝簡述如下
1、將內引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成純化后，定量配制，濃度檢測，抽樣質檢；2、將上述(2廣(4)步驟配制的液體無菌分裝，并按照實驗用進行濃度確定，抽樣質檢；
3、將穩(wěn)定液分裝，抽樣質檢；
4、將陽性對照標本制備，分裝，抽樣質檢；
5、組裝試劑盒。實施例2炭疽芽孢桿菌檢測試劑盒的應用 1材料與方法
1. 1材料 1. 1. 1菌株
本發(fā)明采用菌株有16株，主要來源于軍事醫(yī)學科學院、臨床分離菌株和環(huán)境分離菌 株。詳見表1。表1菌株名稱及來源
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權利要求
1.一種炭疽芽孢桿菌檢測試劑盒，其特征在于，所述的炭疽芽孢桿菌檢測試劑盒包括 以炭疽芽孢桿菌/ 基因為靶基因、基于環(huán)介導恒溫擴增技術設計的兩對引物內引物FIP/ BIP和外引物F3/B3。
2.根據(jù)權利要求1所述的炭疽芽孢桿菌檢測試劑盒，其特征在于，所述的兩對引物為 外引物F3 CTGATAGTCAAACGAGAACAA 外引物B3 AGTTCTTTCCCCTGCTAGA 內引物FIP CGCATGCACTTCTGCATTTCTTTTAATACTTCTACAAGTAGGACACAT 內引物BIP TCGTTCTTTGATATTGGTGGGAGTTTTTGATAGTGAATGATCAATTGCGAC。
3.根據(jù)權利要求1所述的炭疽芽孢桿菌檢測試劑盒，其特征在于，所述的炭疽芽孢桿 菌檢測試劑盒還包括fei DNA聚合酶、反應液、穩(wěn)定液、樣品預處理液、顯色液和陽性對照 液。
4.根據(jù)權利要求3所述的炭疽芽孢桿菌檢測試劑盒，其特征在于， 所述的fei DNA聚合酶酶濃度4-10 U/ μ L ；所述的反應液含1. 6 2mmol/L dNTP、20 25mmol/L Tris-HCl、10 12. 5mmol/L KCl、10 12. 5mmol/L (NH4)2SO4,8 10mmol/L MgS04、0. 1 0· 125 體積％ TritonX-100、 0.8 lmol/L甜菜堿；所述的樣品預處理液含10 20 mmol/L pH 8.0的Tris- HC1、1 2 mmol/L EDTA和 1 1. 2 體積 % Triton X-100 ；所述的顯色液為SYBR Green I或Eva Green ； 所述穩(wěn)定液為石蠟油；所述的陽性對照為炭疽芽孢桿菌基因組DNA ；所述的內引物FIP/BIP各為0. 2 0. 25 μ mol/L,外引物F3/B3的濃度各為1. 2 2. 0 μ mol/L。
5.根據(jù)權利要求4所述的炭疽芽孢桿菌檢測試劑盒，其特征在于， 所述的fei DNA聚合酶酶濃度8 U/ μ L ；所述的反應液含2mmol/L dNTP、25mmol/L Tris-HCl、12. 5mmol/L KC1、12. 5mmol/L (NH4) 2S04UOmmol/L MgS04、0. 125 體積 ％ TritonX-100、lmol/L 甜菜堿；所述的樣品預處理液含20 mmol/L pH 8. 0的Tris- HCl,2 mmol/L EDTA和1. 2體 積 % Triton X-100 ；所述的顯色液為STOR Green I ；所述的內引物FIP/BIP的濃度為0. 2 μ mol/L ；所述的外引物F3/B3的濃度為1.6 μ mol/L。
6.根據(jù)權利要求3、4或5所述的炭疽芽孢桿菌檢測試劑盒，其特征在于，所述的炭疽芽 孢桿菌檢測試劑盒還包括反應管，所述的反應管由管體和管蓋兩部分組成，管體內腔的下 部設有將其分隔成A、B兩個空腔的縱向延伸的隔板。
7.根據(jù)權利要求6所述的炭疽芽孢桿菌檢測試劑盒，其特征在于，所述的A、B兩個空 腔中分別裝有工作液或顯色液，兩個空腔中的液體上層均由穩(wěn)定液封存，所述工作液為反 應液和fei DNA聚合酶的混合而成。
8.一種使用如權利要求3所述的炭疽芽孢桿菌檢測試劑盒的方法，其特征在于，該方 法包括如下步驟(1)將待測樣品離心，去上清，得到沉淀；(2)將步驟(1)的沉淀加入樣品預處理液，混合均勻，沸水浴滅活后冰上冷卻，高速離 心，上清即為樣品模板DNA;(3)在反應容器中加入feiDNA聚合酶0. 9 1. 8體積份數(shù)、反應液38 40體積份數(shù)、 穩(wěn)定液52 54. 5體積份數(shù)、樣品模板DNA 4. 5、體積份數(shù)、內引物FIP/BIP各2體積份數(shù)、 外引物F3/B3各4體積份數(shù)，恒溫反應；(4)在上述反應容器和陽性對照中分別加入顯色液，混勻，樣品組顯色與對照組相同則 為陽性，否則為陰性；所述步驟(3)中的內引物FIP/BIP和外引物F3/B3為以炭疽芽孢桿菌的/ 基因為靶 基因、基于環(huán)介導恒溫擴增技術設計的兩對引物。
9.根據(jù)權利要求8所述的使用炭疽芽孢桿菌檢測試劑盒的方法，其特征在于，所述的 兩對引物為外引物F3 CTGATAGTCAAACGAGAACAA外引物B3 AGTTCTTTCCCCTGCTAGA內引物FIP CGCATGCACTTCTGCATTTCTTTTAATACTTCTACAAGTAGGACACAT內引物BIP TCGTTCTTTGATATTGGTGGGAGTTTTTGATAGTGAATGATCAATTGCGAC。
10.根據(jù)權利要求8或9所述的使用炭疽芽孢桿菌檢測試劑盒的方法，其特征在于，步驟(3)中，恒溫反應的反應條件為溫度63 65°C，反應時間45 90min。
全文摘要
本發(fā)明提供一種炭疽芽孢桿菌檢測試劑盒，所述的炭疽芽孢桿菌檢測試劑盒包括以炭疽芽孢桿菌PA基因為靶基因、基于環(huán)介導恒溫擴增技術設計的兩對引物內引物FIP/BIP和外引物F3/B3。本發(fā)明的炭疽芽孢桿菌檢測試劑盒檢測效果更全面、漏檢率低。
文檔編號C12Q1/68GK102146470SQ20111004446
公開日2011年8月10日 申請日期2011年2月24日 優(yōu)先權日2011年2月24日
發(fā)明者何宇平, 周蕾, 張繼倫, 曹以誠, 杜正平, 王傳現(xiàn), 田楨干, 譚慧媚, 陸曄, 陳洵 申請人:中華人民共和國上海出入境檢驗檢疫局, 廣州華峰生物科技有限公司