專(zhuān)利名稱(chēng)：乙型肝炎病毒熒光定量pcr檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，特別涉及一種熒光定量PCR檢測(cè)乙型肝炎病毒核酸的
試齊U盒。
背景技術(shù)：
乙型肝炎病毒OfepatitiS B Virus, HBV)的免疫學(xué)檢測(cè)是診斷HBV感染的傳統(tǒng)方法。一般認(rèn)為，在血清或血漿中乙肝病毒表面抗原(HBsAg)的存在，就表明已感染乙肝病毒，但HBsAg的出現(xiàn)并不能提供病毒在體內(nèi)復(fù)制活動(dòng)的信息。單一 e抗原(HBeAg)作為判斷乙肝病毒復(fù)制是否活躍、傳染性強(qiáng)弱的免疫指標(biāo)是不夠確切的。隨著基因診斷技術(shù)的不斷發(fā)展和臨床應(yīng)用，血清中HBV-DNA的水平被認(rèn)為既能證明乙肝病毒的存在，又能反映病毒的活性，其可信值要高于免疫法，對(duì)臨床診斷治療合理用藥和判斷預(yù)后具有重要意義。DNA檢測(cè)的目的主要是判斷患者體內(nèi)病毒復(fù)制的程度及傳染性。在判斷乙肝的轉(zhuǎn)歸，用藥療效等方面DNA檢測(cè)有很重要的作用，另外，DNA檢測(cè)也是重要的用藥指征，尤其是抗病毒治療?，F(xiàn)在基因檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于臨床。DNA的檢測(cè)主要涉及到兩個(gè)方面，核酸的提取和核酸的擴(kuò)增檢測(cè)。血清中病毒核酸的提取，目前主要有四種方法(1)直接煮沸法向血清中加入核酸裂解液，直接煮沸，高速離心，上清即為模板。 其優(yōu)點(diǎn)是易于操作；缺點(diǎn)是不能有效去除血清中抑制PCR的因素，弱陽(yáng)性經(jīng)常無(wú)擴(kuò)增。(2)濃縮煮沸法先將血清濃縮，再加裂解液，煮沸，高速離心，上清為模板，這種方法是目前國(guó)內(nèi)臨床通用的方法，其優(yōu)點(diǎn)是能部分去除“直接煮沸法”中無(wú)法去除的抑制性因素；缺點(diǎn)是不同廠家的濃縮效果不一樣，有的可以看到沉淀，有的無(wú)法看到。看得到沉淀的是因?yàn)閷⒉《九c蛋白都濃縮了，導(dǎo)致后面加入裂解液時(shí)很難充分混勻；無(wú)法看到沉淀的， 使操作者無(wú)法確定吸棄上清時(shí)會(huì)不會(huì)把病毒一起吸棄，而導(dǎo)致病毒損失，導(dǎo)致定量不準(zhǔn)或成為假陰性。(3)柱提取法血清通過(guò)裂解，過(guò)柱后核酸吸附到膜上，通過(guò)兩次洗滌，最后洗脫下來(lái)的為模板。這種方法相對(duì)前兩種提取方法而言，提取的核酸純度大大提高，不但可用于下游PCR實(shí)驗(yàn)，還可用來(lái)做其他分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，但缺點(diǎn)是手工操作過(guò)多，效率低，且無(wú)法自動(dòng)化。(4)磁分離方法磁分離是利用功能化磁性納米顆粒的表面配體(或受體)與受體(或配體)之間特異性相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)靶向生物目標(biāo)的快速分離。目前，磁分離方法已廣泛應(yīng)用于核酸(DNA和RNA)、蛋白質(zhì)、酶、細(xì)胞等多種生物物質(zhì)的分離與純化。此方法具備上述所有方法的優(yōu)點(diǎn)，并且能輕而易舉實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。不過(guò)，所用試劑基本上為國(guó)外所壟斷，價(jià)格非常昂貴，從而限制了其在我國(guó)的廣泛應(yīng)用。