專利名稱：一種無抗生素標記的植物表達載體及其構建方法與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種植物生物技術中植物轉基因的技術，具體而言，涉及一種無抗生素標記的植物表達載體及其構建方法與應用。
背景技術：
在植物遺傳工程中，植物表達載體上的選擇標記基因可分為負向選擇標記基因和正向選擇標記基因。負向選擇標記基因主要是一類抗生素標記和除草劑標記基因，雖然現(xiàn)有資料并未發(fā)現(xiàn)這些標記基因在相關物種之間以可檢測到的頻率轉移或產生危害，但人們依然關注抗生素和除草劑標記基因在轉基因植物中的潛在風險性。正向選擇標記主要是利用毒性和非毒性藥物、代謝類似物或碳源為選擇劑，一般屬于安全性選擇標記。正向選擇標記還包括無條件的正向選擇標記，即選擇培養(yǎng)基中不加入標記基因編碼酶的底物，如異戊烯基轉移酶基因等。ipt基因編碼異戊烯基轉移酶，該酶在細胞分裂素生物合成過程的第一步起催化作用，催化二甲基烯丙基二磷酸與腺苷三磷酸或腺苷二磷酸或腺苷單磷酸形成 Ν6-(Δ2-異戊基)腺苷-5'-三磷酸或N6-( Δ2-異戊基)腺苷-5' -二磷酸或Ν6-(Δ2-異戊基)腺苷-5'-單磷酸，由此形成不同的細胞分裂素，例如Ν6-(Δ2_異戊基)腺嘌呤和玉米素。因此，轉ipt基因細胞在降低或無細胞分裂素類生長調節(jié)劑的培養(yǎng)基上能分裂生長和分化，從而可利用ipt基因作為正向選擇標記基因。將ipt作為選擇標記基因和避免 ipt基因強表達引起植物生長發(fā)育異常的技術特點表現(xiàn)在以下幾方面。(1) ipt基因作為選擇標記基因影響植物生長發(fā)育。Medford等(1989)將ipt基因編碼序列與玉米熱誘導啟動子hs 70連接，發(fā)現(xiàn)在熱誘導下ipt基因過表達導致轉基因煙草植株的內源細胞分裂素含量增加，引起節(jié)間伸長不良，葉片面積減小，根系發(fā)育不良。 Smigochi和Owens (1989)也報道，攜帶ipt基因的轉基因植株不能生根或根系生長不良。 Endo (2001)以ipt基因為選擇標記基因，構建攜帶35S_ipt的植物表達載體，在無激素培養(yǎng)基上篩選煙草葉盤再生的轉基因植株，所得到的轉化率是利用卡那霉素篩選的2. 7倍，表明植物表達載體以ipt基因為選擇標記基因是可行的。但是，該研究沒有解決ipt基因過表達引起的轉基因植株形態(tài)異常的問題。(2)控制轉基因植物中ipt標記基因的表達或刪除該基因。為了克服ipt基因表達對轉基因植物生長發(fā)育的不良影響，以ipt基因作為選擇標記基因的技術得到進一步發(fā)展。Kunkel等(1999)利用地塞米松(dexamethasone)誘導系統(tǒng)顯著ipt基因表達，將與農桿菌共培養(yǎng)后的煙草葉盤培養(yǎng)在含地塞米松的培養(yǎng)基中，誘導轉基因植株再生；轉基因植株在無地塞米松的條件下ipt標記基因不能表達，從而使轉基因植株形態(tài)和生長發(fā)育正常。Ebinuma 和 KomamineOOOl)發(fā)展了多重自主轉化(Multi-Auto-Transformation)載體系統(tǒng)，該系統(tǒng)將35S-ipt插入在識別位點序列(Rs)之間，與重組酶基因(R)連接；在轉基因植株中誘導重組酶基因表達，使基因組中兩側具有識別位點序列的ipt基因和R基因片段被刪除，得到無ipt標記基因且形態(tài)、生長發(fā)育正常的轉基因植株。該技術構建上述載體的難度較大。
