專利名稱：濾泡素抑制素樣蛋白1在調(diào)節(jié)鈉鉀atp酶活性中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及濾泡素抑制素樣蛋白1(即FSTL1)在提高鈉鉀ATP酶活性從而用于治療、緩解或改善相關(guān)疾病或癥狀(尤其是疼痛)中的用途。
背景技術(shù)：
目前的研究發(fā)現(xiàn)鈉鉀ATP酶在人體的正常代謝中具有非常重要的作用，廣泛分布于各種組織器官的細(xì)胞膜上，如腎、心臟、肺和神經(jīng)系統(tǒng)等。鈉鉀泵(即鈉鉀ATP酶)的活性與某些疾病或癥狀密切相關(guān)，其活性的提高或降低對(duì)這些疾病或癥狀產(chǎn)生重要的影響。例如，以下疾病或癥狀與鈉鉀泵的活性過高有關(guān)，或可通過抑制鈉鉀泵的活性得到緩解或治療研究表明鈉鉀泵可能在腎性高血壓的發(fā)病機(jī)制中有一定的作用，鈉鉀泵的活性增高促進(jìn)離子轉(zhuǎn)運(yùn)，從而助長(zhǎng)血壓升高(Wang等，CurrOpin Nephrol Hypertens. 2009Sep ；18(5) :412-20 ；Ferrari 等，Cell MolBiol (Noisy-1 e-grand). 2006Dec 30 ；52(8) :15-8);有文獻(xiàn)報(bào)道在人類的黑色素瘤細(xì)胞中鈉鉀泵的 a 亞基表達(dá)明顯升高(Mathieu 等，J Cell Mol Med. 2009Feb 20. [Epubaheadof print]);培養(yǎng)的感覺神經(jīng)元突起的生長(zhǎng)以及腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)生也與鈉鉀泵的活性過高有關(guān)，有文獻(xiàn)報(bào)道鈉鉀泵的抑制劑如地高辛，可以明顯抑制培養(yǎng)的感覺神經(jīng)元突起的生長(zhǎng)以及抑制腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)生(Penniyainen 等，NeurosciBehav Physiol. 2009Mar ；39(3)301-4. ;Mijatovic 等，Expert Opin Ther Targets. 2008Nov ；12(11) :1403-17.)。有文獻(xiàn)報(bào)道鈉鉀泵a I為治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤和非小細(xì)胞肺癌的治療祀點(diǎn),鈉鉀泵a I抑制劑有希望被用于治療(如ー種強(qiáng)心苷的新型衍生物2" -oxovoruscharin(UNBS1450))治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和非小細(xì)胞肺癌(KissR 等，.Neoplasia. 2008Mar ；10(3) :198-206 ；Kiss R 等，JPathol. 2007Jun ；212(2) :170-9.).以下疾病或癥狀與鈉鉀泵的活性偏低有關(guān)，或可通過提高鈉鉀泵的活性得到緩解或治療在家族性偏癱型偏頭痛病人中，已發(fā)現(xiàn)鈉鉀泵上有較多缺失突變，已證實(shí)這些突 變和臨床癥狀有密切的關(guān)系；還有ー些病人會(huì)出現(xiàn)癲癇癥狀(Aperia，J Intern Med. 2007Jan ；261(1) :44-52.);在糖尿病的動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)鈉鉀泵的活性和表達(dá)都有降低，其中紅細(xì)胞中的C多肽也有明顯的減少，外源補(bǔ)充C多肽會(huì)明顯提高鈉鉀泵的活性和緩解糖尿病的癥狀(Vague 等，ExpDiabesity Res. 2004Jan_Mar ;5 (I) :37-50.);在ー些重癥抑郁癥患者中紅細(xì)胞上的鈉鉀泵活性明顯降低，給予鋰鹽治療后好轉(zhuǎn)；中度的抑制鈉鉀泵的活性也可導(dǎo)致躁狂的發(fā)生(Lichtstein和 Rosen, Neurochem Res. 2001 Sep ；26 (8-9) :971-8.);臨床上見到的洋地黃中毒就是由于過度抑制鈉鉀泵的活性導(dǎo)致心肌過度興奮所致(Vivo等，Am JMed Sci. 2008Nov ；336(5) :423-8.);以往研究還證實(shí)提高肺泡鈉鉀泵的活性可以明顯改善肺損傷，肺水腫的癥狀(Factor 等，J Clin Invest. 1998 Oct I ；102(7) =1421-30.；Lecuona 等，J Bioenerg Biomembr. 2007Dec ；39(5-6) :391-5. ；Sznajder 等，J ApplPhysiol. 2002 Nov ；93(5) :1860-6)。
背根神經(jīng)節(jié)(Dorsal Root Ganglia, DRG)的小神經(jīng)元負(fù)責(zé)向脊髓傳遞溫度覺和痛覺。當(dāng)外周端受到物理或化學(xué)性刺激時(shí)，這些小神經(jīng)元的傳入纖維末稍在脊髄背角通過胞吐形式釋放突觸囊泡或大致密芯泡(LDCV)中的興奮性遞質(zhì)谷氨酸和神經(jīng)肽。目前認(rèn)為，這種興奮性信息傳遞可以被脊髄背角的中間神經(jīng)元和下行通路釋放的抑制性因子包括神經(jīng)肽類物質(zhì)阿片肽、神經(jīng)遞質(zhì)Y-氨基丁酸(GBGA)、氨基こ酸(Glycine)和5-羥色胺(Serotonin)等調(diào)節(jié)。這種抑制性調(diào)節(jié)對(duì)于正常的軀體感覺和痛覺調(diào)制都有著功能上的重要意義。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了ー些選擇性高表達(dá)在背根神經(jīng)節(jié)小神經(jīng)元細(xì)胞膜表面的受體和通道，這加深了人們對(duì)感覺信息傳遞機(jī)制的理解。這些受體和通道包括ATP門控的？2も受體、瞬時(shí)受體電位通道Vl (TRPVl)和Al (TRPAl)、電壓門控NavL 8通道和Mas相關(guān)G蛋白偶聯(lián)受體。這些膜表面分子與初級(jí)感覺傳遞、感覺神經(jīng)元的敏化及傷害性反應(yīng)的易化過程有夫。盡管目前本領(lǐng)域已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了上述一些在感覺信息傳遞中起作用的分子，然而還迫切需要研究在感覺信息傳遞過程中還有那些分子在起作用，以推動(dòng)對(duì)感覺信息傳遞的了 解，提出新的鎮(zhèn)痛策略和開發(fā)新的鎮(zhèn)痛藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的在于提供濾泡素抑制素樣蛋白I在提高鈉鉀ATP酶活性從而用于治療、緩解或改善相關(guān)疾病或癥狀(尤其是改善軀體感覺，特別是疼痛覺或溫度覺)中的用途。本發(fā)明的另一目的在于提供一種濾泡素抑制素樣蛋白I的生物活性片段，所述的活性片段具有良好的抑制軀體感覺的作用。在本發(fā)明的第一方面，提供濾泡素抑制素樣蛋白I在制備組合物中的用途，所述組合物用于通過提高鈉鉀ATP酶活性來治療、緩解或改善與鈉鉀ATP酶活性相關(guān)的疾病或癥狀。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述疾病或癥狀選自疼痛、家族性偏癱型偏頭痛、糖尿病、抑郁癥、洋地黃中毒、肺損傷或肺水腫。在本發(fā)明的另ー個(gè)實(shí)施方式中，所述組合物用于治療、緩解或改善疼痛。在ー個(gè)優(yōu)選例中，所述疼痛是身源性疼痛，優(yōu)選神經(jīng)病理性疼痛或傷害感受性疼痛。在本發(fā)明的另ー個(gè)實(shí)施方式中，所述神經(jīng)病理性痛選自背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)源性痛、三叉神經(jīng)節(jié)神經(jīng)源性痛或坐骨神經(jīng)痛。