臨床上定量檢測(cè)HBV-DNA的方法目前主要是基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的技術(shù)及其改進(jìn)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展迅速的一種核酸檢測(cè)技術(shù)，使用一種帶有熒光檢測(cè)裝置的PCR擴(kuò)增儀，熒光檢測(cè)裝置能夠按照一定的程序周期性地發(fā)出特定波長(zhǎng)的激發(fā)光，收集檢測(cè)熒光信號(hào)，通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)的動(dòng)態(tài)變化實(shí)時(shí)反映PCR的每個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后可通過(guò)軟件自動(dòng)分析獲得擴(kuò)增曲線，根據(jù)擴(kuò)增曲線與熒光閾值線的交點(diǎn) (即Ct值)以及擴(kuò)增曲線的形狀，可以判斷陰陽(yáng)性結(jié)果。如果同一反應(yīng)中有已知濃度的定量參考品或標(biāo)準(zhǔn)品，則可以通過(guò)軟件自動(dòng)分析獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，由此實(shí)現(xiàn)對(duì)未知樣本的定值 (即定量檢測(cè))。與傳統(tǒng)的PCR相對(duì)比，其在反應(yīng)體系中增加了一條兩端分別標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的探針。探針結(jié)構(gòu)完整時(shí)，熒光報(bào)告基團(tuán)發(fā)出的熒光能量被淬滅基團(tuán)吸收，呈現(xiàn)淬滅效應(yīng)；如果擴(kuò)增過(guò)程中有靶序列的存在，隨著目標(biāo)片段的延伸，探針?lè)肿又饾u被Taq酶水解切斷，熒光報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)相互解離，阻斷了二者間熒光能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)， 熒光報(bào)告基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)被熒光檢測(cè)裝置收集。隨著擴(kuò)增的進(jìn)行，熒光信號(hào)隨著目的片段的擴(kuò)增而呈現(xiàn)線性增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，可以通過(guò)焚光PCR儀自帶的軟件自動(dòng)分析數(shù)據(jù)， 可以獲得陰陽(yáng)性結(jié)果和樣本濃度的定值結(jié)果，因此，該技術(shù)在靶多核苷酸樣品的檢測(cè)和定量分析中，已逐漸取代傳統(tǒng)的PCR方法，得到十分廣泛的應(yīng)用。國(guó)內(nèi)已有多種基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)定量檢測(cè)HBV-DNA的試劑盒應(yīng)用于臨床檢測(cè)中，這些試劑盒所提供的HBV-DNA提取方法主要是煮沸法，但是，有很多不足之處1) 特異性不是很好，不能檢測(cè)出所有HBV的八個(gè)基因型(A H) ；2)核酸提取過(guò)程較復(fù)雜，樣本處理耗時(shí)長(zhǎng)，且在處理樣本時(shí)，經(jīng)過(guò)煮沸裂解、高速離心富集DNA等多個(gè)步驟，樣本中的 DNA存在損耗，尤其對(duì)于高濃度的樣本，裂解不充分、富集不完全，會(huì)造成DNA的大量丟失導(dǎo)致樣本定量偏低，同時(shí)由于采用了水浴或金屬浴的高溫加熱步驟，容易造成氣溶膠污染。3) 檢測(cè)靈敏度低，約在500IU/ml左右；定量范圍窄，一般在1. 00E+03IU/ml 1. 00E+08IU/ml 之間，對(duì)于臨床高值(大于1. 00E+08IU/ml)和低值(小于1. 00E+03IU/ml)的樣本無(wú)法準(zhǔn)確定量；4)沒(méi)有設(shè)置陽(yáng)性?xún)?nèi)對(duì)照(即內(nèi)標(biāo))，無(wú)法監(jiān)控假陰性；5) —般沒(méi)有預(yù)防PCR產(chǎn)物污染的措施；6)沒(méi)有熒光歸一化校正系統(tǒng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種乙型肝炎病毒熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，解決現(xiàn)有技術(shù)中乙型肝炎檢測(cè)試劑盒特異性差，不能檢測(cè)出所有HBV的八個(gè)基因型的技術(shù)問(wèn)題。