(3)共表達基因中ipt基因作為第二基因，其表達量降低。Kozak(1978)指出，在同一啟動子驅動下，第一基因轉錄產物的翻譯活性比第二基因強。我們實驗室利用根癌土壤桿菌胭脂堿型Ti質粒的ipt基因，將其構建為第一基因和第二基因構建植物表達載體轉化煙草細胞，用ELISA方法分析轉基因煙草植株葉片的內源玉米素核苷(ZR)和異戊烯基腺苷(IPA)水平，發(fā)現(xiàn)ipt為第一基因的3個轉基因株系中觀和IPA平均含量是野生型煙草3. 93倍，而ipt為第二基因的3個轉基因株系中觀和IPA平均含量是野生型煙草1. 88 倍，說明ipt作為第二基因的表達量明顯低于作為第一基因的表達量，而且前者莖端出現(xiàn)叢生葉等異常形態(tài)，后者無此異常形態(tài)(李朝霞等，2009)。郭建春等(Guo等，2010)報道了轉基因擬南芥中來源于章魚堿型Ti質粒的ipt基因表達差異，也指出轉基因植株中以 ipt基因作為第一基因的表達量比作為第二基因的表達量高，其內源細胞分裂素含量分別為607. 8 880. 2和503. 6 690. 8 P mol/g鮮重。此外，ipt基因作為第二基因有助于提高轉基因植株的抗病毒抗性(殷嫻等，2010)和抗冷與抗旱性(Guo等，2010)。目前，尚沒有將ipt基因以第二基因表達的方式作為標記基因的研究報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題在于克服ipt作為標記基因引起轉基因植物形態(tài)和生長發(fā)育異常，避免抗生素標記的潛在風險，而提出一種無抗生素標記的植物表達載體及其構建方法。通過這種方法構建植物表達載體的特點是(1)植物表達載體結構簡單，轉化序列中只有ι個基因盒，構建方法簡單易行；O) ipt基因既可以作為標記基因，又可以作為報告基因，在含適量低濃度細胞分裂素類生長調節(jié)劑的培養(yǎng)基上，可誘導再生轉基因植株， 且該轉基因植株就是目的基因表達的轉基因植株，可減少檢測目的基因表達的工作量；(3) ipt基因在植物表達載體中作為第二基因，其表達比作為第一基因表達水平弱，所以轉基因植物中內源細胞分裂素增加量不大，不影響轉基因植物的生長發(fā)育，從而不需要設計復雜的實驗方案刪除轉基因植物中的ipt標記基因。本發(fā)明所提供的技術方案是一種無抗生素標記的植物載體及其構建方法，用于有關植物的遺傳轉化，適用于離體條件下可被細胞分裂素類生長調節(jié)劑誘導器官發(fā)生的植物。本技術方案所包含的步驟如下(I)PCR擴增根癌土壤桿菌C58胭脂堿型Ti質粒的ipt基因序列，將其連接到 PGEM-T載體，轉化大腸桿菌JM109，篩選克隆菌，提取質粒，酶切與DNA測序，鑒定克隆的ipt 基因序列。(2)利用Xma I和Sac I限制性內切酶刪除pBI121質粒上的gus基因片段，將兩端具有Xma I和Mc I限制性內切酶位點的ipt基因連接到該質粒的T-DNA區(qū)，得到攜帶 ipt基因的pBI121質粒。(3)利用Bsu 361和)(ba I限制性內切酶酶切刪除攜帶ipt基因的pBI121質粒上的35S啟動子、npt II基因和nos啟動子3’端-120bp，回收的10 487bp片段，將兩端具有Bsu 361和Xba I限制性內切酶位點的35S啟動子連接到pBI121的10 487bp片段上， 得到無抗生素標記的植物表達載體，將其命名為PBI201。(4)利用Xba I.Bam HI和Xma I限制性酶酶切位點，將目的基因重組到pBI201表達載體的T-DNA區(qū)，得到攜帶目的基因的植物表達載體。(5)設計含不同濃度細胞分裂素類生長調節(jié)劑的培養(yǎng)基，確定細胞分裂素類生長調節(jié)劑不能誘導外植體愈傷組織分化不定芽的最高濃度。(6)凍融法將攜帶目的基因的PBI201質粒導入農桿菌。通過農桿菌介導遺傳轉化植物細胞。在不含或含低濃度細胞分裂素類生長調節(jié)劑的培養(yǎng)基上篩選轉基因細胞，誘導轉基因植株再生。禾Ij用PCR擴增鑒定轉基因植株，獲得目的基因表達的轉基因植株。本發(fā)明有如下優(yōu)點(1)本發(fā)明提供的植物表達載體構建方法，沒有抗生素基因標記，避免了轉基因植物中抗生素標記基因的潛在風險，有助于提高轉基因植物的安全性； (2)避免了植物表達載體中ipt作為第一基因的過表達引起內源細胞分裂素過量增加，使轉基因植株形態(tài)和生長發(fā)育受到不利影響的結果；(3) ipt基因既可以作為標記基因，又可以作為報告基因，在篩選培養(yǎng)基上誘導再生的轉基因植株，也是目的基因表達的轉基因植株，可減少檢測轉基因植株中目的基因是否表達的工作；(4)轉基因植株中ipt基因的弱表達可使內源細胞分裂素有所增加，可促進植株生長發(fā)育，提高轉基因植株對環(huán)境脅迫的抗逆性。