在另ー個(gè)優(yōu)選例中，所述神經(jīng)病理性疼痛為選自下組的由中樞或周圍神經(jīng)系統(tǒng)的損傷或病理改變引起的疼痛腰背痛、神經(jīng)痛、纖維性肌痛、糖尿病相關(guān)的神經(jīng)痛、多發(fā)性硬化相關(guān)的神經(jīng)痛、帯狀皰疹后神經(jīng)痛以及與HIV有關(guān)聯(lián)的神經(jīng)病理性神經(jīng)痛。在本發(fā)明的另ー個(gè)實(shí)施方式中，所述傷害感受性疼痛選自軀體傷害感受性疼痛或內(nèi)臟傷害感受性疼痛。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述傷害感受性疼痛選自癌痛、關(guān)節(jié)炎痛、術(shù)后痛或與HIV有關(guān)聯(lián)的傷害感受性疼痛。在本發(fā)明的另ー個(gè)實(shí)施方式中，所述濾泡素抑制素樣蛋白I是(a) SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(b) (a)中所限定的蛋白質(zhì)的保守性變異蛋白質(zhì)或其活性片段；或
(c)將(a)中氨基酸序列經(jīng)過1-20個(gè)(優(yōu)選1-10個(gè)，更優(yōu)選1_5個(gè))氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有提高鈉鉀ATP酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的另ー個(gè)實(shí)施方式中，所述(b)選自(I)具有SEQ ID NO : I中第156-173氨基酸序列的多肽；
(2)具有SEQ ID NO 2中第158-175位氨基酸序列的多肽；(3)由SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2的氨基酸序列缺失濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域(即FS結(jié)構(gòu)域)所形成的多肽；(4)由 SEQ ID NO :1 或 SEQ ID NO 2 的氨基酸序列缺失 Von Willebrand 型 C 結(jié)構(gòu)域(即VWC結(jié)構(gòu)域)所形成的多肽；(5)由SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2的氨基酸序列缺失EF手型II結(jié)構(gòu)域所形成的多肽；或(6)由SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2的氨基酸序列缺失EF手型連接結(jié)構(gòu)域所形成的多肽。在本發(fā)明的第二方面中，提供了一種分離的多肽，所述多肽選自(I)具有 SEQ ID NO 1 中第 156-173 位氨基酸序列 NGDSHLDSSEFLKFVEQN 的多肽，條件是該多肽不是SEQ ID NO :I所示的蛋白質(zhì)；(2)具有 SEQ ID NO 2 中第 158-175 位氨基酸序列的 NGDSRLDSSEFLKFVEQN 的多肽，條件是所述多肽不是SEQ ID NO :2所示的蛋白質(zhì)；(3)由SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2的氨基酸序列缺失濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域(即FS結(jié)構(gòu)域)所形成的多肽；(4)由 SEQ ID NO :1 或 SEQ ID NO 2 的氨基酸序列缺失 Von Willebrand 型 C 結(jié)構(gòu)域(即VWC結(jié)構(gòu)域)所形成的多肽；(5)由SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2的氨基酸序列缺失EF手型II結(jié)構(gòu)域所形成的多肽；或(6)由SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2的氨基酸序列缺失EF手型連接結(jié)構(gòu)域所形成的多肽。在本發(fā)明的第三方面中，提供了一種分離的多核苷酸，所述多核苷酸編碼本發(fā)明如上所述的多肽或SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2所示的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的第四方面中，提供了ー種載體，所述載體含有本發(fā)明如上所述的多核苷酸。在本發(fā)明的第五方面中，提供了一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞含有本發(fā)明如前所述的載體；或其基因組中整合有本發(fā)明如前所述的多核苷酸。在本發(fā)明的第六方面中，提供了本發(fā)明如前所述的多肽或SEQ ID NO :1或SEQ IDNO 2的蛋白質(zhì)的制備方法，該方法包含(a)在適合表達(dá)的條件下，培養(yǎng)本發(fā)明如前所述的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出本發(fā)明如前所述的多肽或SEQID及NO :1或SEQID和NO 2的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的第七方面中，提供了ー種通過提高鈉鉀ATP酶活性來治療、緩解或改善與鈉鉀ATP酶活性相關(guān)的疾病或癥狀的藥物組合物，它含有(a)安全有效量的本發(fā)明的多肽、SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2的蛋白質(zhì)；以及(b)藥學(xué)上可接受的載體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的藥物組合物用于治療、緩解或改善選自下組的疾病或癥狀家族性偏癱型偏頭痛、糖尿病、抑郁癥、洋地黃中毒、肺損傷、肺水腫或疼痛。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的疼痛是身源性疼痛，優(yōu)選傷害感受性疼痛或神經(jīng)病理性疼痛。在本發(fā)明的另ー個(gè)實(shí)施方式中，所述的神經(jīng)病理性痛選自背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)源性痛、三叉神經(jīng)節(jié)神經(jīng)源性痛或坐骨神經(jīng)痛。在本發(fā)明的另ー實(shí)施方式中，所述神經(jīng)病理性疼痛為選自下組的由中樞或周圍神經(jīng)系統(tǒng)的損傷或病理改變引起的疼痛腰背痛、神經(jīng)痛、纖維性肌痛、糖尿病相關(guān)的神經(jīng)痛、多發(fā)性硬化相關(guān)的神經(jīng)痛、帯狀皰疹后神經(jīng)痛以及與HIV有關(guān)聯(lián)的神經(jīng)病理性神經(jīng)痛。 在本發(fā)明的另ー個(gè)實(shí)施方式中，所述傷害感受性疼痛選自軀體傷害感受器性疼痛和內(nèi)臟傷害感受器性疼痛。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，所述傷害感受性疼痛選自癌痛、關(guān)節(jié)炎痛、術(shù)后痛或與HIV有關(guān)聯(lián)的傷害感受性疼痛。在本發(fā)明的第八方面中，提供了本發(fā)明的多肽、SEQ ID NO :1所示的蛋白質(zhì)和/或SEQ ID NO :2所示的蛋白質(zhì)在制備用于通過提高鈉鉀ATP酶活性來治療、緩解或改善與鈉鉀ATP酶活性相關(guān)的疾病或癥狀的藥物組合物中的用途。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述藥物組合物用于治療、緩解或改善選自下組的疾病或癥狀家族性偏癱型偏頭痛、糖尿病、抑郁癥、洋地黃中毒、肺損傷、肺水腫或疼痛。