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種乙型肝炎病毒熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒， 包括用于檢測(cè)靶多核苷酸的探針、用于擴(kuò)增靶多核苷酸的上游引物以及下游引物、PCR緩沖液和DNA聚合酶，用于檢測(cè)靶多核苷酸的探針具有SEQ No. 1序列。優(yōu)選地，用于擴(kuò)增靶多核苷酸的上游引物具有SEQ No. 2序列，下游引物具有SEQ No. 3序列。該試劑盒進(jìn)一步包括內(nèi)標(biāo)，內(nèi)標(biāo)是由具有SEQ No. 4序列的DNA插入到pUC 18T載體而構(gòu)成的重組體。優(yōu)選地，用于檢測(cè)上述內(nèi)標(biāo)的探針具有SEQ No. 5序列。該試劑盒進(jìn)一步包括核酸釋放劑，該核酸釋放劑含有莎梵婷0. 01 0. 5mmol/L, 氯化鉀50 200mmol/L，十二燒基磺酸鈉0. 01 2g/100ml以及乙醇0. 05 lml/100ml。該試劑盒進(jìn)一步包括酶混合液和dUTP，酶混合液包括耐熱DNA聚合酶和尿嘧啶 DNA糖基化酶。優(yōu)選地，酶混合液中耐熱DNA聚合酶的濃度為IU/ μ 1 5U/ μ 1，尿嘧啶DNA糖基化酶的濃度為0. 05U/ μ 1 0. 2U/ μ 1。該述試劑盒進(jìn)一步包括ROX參比染料，ROX參比染料的濃度為40 200mmol/L。本發(fā)明試劑盒因?yàn)椴捎糜糜跈z測(cè)靶多核苷酸的探針具有SEQ No. 1序列，具有很好的特異性，應(yīng)用本發(fā)明提供的試劑盒，可以對(duì)血清、血漿或乳汁等未知樣本中的HBV-DNA濃度進(jìn)行快速、準(zhǔn)確測(cè)定，特異性好，能夠檢測(cè)出HBV的八個(gè)基因型。進(jìn)一步地，因?yàn)楸景l(fā)明試劑盒加入內(nèi)標(biāo)，可以有效監(jiān)控假陰性的存在；加入ROX參比染料起到明顯的歸一化效果，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性和穩(wěn)定性有明顯改善；加入適量的UNG酶可以預(yù)防PCR產(chǎn)物污染。進(jìn)一步地，本試劑盒對(duì)HBV-DNA的提取方法進(jìn)行優(yōu)化，選擇核酸釋放的方法，采用強(qiáng)烈的蛋白變性劑，快速破壞病原體外殼蛋白結(jié)構(gòu)，釋放出病原體核酸，應(yīng)用本發(fā)明提供的試劑盒檢測(cè)待測(cè)樣本時(shí)，無(wú)需單獨(dú)提取樣本核酸，只需將待測(cè)樣本、核酸釋放劑以及其他PCR必需的組分加入反應(yīng)管中混勻即可用于檢測(cè)，無(wú)需現(xiàn)有技術(shù)中提取DNA的加熱、離心、去上清等操作， 只需一個(gè)移液器，一步即可完成DNA的釋放，在很大程度上簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)的步驟，而且檢測(cè)靈敏度有了很大的提高。


圖IA示出了本發(fā)明提供的乙型肝炎病毒熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒定量參考品 A (5. 00E+07IU/ml)、Β(5· 00E+06IU/ml)、C(5. 00E+05IU/ml)禾Π D (5. 00E+04IU/ml)的擴(kuò)增曲線圖；圖IB出了本發(fā)明提供的乙型肝炎病毒熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒定量分析的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；圖2A示出了特異性實(shí)驗(yàn)中八個(gè)樣本(包括HBV八個(gè)基因型)擴(kuò)增的結(jié)果圖；圖2B示出了特異性實(shí)驗(yàn)中四例HBV陽(yáng)性血清以及甲型肝炎病毒(HAV)、丙型肝炎病毒(HCV)、EB病毒(EBV)、巨細(xì)胞病毒(CMV)等樣本的擴(kuò)增曲線圖；圖3A示出了熒光歸一化實(shí)驗(yàn)中對(duì)同樣的12份樣本，PCR體系中加入?yún)⒈葻晒?