圖1為無抗生素標記的植物表達載體pBI201 T-DNA區(qū)的物理結構示意圖，圖中括號內數字為堿基順序數。圖2為pBI201質粒酶切鑒定的電泳結果。泳道1為用Bsu 361和Xba I雙酶切 PBI201質粒的產物，第一條帶長度為10 487bp (含ipt基因)，第二條帶長度為891bp (含 35S啟動子)；泳道2為未酶切的pBI201質粒；M表示核酸分子量標記D016-2。圖3為MS2培養(yǎng)基上誘導轉基因細胞分化不定芽。A表示農桿菌感染的外植體，在篩選培養(yǎng)基上分化不定芽；CK表示無農桿菌感染的對照外植體，在篩選培養(yǎng)基上無不定芽分化。
具體實施例方式實施例1，ipt基因和35S啟動子的克隆(1) ipt基因克隆根據Wood等Q001)報道的根癌土壤桿菌C58胭脂堿型Ti質粒上的ipt基因序列(GenBank登錄號NC_003065)設計ipt基因編碼序列的PCR擴增引物，正義引物序列( 5，-CCCGGGATGGATCTGCGTCTAATTTT-3，)和反義引物序列(5，-GAGCTCCTAATACATTCCGAATGGA T-3’)5’端分別具有XmaI和Mc I酶切位點，擴增產物片段長度為73^p。以根癌土壤桿菌C58胭脂堿型Ti質粒為模板。在50 μ 1反應體系中加入高保真pfu聚合酶2U，Ti質粒 20ng，dNTP 200 μ mol/L,引物濃度各為20 P mol/L和IOXpfu擴增緩沖液5 μ 1，超純水補足到50 μ 1。擴增條件為94°C預變性4分鐘，然后94°C變性1分鐘，55°C退火1分鐘，72°C 延伸2分鐘，共30次循環(huán)，最后在72°C下保溫10分鐘。在含溴化乙錠的1 %瓊脂糖凝膠板中電泳PCR擴增產物后，于長波紫外光下，切取含有DNA片段的凝膠，用上海申能博彩生物科技有限公司3S核酸純化試劑盒純化DNA片段。按照Promega公司pGEM-T Easy試劑盒使用指南，將擴增的DNA片段連接到pGEM-T載體上，用3 μ 1連接轉化產物與大腸桿菌菌株JM109感受態(tài)細胞50 μ 1混合，再將轉化處理的JM109細胞涂布于含有X_gal80mg/L、IPTG 100mg/L和氨芐青霉素100mg/L的LB培養(yǎng)基上。過夜培養(yǎng)后，挑選白色菌落，堿裂解法提取質粒。在20 μ 1反應體系中，加入質粒DNA 0. 1 μ g，IOXEco RI酶緩沖液2μ 1與Eco RI 10U，37°C恒溫水浴中酶切反應4小時。電泳酶切產物，鑒定出攜帶含有插入目的DNA片段的pGEM-T載體的JM109細胞克隆，然后在上海生工生物技術有限公司對該載體插入的DNA序列測序，將測序結果與NCBI基因庫中ipt 基因序列比對，確定克隆得到ipt基因序列正確，將其命名為T-ipt質粒。(2)35S啟動子的克隆根據Chen等(2003)報道的雙元載體pBI121質粒的DNA序列(GenBank登錄號 AF485783. 1)設計35S啟動子PCR擴增引物，正義和反義引物5’端分別具有Bsu 361和Xba I 位點，即 5，-CCTAAGGCATGATTACGCCAAGCTTG-3，和 5，-TCTAGAGTCCCCCGTGTTCTCTCCAA-3，， 擴增序列長度為891bp。以本實驗室保存的PBI121質粒為PCR擴增模板，PCR擴增、載體連接和克隆細胞鑒定方法與本實施例中的(1)相同。將克隆的35S啟動子命名為T-35S。實施例2，構建無抗生素標記的植物表達載體(1)用Xma I和Sac I核酸限制性內切酶雙酶切T_ipt質粒和雙元載體pBI121質粒。