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的疼痛是身源性疼痛，優(yōu)選傷害感受性疼痛或神經(jīng)病理性疼痛。在本發(fā)明的另ー個(gè)實(shí)施方式中，所述的神經(jīng)病理性痛選自背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)源性痛、三叉神經(jīng)節(jié)神經(jīng)源性痛或坐骨神經(jīng)痛。在本發(fā)明的另ー實(shí)施方式中，所述神經(jīng)病理性疼痛為選自下組的由中樞或周圍神經(jīng)系統(tǒng)的損傷或病理改變引起的疼痛腰背痛、神經(jīng)痛、纖維性肌痛、糖尿病相關(guān)的神經(jīng)痛、多發(fā)性硬化相關(guān)的神經(jīng)痛、帯狀皰疹后神經(jīng)痛以及與HIV有關(guān)聯(lián)的神經(jīng)病理性疼痛。在本發(fā)明的另ー個(gè)實(shí)施方式中，所述傷害感受性疼痛選自軀體傷害感受器性疼痛和內(nèi)臟傷害感受器性疼痛。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，所述傷害感受性疼痛選自癌痛、關(guān)節(jié)炎痛、術(shù)后痛或與HIV有關(guān)聯(lián)的傷害感受性疼痛。在本發(fā)明的第九方面中，提供了本發(fā)明的多肽在制備用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和/或缺血性心臟病的藥物組合物中的用途。在本發(fā)明的第十方面中，提供了一種篩選可通過提高鈉鉀ATP酶活性治療、緩解或改善與該活性相關(guān)的疾病或癥狀的潛在物質(zhì)的方法，所述方法包括(I)將候選物質(zhì)與表達(dá)濾泡素抑制素樣蛋白I的體系接觸；(2)檢測(cè)候選物質(zhì)對(duì)濾泡素抑制素樣蛋白I的影響；若所述候選物質(zhì)可提高濾泡素抑制素樣蛋白I的表達(dá)、活性和/或分泌，則表明該候選物質(zhì)是可用于通過提高鈉鉀ATP酶活性來治療、緩解或改善與該活性相關(guān)的疾病或癥狀的潛在物質(zhì)。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述疾病或癥狀選自家族性偏癱型偏頭痛、糖尿病、抑郁癥、洋地黃中毒、肺損傷、肺水腫或疼痛。在另ー優(yōu)選例中，所述的疼痛是神經(jīng)病理性痛，優(yōu)選背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)源性痛或三叉神經(jīng)節(jié)神經(jīng)源性痛。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，步驟(I)包括在測(cè)試組中，將候選物質(zhì)加入到表達(dá)濾泡素抑制素樣蛋白I的體系中；和/或步驟(2)包括檢測(cè)測(cè)試組的體系中濾泡素抑制素樣蛋白I的表達(dá)、活性和/或分泌，并與對(duì)照組比較，其中所述的對(duì)照組是不添加所述候選物質(zhì)的表達(dá)濾泡素抑制素樣蛋白I的體系；如果測(cè)試組中濾泡素抑制素樣蛋白I的表達(dá)、活性和/或分泌在統(tǒng)計(jì)學(xué)上高于(優(yōu)選顯著高干，如高20%以上，較佳的高50%以上；更佳的高80%以上)對(duì)照組，就表明該候選物質(zhì)是可用于通過提高鈉鉀ATP酶活性來治療、緩解或改善與該活性相關(guān)的疾病或癥狀的潛在物質(zhì)。在另ー優(yōu)選例中，所述的體系選自細(xì)胞體系(如小神經(jīng)元細(xì)胞)(或細(xì)胞培養(yǎng)物體系)、亞細(xì)胞體系、溶液體系、組織體系、器官體系或動(dòng)物體系。在另ー優(yōu)選例中，所述方法還包括對(duì)獲得的潛在物質(zhì)進(jìn)行進(jìn)ー步的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和/或動(dòng)物試驗(yàn)，以從候選物質(zhì)中進(jìn)ー步選擇和確定有用的物質(zhì)。

在本發(fā)明的第i^一方面中，提供了一種篩選治療或緩解疼痛的潛在物質(zhì)的方法，所述的方法包括(I)將候選物質(zhì)與鈉鉀ATP酶的體系接觸；(2)檢測(cè)候選物質(zhì)對(duì)鈉鉀ATP酶的影響；若所述候選物質(zhì)可提高鈉鉀ATP酶的活性，則表明該候選物質(zhì)是可用于治療或緩解疼痛的潛在物質(zhì)。在本發(fā)明的第十二方面中，提供了濾泡素抑制素樣蛋白I的抑制劑在制備通過降低鈉鉀ATP酶活性來治療、緩解或改善與鈉鉀ATP酶活性相關(guān)的疾病或癥狀的組合物中的用途。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述疾病或癥狀選自腎性高血壓、腫瘤(優(yōu)選黒色素瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤或非小細(xì)胞肺癌)。在本發(fā)明的另ー個(gè)實(shí)施方式中，所述抑制劑選自抗濾泡素抑制素樣蛋白I或其活性片段的抗體；針對(duì)濾泡素抑制素樣蛋白I編碼序列的反義寡核苷酸或小干擾RNA ;或來源于鈉鉀ATP酶的肽段。在本發(fā)明的另ー個(gè)實(shí)施方式中，所述抑制劑選自(i)具有 SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 7 或 SEQ ID NO 8 所示的氨基酸序列的多肽；(ii) (i)中所限定的多肽的保守性變異多肽或其活性片段；或(iii)⑴或(ii)中任意多肽或活性片段的組合。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖I. FSTLl在DRG小神經(jīng)元中高表達(dá)圖1A.通過基因芯片檢測(cè)的候選基因在成年大鼠組織中的表達(dá)譜和背根神經(jīng)節(jié)信號(hào)強(qiáng)度與其他組織信號(hào)強(qiáng)度的比值。圖中，在各種組織中基因信號(hào)與DRG中比值的log2比例范圍用不同的色調(diào)顯示。AvilK—advillin;CalcaK—CGRPa ;Htr3a代表5_羥色胺受體3A (5-hydroxytryptamine receptor 3A) ;Plekha4代表含血小板同源性結(jié)構(gòu)域的豕族 A 的成貝 4、pleckstrin homologydomain containing, family A member 4)；Mpz代表髓鞘蛋白O (myelin proteinzero) ；P2rx3代表P2X3受體；Prphl代表外周蛋白I (peripherin I) ;Nef3代表神經(jīng)微絲3 (neurofilament 3) ;Scn7a代表鈉離子通道電壓門控型 VII a (sodiumchannel, voltage-gated type VII, a);背根神經(jīng)節(jié) GAPDH 信號(hào)強(qiáng)度為陽性對(duì)照。圖IB. RNA印跡法檢測(cè)FstllmRNA在大鼠成年神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)情況，以核糖體18s RNA作為上樣量對(duì)照；圖1C.免疫印跡檢測(cè)FSTLl蛋白( 37kD)在大鼠成年神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)情況，以肌動(dòng)蛋白作為上樣量對(duì)照；圖1D.免疫組化和免疫印跡顯示大鼠在胚胎期、出生后和成年時(shí)期背根神經(jīng)節(jié)中 FSTLl的表達(dá)情況。FSTLl的表達(dá)在胚胎15天開始，在出生后28天達(dá)到最高水平。以肌動(dòng)蛋白作為上樣量對(duì)照；圖1E.