(ROX)的擴(kuò)增結(jié)果圖；圖:3B示出了熒光歸一化實(shí)驗(yàn)中對(duì)同樣的12份樣本，PCR體系中不加入?yún)⒈葻晒?(ROX)的擴(kuò)增結(jié)果圖；圖4A示出了 PCR產(chǎn)物污染的預(yù)防實(shí)驗(yàn)中PCR體系中不加入U(xiǎn)NG酶擴(kuò)增結(jié)果圖；圖4B示出了 PCR產(chǎn)物污染的預(yù)防實(shí)驗(yàn)中PCR體系中加入U(xiǎn)NG酶擴(kuò)增結(jié)果圖；圖5示出了臨床樣本的檢測(cè)中15個(gè)臨床陰性標(biāo)本的擴(kuò)增曲線圖；圖6示出了臨床樣本的檢測(cè)中15個(gè)臨床陽(yáng)性標(biāo)本的擴(kuò)增曲線圖；圖7示出了臨床樣本的檢測(cè)中濃度為5. 0X102IU/ml 5. 0X109IU/ml的8個(gè)梯度樣本的擴(kuò)增曲線圖；圖8示出了臨床樣本的檢測(cè)中濃度為5. 0X102IU/ml 5. 0X109IU/ml的8個(gè)梯度樣本的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；圖9A示出了臨床樣本的檢測(cè)中500IU/ml樣本各重復(fù)8次的擴(kuò)增曲線圖；圖9B示出了臨床樣本的檢測(cè)中100IU/ml樣本各重復(fù)8次的擴(kuò)增曲線圖；以及圖9C示出了臨床樣本的檢測(cè)中50IU/ml樣本各重復(fù)8次的擴(kuò)增曲線圖。
具體實(shí)施例方式應(yīng)該指出，以下詳細(xì)說(shuō)明都是示例性的，旨在對(duì)所要求的本發(fā)明提供進(jìn)一步的說(shuō)明。除非另有指明，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。在本發(fā)明的一種具體實(shí)施方式
中，提供了一種乙型肝炎病毒熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，包括以下組分(1)用于檢測(cè)乙型肝炎病毒靶多核苷酸的探針HBV-P具有SEQ No. 1序列，源于乙肝病毒表面抗原S基因的保守區(qū)域，SEQ No. 1序列為anvitrogen公司合成):SEQ No. 1 :5，-CCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTATTGG-3，；優(yōu)選地，SEQ No. 1羧基端用FAM標(biāo)記，羥基端用BHQl猝滅基團(tuán)修飾。在本發(fā)明的其他實(shí)施方式中，還可以選用ΤΕΤ、JOE、HEX等熒光素標(biāo)記，配合選用DABCYL、TAMRA、BHQ2、 BHQ3等猝滅基團(tuán)。(2)用于擴(kuò)增乙型肝炎病毒靶多核苷酸的上游引物及下游引物，源于乙肝病毒表面抗原S基因的保守區(qū)域，擴(kuò)增上游引物HBV-F具有SEQ No. 2序列，擴(kuò)增下游引物HBV-R 具有SEQ No. 3序列，(Invitrogen公司合成)SEQ No. 2 5' -ATCGCTGGATGTGTCTGCTGCGTTTT-3，；SEQ No. 3 5' -CTGGAATTAGAGGACAAACGGGCAACAT-3，；(3) 10XPCR反應(yīng)緩沖液包括pH7. 5的200mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽， 30mmol/L氯化鎂，500mmol/L氯化鉀，0. 2ml/100ml曲拉通和10ml/100ml甲酰胺(各組分購(gòu)自Sigma公司)；(4)脫氧核糖核苷三磷酸為dATP、dCTP、dGTP和dTTP (均購(gòu)自Promega公司)；(5) DNA 聚合酶(Taq 酶)(購(gòu)自 Promega 公司)。根據(jù)本發(fā)明提供的試劑盒，因?yàn)椴捎昧松鲜鎏结樅蜕舷掠我?，所以具有很好的特異性，?yīng)用本發(fā)明提供的試劑盒，可以對(duì)血清、血漿或乳汁等未知樣本中的HBV-DNA濃度進(jìn)行快速、準(zhǔn)確測(cè)定，特異性好，能夠檢測(cè)出HBV的八個(gè)基因型。