具體做法是，使用Fermentas公司的Xma I和Sac I核酸限制性內切酶，在20 μ 1反應體系中加入T-ipt質粒DNA 0. 5 μ g，IOXTango雙酶切反應緩沖液2 μ 1與Xma I和Sac I 各10U，37°C恒溫水浴中酶切反應4 6小時。電泳酶切產物，于長波紫外光下，快速切取含有DNA片段的凝膠，用上海申能博彩生物科技有限公司3S核酸純化試劑盒純化ipt基因片段。用同樣的酶切和純化酶切產物方法，得到長度為12 868bp的pBI121片段。(2)1 1基因與雙元載體？81121質粒連接。在10 μ 1連接反應體系中，加入2XT4 DNA連接酶緩沖液5μ l，ipt基因片段3μ 1，質粒ρΒΙ121片段1μ 1和1\ DNA連接酶1 μ 1， 4°C下連接過夜。3μ 1連接轉化產物與大腸桿菌菌株JM109感受態(tài)細胞50μ 1混合，將轉化處理的大腸桿菌菌株JM109細胞涂布在含有卡那霉素100mg/L的LB培養(yǎng)基上，過夜培養(yǎng)。 選取單菌落，堿裂解法提取質粒，按照本實施例中(1)的方法，用Xma I和Sac I酶雙酶切， 電泳酶切產物，鑒定出攜帶含有ipt基因的pBI121質粒的克隆細胞。將含有ipt基因的質粒命名為pBI121-ipt。(3)Bsu 361和Xba I雙酶切酶切刪除pBI121_ipt質粒上的npt II基因、35S啟動子和nos啟動子3，端-120bp。根據Gynheung An等(1986)研究，刪除nos啟動子3， 端-64bp以上，nos啟動子驅動下游基因表達活性基本消失。按照本實施例(1)中的方法，用 Bsu 361和Xba I雙酶切pBI121_ipt和T-35S質粒，電泳純化，得到無npt II基因、35S啟動子和nos啟動子3’端部分序列，長度為的10 647bp的pBI121-ipt片段。同樣地，用Bsu 361和Xba I雙酶切T-35S質粒的35S啟動子片段。按照本實施例(2)中的方法，用2XT4 DNA連接酶連接pBI121-ipt片段和35S啟動子片段，轉化大腸桿菌JM109，在含100mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基上篩選克隆菌，酶切鑒定陽性克隆質粒。將得到無抗生素標記的植物表達載體命名為PBI201。附圖1表示pBI201質粒T-DNA區(qū)的物理結構示意圖，附圖2表示 PBI201質粒的雙酶切鑒定。(4)將目的基因連接到pBI201。利用35S與ipt基因之間的Xba I、Bam HI和Xma I酶切位點，可將目的基因作為第一基因連接到PBI201質粒上。本實施例中使用的目的基因是色氨酸單氧化酶基因(tryptophan 2-monooxygenase, iaaM)編碼序列，在T-載體上該序列兩端分別具有Xba I和Bam HI酶切位點。具體做法是，在20 μ 1反應體系中加入具有 iaaM基因的T-質粒0.5yg，IOXTango雙酶切反應緩沖液2μ 1與Xba I和Bam HI內切酶10U，37°C恒溫水浴中酶切反應4 6小時。按照本實施例(1)中的方法電泳純化酶切產物。同樣，用Xba I和Bam HI內切酶雙酶切和純化酶切產物方法，得到pBI201片段。按照本實施例中(2)的方法，將iaaM基因片段連接到pBI201質粒中、轉化大腸桿菌JM109，在含 100mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基上篩選克隆菌，酶切鑒定，得到攜帶目的基因iaaM的pBI201 質粒。實施例3，農桿菌介導的遺傳轉化和轉基因再生植株的篩選(1)農桿菌LBA4404的遺傳轉化。用攜帶目的基因iaaM的pBI201質粒0. 1 μ g與 100 μ 1農桿菌LBA4404感受態(tài)細胞混合，凍融法轉化農桿菌。