免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)在背根神經(jīng)節(jié)和脊髓背角中，F(xiàn)STLl分別與CGRP或IB4的共定位情況，F(xiàn)STLl存在于CGRP陽性或IB4陽性的神經(jīng)元中。其中，綠色表示FSTLl表達(dá)；紅色表示CGRP或IB4表達(dá)；圖1F.免疫熒光檢測(cè)FSTLl與NavL 8通道蛋白的表達(dá)情況，F(xiàn)STLl表達(dá)在含有NavL 8通道蛋白的DRG神經(jīng)元中。其中上圖中綠色表達(dá)FSTLl表達(dá)，中圖中紅色表示NavL 8通道蛋白表達(dá)，下圖為上圖和中圖的疊加(merge)。圖1G. FSTLl在不同DRG神經(jīng)元類型中的分布情況；圖1H.背根節(jié)神經(jīng)元總數(shù)情況，以及背根節(jié)FSTLl陽性的神經(jīng)元情況。圖II.免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)FSTLl與P物質(zhì)的表達(dá)和共定位情況。綠色表示FSTLl表達(dá)，紅色表示P物質(zhì)表達(dá)，箭頭所指為FSTLl表達(dá)的囊泡；圖1J.免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)FSTLl分別與TRPVl或P2X3的共定位情況。其中，紅色表示FSTLl表達(dá)；綠色表示TRPVl或P2X3表達(dá)；圖IK. RNA印跡法檢測(cè)FstlI mRNA在大鼠各組織中的表達(dá)情況，以核糖體18s RNA作為上樣量對(duì)照。圖2.證明FSTLl由小清亮囊泡分泌的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖2A.免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)在大鼠DRG的肽能神經(jīng)元和IB4陽性小神經(jīng)元中FSTLl的囊泡分布(箭頭所示)，F(xiàn)STLl不在含CGRP的大致密芯泡(LDCV)中，大部分也不在突觸孔蛋白(synaptoporin, Synpr)陽性的囊泡中。其中，綠色表示FSTLl表達(dá),紅色表示 CGRP、IB4 或 Synpr 表達(dá)；圖2B.免疫金標(biāo)記檢測(cè)DRG小神經(jīng)元胞體中FSTLl的定位情況，F(xiàn)STLl位于高爾基網(wǎng)外側(cè)附近的小清亮囊泡(箭頭)中；圖2C.用蔗糖密度梯度離心分離亞細(xì)胞組分的方法分離大鼠脊髄背角不同囊泡群，免疫印跡法檢測(cè)分離出的囊泡群中FSTLUSynpr和CGRP的表達(dá)情況。FSTLl主要存在于含有Synpr的囊泡群中，但不存在于含CGRP的囊泡群中；圖2D.免疫金標(biāo)記檢測(cè)背根的傳入纖維及脊髄背角I、II層的傳入纖維末梢中含F(xiàn)STLl囊泡的情況。FSTLl位于背根的傳入纖維及脊髄背角1、11層的傳入纖維末梢的小清亮囊泡(箭頭所示)中，箭頭所示含F(xiàn)STLl的囊泡位于突觸前膜附近。三角標(biāo)識(shí)指示突觸后致密帶；
圖2E.小鼠的后根結(jié)扎的示意圖。結(jié)扎小鼠的后根24小時(shí)以阻斷囊泡順向運(yùn)輸，會(huì)導(dǎo)致傳入纖維靠近DRG —端FSTLl的積聚；圖2F.免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)在無刺激條件下培養(yǎng)的大鼠DRG神經(jīng)元分泌FSTLl的情況。以細(xì)胞裂解液中FSTLl的總表達(dá)情況作為上樣量對(duì)照，其中柱形圖是對(duì)各泳道FSTLl分泌情況的定量分析。可以看到在大鼠DRG神經(jīng)元的培養(yǎng)液中FSTLl分泌量隨時(shí)間而增加。與對(duì)照組相比，*P < 0. 05廣P < 0. 01 ;圖2G.免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)在高鉀刺激(55mM KCl，Ih)和有無細(xì)胞外鈣條件下培養(yǎng)的大鼠DRG神經(jīng)元分泌FSTLl的情況。以細(xì)胞裂解液中FSTLl的總表達(dá)情況作為上樣量對(duì)照，其中柱形圖是對(duì)各泳道FSTLl分泌情況的定量分析。與未加高鉀刺激的對(duì)照組相比，*P < 0. 05(高鉀加鈣刺激(即柱2)與未加高鉀但加鈣刺激(即柱I)的對(duì)照組相比)，sP< 0. 05 (高鉀加鈣刺激(即柱2)與加高鉀未加鈣刺激(即柱4)的對(duì)照組相比)；圖2H.免疫印跡檢測(cè)在高鉀刺激(55mM KCl，15min)條件下大鼠脊髓腦片F(xiàn)STLl的分泌情況。高鉀刺激使FSTLl在脊髄薄片中的分泌量顯著增加，以細(xì)胞裂解液中肌動(dòng)蛋白的表達(dá)作為上樣量對(duì)照。在相同的樣品中，通過免疫印跡和HPLC檢測(cè)方法顯示CGRP和谷氨酸(Glu)水平升高。與未加高鉀刺激的對(duì)照組相比，*P < 0. 05 ；圖21.免疫印跡檢測(cè)在高鉀刺激和有無細(xì)胞外鈣條件下大鼠脊髄背角的突觸球中FSTLl的分泌情況。高鉀刺激使FSTLl在脊髓背角的突觸球中的分泌量顯著增加，以細(xì)胞裂解液中肌動(dòng)蛋白的表達(dá)作為上樣量對(duì)照，其中柱形圖是對(duì)各泳道FSTLl分泌情況的定量分析，同時(shí)也表示經(jīng)免疫印跡檢測(cè)FSTLl與CGRP存在共分泌。與未加高鉀刺激的對(duì)照組相比，*P < 0. 05，**P < 0.01(加鈣的高鉀刺激組(即柱3和柱4))；圖2J.免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)在KC1、辣椒素(Capsaicin，Cap)和/或capsaizepine (CPZ)存在下，用年輕大鼠DRG培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞分泌的FSTLl水平。以細(xì)胞裂解液中FSTLl的總表達(dá)情況作為上樣量對(duì)照，其中柱形圖是對(duì)各泳道分泌情況的定量分析。與未加刺激的對(duì)照組相比，#P < 0.01(僅加KCl或Cap刺激與未加任何刺激的對(duì)照組相比)，##P < 0. 01 (僅加Cap刺激與加Cap和CPZ刺激相比)。圖3. FSTLl對(duì)于感覺傳遞的抑制作用圖3A. FSTLl及其突變體Ml (EF手型結(jié)構(gòu)域缺失)和M2 (第165位由E變?yōu)锳)的表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建示意圖，F(xiàn)STLl及其突變體的C端與Myc和His標(biāo)簽融合；圖3B.在成年大鼠脊髄薄片上進(jìn)行全細(xì)胞記錄，記錄了 31個(gè)脊髓II層神經(jīng)元在嵌制電壓_70mV(VH)下的sEPSC。在16個(gè)神經(jīng)元中，重組FSTLl同時(shí)降低了自發(fā)性興奮性突觸后電流(sEPSC)的頻率和幅度。兔抗全長(zhǎng)FSTLl抗體(I 1000)可增強(qiáng)sEPSC的電流頻率和幅度，免疫前血清(I 1000)用作對(duì)照。所有定量分析采用3min內(nèi)灌流FSTLl收集的數(shù)據(jù)。與未加FSTLl的對(duì)照組或免疫前血清組相比，*P < 0. 05，**P < 0. 01 ；圖3C. 0. 2Hz (強(qiáng)度210-650 U A)刺激背根誘導(dǎo)了 C纖維的谷氨酸能單突觸eEPSC，平均幅度166±23pA(37-459pA ；VH = -70mV)。在24個(gè)被記錄的脊髓II層神經(jīng)元中，C纖維激發(fā)的單突觸誘發(fā)性興奮性突觸后電流(eEPSC)被FSTLl (60nM，n = 14 ；300nM,n = 5)抑制，但不被Ml (n = 4)和M2 (n = 5)抑制。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)化為對(duì)照eEPSCs的峰電流水平后，被抑制的eEPSCs的衰減時(shí)間常數(shù)無顯著變化。FSTLl抗體(I 1000)也增強(qiáng)C纖維的eEPSC(n = 5)。與未加FSTLl的對(duì)照組或免疫前血清組相比，*P < 0. 05, **P < 0. 01 ；、