優(yōu)選地，本發(fā)明提供的試劑盒進(jìn)一步包括核酸釋放劑莎梵婷0. 01 0. 5mmol/L, 氯化鉀50 200mmol/L，十二燒基磺酸鈉0. 01 2g/100ml，乙醇0. 05 lml/100ml (各組分購(gòu)自Sigma公司)。選擇核酸釋放的方法，采用強(qiáng)烈的蛋白變性劑，快速破壞病原體外殼蛋白結(jié)構(gòu)，釋放出病原體核酸，無(wú)需加熱，無(wú)需離心，只需一個(gè)移液器，即可完成DNA的釋放和提取，而且檢測(cè)靈敏度有了很大的提高。優(yōu)選地，本發(fā)明提供的試劑盒進(jìn)一步包括內(nèi)標(biāo)(陽(yáng)性?xún)?nèi)對(duì)照)本發(fā)明采用的陽(yáng)性對(duì)照品為一段長(zhǎng)為97堿基對(duì)的人工合成DNA序列插入pUC18T載體的重組體，即質(zhì)粒， 濃度為 1. 00E+05copies/ml 1. 00E+06copies/ml,97 堿基對(duì)的序列 SEQ No. 4 如下所示 (Invitrogen 公司合成)SEQ No. 4 5 ’ -ATCGCTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATATCTTCCTCCATCCTGCTAGGTGCCTCATCTTCTTAGC TCTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTAATTCCAG-3’ ；在本試劑盒中用于內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增的上游引物及下游引物與用于靶多核苷酸擴(kuò)增的上游引物及下游引物相同，作為PCR擴(kuò)增體系中的內(nèi)標(biāo)，可以預(yù)防由于樣本中可能存在的PCR干擾物質(zhì)導(dǎo)致的假陰性。優(yōu)選地，用于檢測(cè)內(nèi)標(biāo)的探針HBVIC-P具有SEQ No. 5序列SEQ No. 5:5' -TTCCTCCATCCTGCTAGGTGCCTCATCTTCTTAGCT-3‘；優(yōu)選地，SEQ No. 5羧基端用HEX標(biāo)記，羥基端用DABCYL猝滅基團(tuán)修飾。在本發(fā)明的其他實(shí)施方式中，SEQ No. 5還可以選用不同于SEQ No. 1的熒光素標(biāo)記，如ΤΕΤ、J0E、FAM 等，配合選用BHQ1、TAMRA、BHQ2、BHQ3等猝滅基團(tuán)。優(yōu)選地，本發(fā)明提供的試劑盒進(jìn)一步包括參比染料，ROX參比染料(購(gòu)自Roche公司)或其他適用于熒光定量PCR的參比染料。加入ROX參比染料起到明顯的歸一化效果， 對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性和穩(wěn)定性有明顯改善。優(yōu)選地，本發(fā)明提供的試劑盒進(jìn)一步包括酶混合液和dUTP (購(gòu)自Promega公司)， 其中酶混合液包含濃度為1 5U/ μ 1的耐熱DNA聚合酶(Taq酶)和濃度為0. 05 0. 2U/ μ 1的尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)，其中UNG酶具有降解含有dU的PCR產(chǎn)物的功能，利用UNG酶和PCR反應(yīng)液中的dUTP可以起到預(yù)防PCR產(chǎn)物污染的作用。優(yōu)選地，本發(fā)明提供的試劑盒進(jìn)一步包括乙型肝炎病毒定量參考品來(lái)源于經(jīng)HBV DNA國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品(購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所)標(biāo)定的HBV強(qiáng)陽(yáng)性血清，以HBV陰性血清稀釋而來(lái)，該乙型肝炎病毒定量參考品包括A、B、C、D四個(gè)濃度組成的梯度參考品，其濃度分別為 1. 00 5. 00E+07IU/ml (A)、1. 00 5. 00E+06IU/ml (B)、1. 00 5. 00E+05IU/ml (C)、 1. 00 5. 