然后，在含有80mg/L利福平和100mg/L卡那霉素的YEB培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 48小時，分別取單菌落于2ml的YEB液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，堿裂解法微量提取質粒，用Bsu 361和Xba I酶雙酶切后電泳觀察鑒定， 確定攜帶含有iaaM基因的pBI201質粒的農桿菌細胞克隆。(2)以煙草K326品種為材料，確定葉外植體不能分化不定芽的最高細胞分裂素類生長調節(jié)劑的濃度。具體做法是，在MS培養(yǎng)基(含0. 01mg/L α -萘乙酸，3%蔗糖和0. 65% 瓊脂，ΡΗ5. 8)中分別加入0,0. 02,0. 04,0. 06,0. 08和0. lmg/L芐氨基腺嘌呤。取3月齡植株上的幼葉，用自來水洗凈晾干。在超凈工作臺上，將葉片放入無菌燒杯中，用70%酒精浸泡葉片30秒，然后用10%次氯酸納對葉片表面消毒6分鐘，無菌水清洗5次。然后，將無菌葉片剪切成0. 5 1. Ocm2大小，接種到含不同濃度芐氨基腺嘌呤的MS培養(yǎng)基上，在溫度 26士 1°C、光照強度20001χ、16小時光照和8小時黑暗下培養(yǎng)。培養(yǎng)4周后，在芐氨基腺嘌呤濃度為0和0. 02mg/L的MS培養(yǎng)基上，葉外植體上沒有不定芽的分化，在含芐氨基腺嘌呤其他濃度的MSl培養(yǎng)基上葉外植體的愈傷組織能分化不定芽，并隨著濃度升高，不定芽分化的頻率增加。因此，確定MS培養(yǎng)基中芐氨基腺嘌呤濃度為0.02mg/L是的煙草K326品種葉外植體不能分化不定芽的最高濃度。由于本實施例中使用的目的基因iaaM的表達產物能促進細胞內生長素的合成，所以在本實施例中的篩選轉基因產物所用的MS培養(yǎng)基中不添加α “萘乙酸，僅添加0. 02mg/L芐氨基腺嘌呤，將此培養(yǎng)基命名為MS2培養(yǎng)基。(3)煙草葉片的遺傳轉化。按照本實施例中(2)的方法進行葉外植體的表面消毒， 將無菌葉片剪切成0. 5 1. Ocm2大小，用于感染農桿菌。取YEB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)的農桿菌菌液2ml，加入到20ml同一培養(yǎng)基中，在 28°C、每分鐘180轉的條件下震蕩培養(yǎng)4 6小時。將葉外植體放入OD6tltl = 0. 2 0. 5的菌液中，在每分鐘80轉的搖床上震蕩感染10分鐘。然后，在超凈工作臺內，用無菌濾紙上吸除葉外植體上多余的菌液后，將葉片接種在MS2培養(yǎng)基上，在26士 1°C、黑暗條件下共培養(yǎng)3天。同時將未感染農桿菌的葉片培養(yǎng)在相同的培養(yǎng)基上，作為對照。(4)篩選抗性愈傷組織與誘導植株再生。將共培養(yǎng)后的葉外植體和對照轉移到含羧芐青霉素100mg/L的MS2培養(yǎng)基上培養(yǎng)。每隔3 4天將葉外植體轉移到同一新配制的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同本實施例中(2)采用的方法。經過3 4周的培養(yǎng)后，從農桿菌感染的葉外植體邊緣個別部位形成小愈傷組織，再經過1 2周培養(yǎng)，從愈傷組織上分化出不定芽(附圖3)，而對照葉沒有不定芽分化。無菌苗生長到2cm左右長時，將無菌苗從莖基部切離，轉移到1/2MS生根培養(yǎng)基(1/2大量元素濃度的MS基本培養(yǎng)基+羧芐青霉素 100mg/L+l%蔗糖+0.6%瓊脂，pH = 5.8)中誘導生根，培養(yǎng)條件同上。10天后，從無菌苗莖基部產生多條幼根。根長達到1 2cm長后，取出生根苗，小心清除幼苗根系的瓊脂，移栽到土壤中。移栽初期，用塑料薄膜遮蓋，保持相對濕度90%以上，溫度20 25°C。移栽苗恢復生長后，逐步降低相對濕度，直到與自然環(huán)境的相對濕度一致。(5)轉基因植株的PCR擴增鑒定。取再生植株幼葉0. lg，在液氮中快速研磨成粉， 迅速轉入預冷的1. 