圖3D. FSTLl (60nM)僅降低微小性興奮性突觸后電流(mEPSC)的頻率。與未加FSTLl的對(duì)照組相比，**P < 0. 01 ；圖3E.免疫印跡檢測(cè)FSTLl、Ml和M2重組蛋白的表達(dá)情況；圖3F.純化的人重組濾泡素抑制素對(duì)成年大鼠脊髄薄片上記錄的sEPSC沒有影響。加了 FSTLl的實(shí)驗(yàn)組，與未加FSTLl的對(duì)照組相比廣P < 0. 01 ;與加FSTLl的組相比，flP < 0. 05。圖4.在DRG神經(jīng)元中條件性敲除Fstll基因圖4A. Fstll條件性基因敲除小鼠的構(gòu)建示意圖。用兩個(gè)IoxP序列(灰色三角，F(xiàn)stllp)來將編碼FSTLl信號(hào)肽的外顯子2刪除。在內(nèi)含子區(qū)域的neo也被IoxP刪除。PCR檢測(cè)顯示含單拷貝Fstll的雜合子(Fstl 1F/+)包括399bp和505bp兩個(gè)條帶；純合子 (Fstl 1F/F)僅有ー個(gè)505bp條帶；而野生型(Fstll+/+)有399bp —個(gè)條帶。通過與SNS-Cre小鼠雜交，neo和外顯子2被去除；圖4B.免疫印跡檢測(cè)Fstll+/+、Fstll+/_、Fstll+小鼠DRG中FSTLl的表達(dá)情況。顯示FSTLl在Fstll+DRG中基本不存在；圖4C.在Fstllv-小鼠的DRG中，F(xiàn)STLl免疫反應(yīng)陽性的神經(jīng)元降低到約10%，而ー些主要分子的表達(dá)沒有改變。圖5. FSTLl的缺失誘導(dǎo)軀體感覺超敏圖5A.全細(xì)胞記錄脊髓II層神經(jīng)元的sEPSC，顯示由15mM KCl (Imin)誘導(dǎo)的sEPSC頻率增加在Fstll+小鼠中比在Fstl 1+/+小鼠中更顯著。以不加KCl刺激作為對(duì)照，**P< 0.01 (Fstll+小鼠)；圖5B.在體記錄小鼠脊髓背角的廣動(dòng)カ神經(jīng)元反應(yīng)(WDR), Fstll+小鼠(n = 6)的脊髄背角的WDR神經(jīng)元對(duì)于熱刺激(左)和機(jī)械刺激(右)更敏感(與Fstll+/+小鼠相比，*P < 0. 05)。鞘內(nèi)給予(i. t.) FSTLl可逆轉(zhuǎn)Fstll+小鼠這種增強(qiáng)的WDR神經(jīng)元反應(yīng)(n = 3，*P く 0. 05)；圖5C. Fstl 1+/\ Fstl 1F/F, Fstll+小鼠的溫度刺激縮足反應(yīng)延后時(shí)間(左)和機(jī)械刺激縮足閾值(右)的比較。Fstll+對(duì)于熱(左)和機(jī)械刺激(右)更敏感(n = 12 ;與 Fstll+/+ 小鼠和 FstllF/F 小鼠相比，**P < 0. 01)；圖5D. Fstl 1+/\ Fstl 1F/F, Fstll+小鼠在加速旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)中跌落延后時(shí)間的比較結(jié)果(n = 6);圖5E. Fstl 1+/\ Fstl 1F/F, Fstll+小鼠后腳掌注射福爾馬林誘導(dǎo)炎性痛模型中小鼠舔足時(shí)間的比較。Fstll+小鼠顯示更明顯的疼痛反應(yīng)(n = 6，與Fstll+/+小鼠和FstllF/F小鼠比較，*P < 0. 05)；圖5F. Fstll+小鼠鞘內(nèi)注射(i. t.)不同濃度FSTLl后對(duì)熱刺激的縮足延后時(shí)間的影響，對(duì)照組注射載體(0. OlM PBS)。FSTLl降低Fstll+小鼠對(duì)熱刺激的反應(yīng)。與注射載體的 Fstir,-小鼠相比，*P < 0. 05，< 0. 01 ;圖5G.成年大鼠鞘內(nèi)注射抗FSTLl全長(zhǎng)蛋白的抗體(I 100，20 yl)或免疫前血清，觀察大鼠對(duì)熱刺激的縮足延后時(shí)間的變化。給予抗體后大鼠對(duì)熱刺激更敏感(n = 6，與注射免疫前血清的小鼠相比，*P < 0. 05，**P < 0. 01)。圖6. FSTLl表達(dá)的下降對(duì)神經(jīng)源性痛有貢獻(xiàn)
圖6A.原位雜交顯示Fstll mRNA水平，坐骨神經(jīng)切斷14天后大鼠腰4-5節(jié)段DRG中含有Fstll mRNA的小神經(jīng)元數(shù)目顯著減少，以大鼠未切斷的對(duì)照側(cè)為對(duì)照，**P <0.01；圖6B.免疫印跡顯示大鼠坐骨神經(jīng)切斷后背根節(jié)不同時(shí)間FSTLl的變化。以GAPDH作為上樣量對(duì)照；圖6C.免疫標(biāo)記顯示在坐骨神經(jīng)切斷14天后FSTLl陽性DRG數(shù)量減少。免疫熒光雙標(biāo)法顯示，在損傷的DRG神經(jīng)元[以活化轉(zhuǎn)錄因子3(ATF3)標(biāo)記]中FSTLl缺失。坐骨神經(jīng)切斷14天后，在腰5節(jié)段中傳入纖維(以三角箭頭標(biāo)示)中FSTLl顯著下降；圖6D.由坐骨神經(jīng)分支切斷引起的神經(jīng)源性痛模型中，切斷14天后腰OTRG中FSTLl陽性神經(jīng)元的數(shù)目顯著下降。以大鼠未切斷的對(duì)照側(cè)為對(duì)照，**P <0.01 ；圖6E.在坐骨神經(jīng)分支切斷引起的神經(jīng)源性痛模型中，鞘內(nèi)注射FSTLl蛋白對(duì)于大鼠機(jī)械刺激縮足閾值的影響； 圖7. FSTLl蛋白與a I鈉-鉀ATP酶(NKA)亞基的結(jié)合圖7A.用重組的FSTL l_myC孵育培養(yǎng)的大鼠背根節(jié)神經(jīng)元，同時(shí)加入了不透膜的交聯(lián)劑(BS3)，用myc抗體檢測(cè)到FSTLl在近150kD處可見一條帶，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次；圖7B.與圖7A同樣處理的樣品用a INKA亞基的單克隆抗體檢測(cè)，可見部分a INKA亞基分子量從IlOkD增加到150kD，a 3NKA亞基未見此現(xiàn)象，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次；圖7C.免疫組化染色顯示a INKA亞基主要定位于背根節(jié)神經(jīng)元的小細(xì)胞中，與FSTLl有共定位；圖7D.大鼠背根節(jié)的免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)顯示，用FSTLl抗體免疫共沉淀下來的蛋白質(zhì)中可以檢測(cè)到a INKA亞基，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次；圖7E.在C0S7細(xì)胞中共轉(zhuǎn)帶flag標(biāo)簽的a INKA亞基和FSTLl_myc (在f lag抗體免疫共沉淀下來的蛋白質(zhì)中可以檢測(cè)到FSTLl-myc (實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次))；圖7F.斯卡查德分析顯示125I-FSTLl劑量依賴性地結(jié)合共表達(dá)a INKA亞基和3 I亞基的C0S7細(xì)胞(Kd = 43nM)；圖7G.