00E+04IUs/ml (D)。優(yōu)選地，本發(fā)明提供的試劑盒進(jìn)一步包括乙型肝炎病毒陽(yáng)性對(duì)照來(lái)源于經(jīng)HBV DNA國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品(購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所)標(biāo)定的HBV強(qiáng)陽(yáng)性血清，以HBV陰性血清稀釋而來(lái)，其濃度為1. 00 5. 00E+05IU/ml ；以及乙型肝炎病毒陰性對(duì)照不含有乙肝病毒、丙肝病毒、艾滋病毒以及梅毒的滅活陰性血清。將本發(fā)明乙型肝炎病毒核酸熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒用于檢測(cè)血清、血漿等未知樣本中的HBV-DNA濃度的操作步驟是1.試劑準(zhǔn)備1) PCR反應(yīng)液包含10 XPCR反應(yīng)緩沖液，0. 2mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸， 40mmol/L 200mmol/L ROX參比染料，0. 2 μ mol/L 0. 4 μ mol/L用于靶多核苷酸擴(kuò)增的上游引物HBV-F以及下游引物HBV-R，0. 2 μ mol/L 0. 4 μ mol/L用于檢測(cè)靶多核苷酸的探針HBV-Ρ,Ο. 1 μ mol/L 0. 2 μ mol/L用于檢測(cè)內(nèi)標(biāo)的探針HBVIC-P ；2)根據(jù)待測(cè)樣本、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照以及定量參考品A D的量，按比例(反應(yīng)液38 44 μ 1/人份+酶混合液1 2 μ 1/人份+內(nèi)標(biāo)0. 2 μ 1/人份)取相應(yīng)量的PCR反應(yīng)液、酶混合液及內(nèi)標(biāo)，充分混勻成PCR-mix，瞬時(shí)離心后備用。2.核酸釋放1)每個(gè)PCR反應(yīng)管中加入該試劑盒中的核酸釋放劑2 5μ 1，在實(shí)際操作中建議深吸淺打，避免出現(xiàn)氣泡，并在不同的PCR反應(yīng)管中加入待測(cè)樣本、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照以及定量參考品A D各3 5 μ 1，吸打3-5次混勻(輕輕吸打，避免出現(xiàn)氣泡)；2)放置10分鐘以上，每個(gè)PCR反應(yīng)管加入PCR-mix 40 45 μ 1，吸打混勻2_3次， 蓋上管蓋(去除氣泡后)，2000rpm離心30秒。3.熒光PCR反應(yīng)
7
1)將PCR反應(yīng)管放入熒光定量PCR擴(kuò)增儀，按對(duì)應(yīng)順序設(shè)置待測(cè)樣本名稱(chēng)及定量參考品濃度；2)熒光檢測(cè)通道選擇選擇FAM通道(Iteportere :FAM, Quencher =None)檢測(cè) HBV ；選擇 HEX 或 VIC 通道(Importer :VIC，Quencher :None)檢測(cè)內(nèi)標(biāo)；參比熒光(Passive Reference)設(shè)置為 ROX ； 3)熒光定量PCR反應(yīng)條件為
4.結(jié)果分析反應(yīng)結(jié)束后，儀器自動(dòng)保存結(jié)果，可以利用儀器自帶的軟件進(jìn)行自動(dòng)分析(也可以手動(dòng)調(diào)節(jié)基線的開(kāi)始值、結(jié)束值以及閾值線值進(jìn)行分析)，然后記錄樣本Ct值和定值結(jié)果。擴(kuò)增曲線與閾值線的交點(diǎn)，稱(chēng)為Ct (即cycle threshold，指PCR反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)值)；儀器軟件根據(jù)各樣本Ct值大小，通過(guò)4個(gè)濃度梯度定量參考品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以自動(dòng)求得各樣本的定值結(jié)果。