5ml離心管中，立即加入65°C預熱的2X十六烷基三甲基溴化氨(CTAB) 提取緩沖液0.5ml，在65°C水浴中提取30分鐘。然后，加入等量的氯仿/異戊醇(24:1)， 來回顛倒抽提。每分鐘12000轉離心10分鐘。取上清液0. 4ml，加入_20°C預冷的異丙醇0.8ml，來回顛倒混勻，溶液中出現(xiàn)絲狀DNA物質。挑出絲狀DNA物質，用76%乙醇(含 lOmmol/L乙酸銨)漂洗20分鐘后，稍微干燥，用0. 5ml TE緩沖液溶解。進一步純化DNA的步驟與 Williams 等(1990)描述的相同(Nucleic Acids Res. 18 :6531_6535，1990)。設計用兩種DNA序列的PCR擴增引物，一種是35S啟動子片段，其正義引物為 5’ -CACAGATGGTTAGAGAGGCT-3，，反義引物為 5， -TTACGGCGAGTTCTGTTAGG-3，， 擴增產物長度為315bp ；另一種是ipt基因片段，其正義引物和反義引物分別為 5，-GCGGGCTTATTCTTGAGGGA-3，和 5，-ATTTCTGTTCTTGTCGGCGT-3，，擴增產物長度為 390bp。 在50μ1 PCR擴增體系中，各加入葉片總DNA IOOng, Tag DNA聚合酶3U，dNTP 200ymol/ L，正義和反義引物濃度各為20 P mol/L，10 X Tag DNA酶緩沖液5 μ 1，超純水補足到50 μ 1。 擴增條件同實施例一(1)中的方法相同。同時，用ΡΒΙ201質粒和非轉基因植株葉片總DNA 為模板，分別作為陽性和陰性對照。電泳擴增產物，利用凝膠成像儀觀察電泳結果，陽性對照和轉基因植株的PCR產物出現(xiàn)長度為315bp和390bp的DNA條帶，而陰性對照無這些DNA 條帶。
權利要求
1.植物表達載體中T-DNA含有一個基因盒，該基因盒由花椰菜花葉病毒RNA基因 35S(CaMV 35S)啟動子、)(ba I,Bam HI和Xma I核酸限制性酶酶切位點、異戊烯基轉移酶基因(ipt)編碼序列和nos終止序列組成。
2.如權利要求1所述的植物表達載體，其特征在于所述的ipt基因編碼序列是從根癌土壤桿菌C58胭脂堿型Ti質粒中克隆的，堿基數量為72!3bp，其編碼序列如SEQ NO 2所示的氨基酸序列。
3.如權利要求1所述的植物表達載體，其特征在于在T-DNA右邊界與CaMV35S啟動子之間為序列表SEQ NO 1所示的263個堿基對。
4.轉基因植物中攜帶如權利要求2所述的ipt基因編碼序列和權力要求3所述的特征序列。
5.如權利要求4所述的轉基因植物，其種類為煙草，以及需要細胞分裂素誘導離體培養(yǎng)細胞和組織器官發(fā)生的植物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種無抗生素標記的植物表達載體及其構建方法，該載體的T-DNA區(qū)含有一個基因盒，由CaMV 35S啟動子、Xba I、Bam HI和XmaI核酸限制性酶酶切位點、異戊烯基轉移酶基因(isopentenyl transferase，ipt)和nos終止序列組成。構建該載體的方法是以雙元載體pBI121為基礎，用ipt基因替換gus基因，通過Bsu 36I和Xba I酶切位點刪除npt II基因，重新將CaMV 35S啟動子連接到T-DNA區(qū)。采用本發(fā)明提供的技術方案，在含適量低濃度細胞分裂素類生長調節(jié)劑的培養(yǎng)基上可誘導再生轉基因植株，所獲得的轉基因植株就是目的基因表達的轉基因植株，可減少鑒定目的基因是否表達的步驟，并避免抗生素標記基因的潛在風險性。
文檔編號C12N15/66GK102181474SQ20111004682
公開日2011年9月14日 申請日期2011年2月28日 優(yōu)先權日2011年2月28日
發(fā)明者何艷, 張彥, 李朝霞, 殷嫻, 潘芳, 王春城, 肖尊安, 肖桔清 申請人:北京市園林綠化局, 北京師范大學