在表達(dá)FSTLl-myc和a INKA亞基的C0S7細(xì)胞中，免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)顯示在flag抗體免疫共沉淀下來的蛋白質(zhì)中存在FSTLl-myc，在共表達(dá)FSTLl-myc和a INKA亞基E314G-flag或a INKA亞基T889N-flag或a INKA亞基lag的細(xì)胞中，flag抗體免疫共沉淀下來的蛋白質(zhì)中存在的FSTLl-myc顯著下降，F(xiàn)STLl-myc不與a 3NKA亞基結(jié)合，但與a 3NKA亞基G_’N879T-fiag結(jié)合，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。圖8. FSTLl 激活 a INKA 亞基圖8A.在C0S7細(xì)胞中共轉(zhuǎn)a INKA-flag和帶myc標(biāo)簽的P I亞基，可以檢測(cè)到FSTLl劑量依賴性地上調(diào)NKA的活性，共轉(zhuǎn)a 3NKA-flag時(shí)則不能。在培養(yǎng)的背根節(jié)神經(jīng)元中也可以檢測(cè)到FSTLl呈劑量依賴性地上調(diào)NKA的活性；圖8B. FSTLl 在共轉(zhuǎn) a INKA 亞基 E314G-flag 或 a INKA 亞基 T889N-flag 或 a INKA 亞基ran i889N_flag和0 I亞基的⑶S7細(xì)胞中不能增加NKA的活性，F(xiàn)STLIe165a不能提高共表達(dá)a INKA亞基和P I亞基的C0S7細(xì)胞中NKA的活性。與共表達(dá)a INKA亞基和P I亞基的 C0S7 細(xì)胞相比，*P < 0. 05，**P < 0. 01 ；圖8C. C0S7全細(xì)胞記錄觀察到FSTLl (30nM)對(duì)共轉(zhuǎn)a INKA-flag和P I-myc亞基的細(xì)胞(n = 15)顯著降低細(xì)胞膜電位，對(duì)不轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(n = 12)或共轉(zhuǎn)a 3NKA_f lag和3 I-myc亞基的細(xì)胞(n = 8)膜電位沒有影響。與不轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，**P < 0. Ol ；圖8D.在共表達(dá)a INKA亞基和P I亞基的C0S7細(xì)胞中，預(yù)孵育M3M4 (EC5tl =3. 6 u M)或M7M8 (EC5tl = 2. 9 ii M)肽段可以使1251-FSTL1的結(jié)合率顯著下降，M1M2肽段不能降低；圖8E.在共表達(dá)a INKA亞基和P I亞基的C0S7細(xì)胞中，預(yù)孵育M3M4或M7M8肽段可以減弱FSTLl引起的NKA活性增強(qiáng)作用。與不加FSTLl的對(duì)照相比，**P < 0. 01 ；圖8F.全細(xì)胞記錄急性分離的成年大鼠背根節(jié)小神經(jīng)元，F(xiàn)STLl (30nM)降低動(dòng)作電位的頻率，并且誘導(dǎo)膜超極化(記錄16個(gè)細(xì)胞有7個(gè)有作用)，這種影響當(dāng)同時(shí)給予NKA的特異性抑制劑哇巴因(OB IOOiiM)時(shí)被翻轉(zhuǎn)，F(xiàn)STLl引起的膜超極化的效應(yīng)可被哇巴因翻轉(zhuǎn)，也可以被預(yù)孵育a INKA的第2個(gè)胞外環(huán)M3M4肽段所拮抗。圖8G.在脊髓背角中a INKA的表達(dá)情況，免疫組化顯示a INKA與FSTLl共存于初級(jí)傳入末梢中； 圖8H.脊髓腦片II層神經(jīng)元全細(xì)胞記錄顯示FSTLl (60nM)降低sEPSC的頻率，這種影響當(dāng)同時(shí)給予NKA的特異性抑制劑哇巴因(OB IOOiiM)時(shí)被翻轉(zhuǎn)。與不加FSTLl的對(duì)照相比，** P < 0. 01(n = 5)；圖81.脊髓腦片II層神經(jīng)元全細(xì)胞記錄顯示M3M4(20iiM，3min)肽段孵育增加sEPSC的頻率。與不加肽段的對(duì)照相比，*P < 0. 05 (n = 6)；圖8J.脊髓腦片II層神經(jīng)元全細(xì)胞記錄顯示M3M4(20iiM，3min)肽段孵育增加C纖維刺激引起的eEPSC幅度。與不加肽段的對(duì)照相比，*P < 0. 05 (n = 5)。圖9. FSTLl蛋白的各功能區(qū)域?qū)τ诩?xì)胞內(nèi)鈣和a INKA酶活性的影響分別得到去除FS、VffC, EF手型結(jié)構(gòu)域和第165位氨基酸突變成丙氨酸的真核表達(dá)的重組蛋白，在急性分離的初級(jí)感覺神經(jīng)元上用鈣成像的方法檢測(cè)蛋白質(zhì)對(duì)辣椒素(Capsaicin, Cap)引起的DRG神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)I丐升高的影響,全長(zhǎng)FSTLl顯著降低Cap引起的細(xì)胞內(nèi)鈣升高，缺失FS和VWC結(jié)構(gòu)域?qū)STLl的作用沒有影響，但缺失EF手型結(jié)構(gòu)域和第165位突變均顯著影響FSTLl的功能。在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染a INKA和P INKA亞基的C0S7細(xì)胞上檢測(cè)a INKA酶活性，F(xiàn)STLl全長(zhǎng)可以顯著激活a INKA酶的活性，EFl手型結(jié)構(gòu)域中第156-173位氨基酸序列合成多肽(SP76)也能顯著激活a INKA酶的活性。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次論證了濾泡素抑制素樣蛋白I (Follistatin-Like
I,FSTL1)或其生物活性片段可提高鈉鉀ATP酶的活性，從而可用于治療、緩解或改善與該活性相關(guān)的疾病或癥狀。例如，在感覺信息傳遞過程，下調(diào)FSTLl使得鈉鉀ATP酶活性下降會(huì)導(dǎo)致痛覺敏感性増加，這種調(diào)節(jié)作用是ー種全新的感覺信息傳遞調(diào)節(jié)機(jī)制。因此，F(xiàn)STLl其本身或其上調(diào)劑能夠通過提高鈉鉀ATP酶活性而用于抑制哺乳動(dòng)物軀體感覺(如減少哺乳動(dòng)物的痛覺)。如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。
如本文所用，“與鈉鉀ATP酶活性相關(guān)的疾病或癥狀”是指通過調(diào)節(jié)(包括上調(diào)或下調(diào))鈉鉀ATP酶活性可獲得治療、緩解或改善的疾病或癥狀。與鈉鉀ATP酶活性降低或過低相關(guān)的疾病或癥狀包括但不限于家族性偏_型偏頭痛(Familial hemiplegicmigraine)、糖尿病(diabetes)、抑郁癥(depression)、洋地黃中毒(digoxin toxicity) >肺損傷(lung injury)、肺水腫(lung edema)或哺乳動(dòng)物軀體感覺(如痛覺或溫度覺過明顯)，這些疾病或癥狀可通過提高鈉鉀ATP酶活性(在本發(fā)明中可通過例如増加FSTLl數(shù)量或提高FSTLl活性實(shí)現(xiàn))而得到治療、緩解或改善。與鈉鉀ATP酶活性提高或過高相關(guān)的疾病或癥狀包括但不限于腎性高血壓、腫瘤(優(yōu)選黑色素瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和非小細(xì)胞肺癌)，這些疾病或癥狀可通過降低鈉鉀ATP酶活性(在本發(fā)明中可通過例如減少FSTLl數(shù)量、降低FSTLl活性、抑制FSTL激活鈉鉀ATP酶或阻斷FSTL與鈉鉀ATP酶結(jié)合而實(shí)現(xiàn))而得到治療、緩解或改善。如本文所用，所述的“軀體感覺”是指哺乳動(dòng)物對(duì)于外在刺激(如機(jī)械損傷)或內(nèi)在刺激產(chǎn)生的感覺反應(yīng)，其通常由神經(jīng)系統(tǒng)(包括背根神經(jīng)節(jié))傳遞。所述的感覺包括(但不限于)疼痛覺、溫度覺。