如果樣本擴(kuò)增曲線呈S 型，有Ct值且定值結(jié)果彡100IU/ml，可以判為陽(yáng)性；如果樣本擴(kuò)增曲線平直，無(wú)Ct值顯示 (Undet)或無(wú)定值結(jié)果顯示，可以判為陰性。特異性實(shí)驗(yàn)采用本發(fā)明提供的乙型肝炎病毒熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒對(duì)HBV八個(gè)基因型 (A H)標(biāo)準(zhǔn)品、四例HBV陽(yáng)性血清以及甲型肝炎病毒(HAV)、丙型肝炎病毒(HCV)、EB病毒 (EBV)和巨細(xì)胞病毒(CMV)已知樣本進(jìn)行檢測(cè)，考查本試劑盒的特異性。各試劑配方以及操作過(guò)程如下本發(fā)明的乙型肝炎病毒熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒包括以下組分(1)核酸釋放劑莎梵婷(surfactin)O. 01mmol/L，氯化鉀50mmol/L，十二烷基磺酸鈉(SDS)O. 01g/100ml,乙醇 0. 05ml/100ml ；(2)采用上述內(nèi)標(biāo)(陽(yáng)性?xún)?nèi)對(duì)照)；(3) 10XPCR反應(yīng)緩沖液包括pH7. 5的200mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽溶液，30mmol/L氯化鎂溶液，500mmol/L氯化鉀溶液，0. 2ml/100ml曲拉通溶液和10ml/100ml
甲酰胺溶液；(4) ROX 參比染料；(5)脫氧核糖核苷三磷酸為dATP、dCTP、dUTP、dGTP ；(6)本發(fā)明提供的用于靶多核苷酸擴(kuò)增的上游引物及下游引物；(7)本發(fā)明提供的用于檢測(cè)靶多核苷酸的探針HBV-P，羧基端用FAM標(biāo)記，羥基端用BHQl猝滅基團(tuán)修飾；用于檢測(cè)內(nèi)標(biāo)的探針HBVIC-P，羧基端用HEX標(biāo)記，羥基端用DABCYL猝滅基團(tuán)修飾；
(8)本發(fā)明提供的酶混合液包含濃度為IU/ μ 1的耐熱DNA聚合酶(Taq酶)和濃度為0. 05U/ μ 1的尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)；(9)本發(fā)明提供的乙型肝炎病毒定量參考品，濃度分別為1.00E+07IU/ml(A)、 1. 00E+06IU/ml(B)、1. 00E+05IU/ml(C)、1. 00E+04IU/ml(D)；(10)本發(fā)明提供的乙型肝炎病毒陽(yáng)性對(duì)照，其濃度為1. 00E+05IU/ml ；(11)本發(fā)明提供的乙型肝炎病毒陰性對(duì)照。操作步驟1.試劑準(zhǔn)備DPCR反應(yīng)液包含10XPCR反應(yīng)緩沖液5μ 1，0. 2mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸， 200mmol/LR0X參比染料，0. 2 μ mol/L用于靶多核苷酸擴(kuò)增的上游引物HBV-F與下游引物 HBV-R, 0. 2 μ mol/L用于檢測(cè)靶多核苷酸的探針HBV-P，0. 1 μ mol/L用于檢測(cè)內(nèi)標(biāo)的探針 HBVIC-P ；2)根據(jù)待測(cè)樣本、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照以及定量參考品A D的量，按比例(反應(yīng)液38 μ 1/人份+酶混合液2 μ 1/人份+內(nèi)標(biāo)0. 2 μ 1/人份)取相應(yīng)量的PCR反應(yīng)液、酶混合液及內(nèi)標(biāo)，充分混勻成PCR-mix，瞬時(shí)離心后備用；2.核酸釋放1)每個(gè)PCR反應(yīng)管中加入核酸釋放劑5μ 1，深吸淺打，避免出現(xiàn)氣泡，并在不同的 PCR反應(yīng)管中加入待測(cè)樣本、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照以及定量參考品A D各5 μ 1，吸打3-5 次混勻(輕輕吸打，避免出現(xiàn)氣泡)；2)放置10分鐘以上，每個(gè)PCR反應(yīng)管加入PCR-mix 40 μ 1，吸打混勻2_3次，蓋上管蓋(去除氣泡后)，2000rpm離心30秒。3.熒光PCR反應(yīng)1)將PCR反應(yīng)管放入熒光定量PCR擴(kuò)增儀，按對(duì)應(yīng)順序設(shè)置待測(cè)樣本名稱(chēng)及定量參考品濃度；2)熒光檢測(cè)通道選擇(ABI 7500儀器為例)選擇FAM通道(Iteportere =FAM, Quencher :None)檢測(cè) HBV ；選擇 HEX 或 VIC 通道(Importer :VIC，Quencher :None)檢測(cè)內(nèi)標(biāo)；參比熒光(Passive Reference)設(shè)置為ROX ；3)熒光定量PCR反應(yīng)條件為
權(quán)利要求
1.一種乙型肝炎病毒熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，包括用于檢測(cè)靶多核苷酸的探針、用于擴(kuò)增靶多核苷酸的上游引物以及下游引物、PCR緩沖液和DNA聚合酶，其特征在于，所述用于檢測(cè)靶多核苷酸的探針具有SEQ No. 1序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述用于擴(kuò)增靶多核苷酸的上游引物具有SEQ No. 2序列，所述下游引物具有SEQ No. 3序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒進(jìn)一步包括內(nèi)標(biāo)，所述內(nèi)標(biāo)是由具有SEQ No. 4序列的DNA插入到pUC18T載體而構(gòu)成的重組體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒進(jìn)一步包括用于檢測(cè)內(nèi)標(biāo)的探針，所述用于檢測(cè)內(nèi)標(biāo)的探針具有SEQ No. 5序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒進(jìn)一步包括核酸釋放劑， 所述核酸釋放劑含有莎梵婷0. 01 0. 5mmol/L，氯化鉀50 200mmOl/L，十二烷基磺酸鈉 0. 01 2g/100ml,乙醇 0. 05 lml/100ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒進(jìn)一步包括酶混合液和 dUTP，所述酶混合液包括耐熱DNA聚合酶和尿嘧啶DNA糖基化酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述酶混合液中耐熱DNA聚合酶的濃度為 υ/μ 1 5υ/μ 1，尿嘧啶DNA糖基化酶的濃度為0. 05U/ μ 1 0. 2υ/μ 1。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒進(jìn)一步包括 ROX參比染料，所述ROX參比染料的濃度為40 200mmol/L。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種乙型肝炎病毒熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，包括用于檢測(cè)靶多核苷酸的探針、用于擴(kuò)增靶多核苷酸的上游引物以及下游引物、PCR緩沖液和DNA聚合酶，其中，用于檢測(cè)靶多核苷酸的探針具有SEQ No.1序列。本發(fā)明試劑盒因?yàn)椴捎糜糜跈z測(cè)靶多核苷酸的探針具有SEQ No.1序列，具有很好的特異性，應(yīng)用本發(fā)明提供的試劑盒，可以對(duì)血清、血漿或乳汁等未知樣本中的HBV-DNA濃度進(jìn)行快速、準(zhǔn)確測(cè)定，特異性好，能夠檢測(cè)出HBV的八個(gè)基因型。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK102174660SQ20111004687
公開(kāi)日2011年9月7日 申請(qǐng)日期2011年2月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月25日
發(fā)明者戴立忠 申請(qǐng)人:湖南圣湘生物科技有限公司