所述的疼痛包括神經(jīng)源性痛，如背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)源性痛或三叉神經(jīng)節(jié)神經(jīng)源性痛。所述的溫度覺是指對(duì)軀體接觸到高溫或低溫后的感覺反應(yīng)。就疼痛而言,其可分為身源性(somatogenic)疼痛和心因性(psychogenic)疼痛。身源性疼痛又可分傷害感受性疼痛(nociceptive pain)與神經(jīng)病理性疼痛(NeuropathicPai)。神經(jīng)病理性疼痛是由于中樞或周圍神經(jīng)系統(tǒng)的損傷或病理改變引起，包括但不限于腰背痛(lower back pain)、神經(jīng)痛(neuralgia)、纖維性肌痛(Fibromyalgia)、糖尿病相關(guān)的神經(jīng)痛(diabetic neuropathic pain, DNP)、多發(fā)性硬化相關(guān)的神經(jīng)痛(painassociated with multiple sclerosis)、帶狀皰疫后神經(jīng)痛(PHN)和HIV有關(guān)聯(lián)的(神經(jīng)病理性)神經(jīng)痛(HIVNP)等。傷害感受器性疼痛是由于人體內(nèi)的傷害感受器受到機(jī)械、熱、化學(xué)刺激或損傷引起，可分為軀體傷害感受器性疼痛和內(nèi)臟傷害感受器性疼痛，包括但不限于癌痛(cancer-relatedpain)、關(guān)節(jié)炎痛(arthritic pain)、術(shù)后痛(post-operativepain)和HIV有關(guān)聯(lián)的(傷害感受器性)神經(jīng)痛(HIVNP)等。其中，神經(jīng)痛(neuralgia)包括但不限于三叉神經(jīng)痛(Trigeminal neuralgia)、坐骨神經(jīng)痛(sciatic neuralgia)等。如本文所用，“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由......構(gòu)成”、“基
本上由......構(gòu)成”、和“由......構(gòu)成”;“主要由......構(gòu)成”、“基本上由......構(gòu)成”
和“由......構(gòu)成”屬于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。FSTLl蛋白或其生物活性片段在尋找特異性表達(dá)在DRG神經(jīng)元上的新功能分子的過程中，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)FSTLl在DRG小神經(jīng)元上選擇性高表達(dá)。 FSTLl是ー種糖蛋白，最早被發(fā)現(xiàn)是ー種轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF) P I誘導(dǎo)蛋白。FSTLl屬于濾泡素抑制素基因家族，擁有濾泡素抑制素樣結(jié)構(gòu)域和ー對(duì)EF-手型結(jié)構(gòu)，但是不能與激活素(Activin)結(jié)合。FSTLl可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，而且是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎自身免疫抗體的靶蛋白。盡管已知包括DRG在內(nèi)的神經(jīng)系統(tǒng)中存在Fstll mRNA，但是以往FSTLl在神經(jīng)系統(tǒng)中的生理功能仍不為人知。本發(fā)明人在深入研究中意外發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)STLl可與鈉-鉀ATP酶(Na+，K+-ATPase)結(jié)合，且其中結(jié)合的關(guān)鍵點(diǎn)在于鈉-鉀ATP酶a INKA亞基第二個(gè)胞外環(huán)M3M4和第四個(gè)胞外環(huán)M7M8中。并且，F(xiàn)STLl與鈉-鉀ATP酶結(jié)合之后，可激活鈉-鉀ATP酶的活性，從而可用于治療、緩解或改善與鈉鉀ATP酶活性降低或過低相關(guān)的疾病或癥狀。反之，研究還證明了來源于鈉鉀ATP酶的肽段或它們的同源序列，包括但不限于SEQ ID NOs 5和6所示的M3M4肽段、SEQ ID NOs 7和8所示的M7M8肽段)，通過抑制FSTLl與鈉-鉀ATP酶結(jié)合，可降低鈉鉀ATP酶的活性，從而可治療、緩解或改善與鈉鉀ATP酶活性提聞或過聞相關(guān)的疾病或癥狀。本發(fā)明中利用上調(diào)或下調(diào)FSTLl來治療、緩解或改善與鈉鉀ATP酶活性相關(guān)的疾病或癥狀的方法，在同時(shí)存在FSTLl和鈉鉀ATP酶的組織或細(xì)胞(例如背根神經(jīng)節(jié)、心臟、肺、腎臟等)中尤為有效。鈉鉀ATP酶a INKA亞基的序列在本領(lǐng)域中是已知的，或可通過本領(lǐng)域常規(guī)方法確定。例如，大鼠和人的鈉鉀ATP酶a INKA亞基的氨基酸序列分別如SEQ I D NO 3(1023Aa)和SEQ ID NO 4(1023Aa)所示，它們的序列相同性達(dá)到96%。大鼠和人鈉鉀ATP酶a INKA亞基中的關(guān)鍵胞外環(huán)如下表I所示表I.鈉鉀ATP酶a INKA亞基和關(guān)鍵胞外環(huán)
權(quán)利要求
1.濾泡素抑制素樣蛋白I在制備組合物中的用途，所述組合物用于通過提高鈉鉀ATP酶活性來治療、緩解或改善與鈉鉀ATP酶活性相關(guān)的疾病或癥狀。
2.如權(quán)利要求I所述的用途，其特征在于，所述疾病或癥狀選自疼痛、家族性偏癱型偏頭痛、糖尿病、抑郁癥、洋地黃中毒、肺損傷或肺水腫。
3.如權(quán)利要求I所述的用途，其特征在于，所述組合物用于治療、緩解或改善疼痛。
4.如權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于，所述疼痛是身源性疼痛。
5.如權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于，所述身源性疼痛選自神經(jīng)病理性疼痛或傷害感受性疼痛。
6.如權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于，所述神經(jīng)病理性痛選自背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)源性痛、三叉神經(jīng)節(jié)神經(jīng)源性痛或坐骨神經(jīng)痛。
7.如權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于，所述神經(jīng)病理性疼痛為選自下組的由中樞或周圍神經(jīng)系統(tǒng)的損傷或病理改變引起的疼痛腰背痛、神經(jīng)痛、纖維性肌痛、糖尿病相關(guān)的神經(jīng)痛、多發(fā)性硬化相關(guān)的神經(jīng)痛、帯狀皰疹后神經(jīng)痛以及與HIV有關(guān)聯(lián)的神經(jīng)病理性神經(jīng)痛。
8.如權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于，所述傷害感受性疼痛選自軀體傷害感受性疼痛或內(nèi)臟傷害感受性疼痛。
9.如權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于，所述傷害感受性疼痛選自癌痛、關(guān)節(jié)炎痛、術(shù)后痛或與HIV有關(guān)聯(lián)的傷害感受性疼痛。
10.如權(quán)利要求I所述的用途，其特征在于，所述濾泡素抑制素樣蛋白I是 (a)SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)； (b)(a)中所限定的蛋白質(zhì)的保守性變異蛋白質(zhì)或其活性片段；或 (C)將(a)中氨基酸序列經(jīng)過1-20個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有提高鈉鉀ATP酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。
11.如權(quán)利要求10所述的用途，其特征在于，所述(C)是將(a)中氨基酸序列經(jīng)過1-10個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有提高鈉鉀ATP酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。
12.如權(quán)利要求10所述的用途，其特征在于，所述(C)是將(a)中氨基酸序列經(jīng)過1-5個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有提高鈉鉀ATP酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。
13.如權(quán)利要求10所述的用途，其特征在于，所述(b)選自 (1)具有SEQID NO :I中第156-173氨基酸序列的多肽； (2)具有SEQID NO 2中第158-175位氨基酸序列的多肽； (3)由SEQID NO :1或SEQ ID NO :2的氨基酸序列缺失濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域，即FS結(jié)構(gòu)域，所形成的多肽； (4)由SEQID NO :1或SEQ ID NO :2的氨基酸序列缺失Von Willebrand型C結(jié)構(gòu)域，即VWC結(jié)構(gòu)域，所形成的多肽； (5)由SEQID NO 1或SEQ ID NO 2的氨基酸序列缺失EF手型II結(jié)構(gòu)域所形成的多肽；或 (6)由SEQID NO :1或SEQ ID NO :2的氨基酸序列缺失EF手型連接結(jié)構(gòu)域所形成的多肽。
14.一種分離的多肽，所述多肽選自 (1)具有SEQID NO 1中第156-173位氨基酸序列NGDSHLDSSEFLKFVEQN的多肽，條件是該多肽不是SEQ ID NO :1所示的蛋白質(zhì)； (2)具有SEQID NO 2中第158-175位氨基酸序列的NGDSRLDSSEFLKFVEQN的多肽，條件是所述多肽不是SEQ ID NO 2所示的蛋白質(zhì)； (3)由SEQID NO :1或SEQ ID NO 2的氨基酸序列缺失濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域，即FS結(jié)構(gòu)域，所形成的多肽； (4)由SEQID NO :1或SEQ ID NO :2的氨基酸序列缺失Von Willebrand型C結(jié)構(gòu)域，即VWC結(jié)構(gòu)域，所形成的多肽； (5)由SEQID NO 1或SEQ ID NO 2的氨基酸序列缺失EF手型II結(jié)構(gòu)域所形成的多肽；或 (6)由SEQID NO 1或SEQ ID NO 2的氨基酸序列缺失EF手型連接結(jié)構(gòu)域所形成的多肽。
15.—種分離的多核苷酸,其特征在于,所述的多核苷酸編碼權(quán)利要求14所述的多肽。
16.—種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求15所述的多核苷酸。
17.—種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求16所述的載體；或其基因組中整合有權(quán)利要求15所述的多核苷酸。
18.—種權(quán)利要求14所述的多肽的制備方法,其特征在于,該方法包含 (a)在適合表達(dá)的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求17所述的宿主細(xì)胞； (b)從培養(yǎng)物中分離出權(quán)利要求14所述的多肽。
19.ー種通過提高鈉鉀ATP酶活性來治療、緩解或改善與鈉鉀ATP酶活性相關(guān)的疾病或癥狀的藥物組合物，它含有 (a)安全有效量的權(quán)利要求14所述的多肽、SEQID NO :1或SEQ ID NO 2的蛋白質(zhì)；以及 (b)藥學(xué)上可接受的載體。
20.如權(quán)利要求19所述的藥物組合物，其特征在于，所述疾病或癥狀選自家族性偏癱型偏頭痛、糖尿病、抑郁癥、洋地黃中毒、肺損傷、肺水腫或疼痛。
21.如權(quán)利要求20所述的藥物組合物，其特征在于，所述的疼痛是身源性疼痛。
22.如權(quán)利要求21所述的藥物組合物，其特征在于，所述身源性疼痛選自傷害感受性疼痛或神經(jīng)病理性疼痛。
23.如權(quán)利要求22所述的藥物組合物，其特征在于，所述的神經(jīng)病理性痛選自背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)源性痛、三叉神經(jīng)節(jié)神經(jīng)源性痛或坐骨神經(jīng)痛。
24.如權(quán)利要求22所述的藥物組合物，其特征在干，所述神經(jīng)病理性疼痛為選自下組的由中樞或周圍神經(jīng)系統(tǒng)的損傷或病理改變引起的疼痛腰背痛、神經(jīng)痛、纖維性肌痛、糖尿病相關(guān)的神經(jīng)痛、多發(fā)性硬化相關(guān)的神經(jīng)痛、帯狀皰疹后神經(jīng)痛或與HIV有關(guān)聯(lián)的神經(jīng)病理性神經(jīng)痛。
25.如權(quán)利要求22所述的藥物組合物，其特征在于，所述傷害感受性疼痛選自軀體傷害感受器性疼痛或內(nèi)臟傷害感受器性疼痛。
26.如權(quán)利要求25所述的藥物組合物，其特征在于，所述傷害感受性疼痛選自癌痛、關(guān)節(jié)炎痛、術(shù)后痛或與HIV有關(guān)聯(lián)的傷害感受性疼痛。
27.權(quán)利要求14所述的多肽、SEQID NO :1所示的蛋白質(zhì)和/或SEQ ID NO :2所示的蛋白質(zhì)在制備用于通過提高鈉鉀ATP酶活性來治療、緩解或改善與鈉鉀ATP酶活性相關(guān)的疾病或癥狀的藥物組合物中的用途。
28.權(quán)利要求14所述的多肽在制備用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和/或缺血性心臟病的藥物組合物中的用途。
29.—種篩選用于通過提高鈉鉀ATP酶活性來治療、緩解或改善與該活性相關(guān)的疾病或癥狀的潛在物質(zhì)的方法，其特征在于，所述的方法包括 (1)將候選物質(zhì)與表達(dá)濾泡素抑制素樣蛋白I的體系接觸； (2)檢測(cè)候選物質(zhì)對(duì)濾泡素抑制素樣蛋白I的影響； 若所述候選物質(zhì)可提高濾泡素抑制素樣蛋白I的表達(dá)、活性和/或分泌，則表明該候選物質(zhì)是可用于通過提高鈉鉀ATP酶活性來治療、緩解或改善與該活性相關(guān)的疾病或癥狀的潛在物質(zhì)。
30.一種篩選治療或緩解疼痛的潛在物質(zhì)的方法，其特征在于，所述的方法包括 (1)將候選物質(zhì)與鈉鉀ATP酶的體系接觸； (2)檢測(cè)候選物質(zhì)對(duì)鈉鉀ATP酶的影響； 若所述候選物質(zhì)可提高鈉鉀ATP酶的活性，則表明該候選物質(zhì)是可用于治療或緩解疼痛的潛在物質(zhì)。
31.濾泡素抑制素樣蛋白I的抑制劑在制備通過降低鈉鉀ATP酶活性來治療、緩解或改善與鈉鉀ATP酶活性相關(guān)的疾病或癥狀的組合物中的用途。
32.如權(quán)利要求31所述的用途，其特征在于，所述疾病或癥狀選自腎性高血壓或腫瘤。
33.如權(quán)利要求32所述的用途，其特征在于，所述腫瘤選自黑色素瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤或非小細(xì)胞肺癌。
34.如權(quán)利要求31所述的用途，其特征在于，所述抑制劑選自抗濾泡素抑制素樣蛋白I或其活性片段的抗體；針對(duì)濾泡素抑制素樣蛋白I編碼序列的反義寡核苷酸或小干擾RNA ;或來源于鈉鉀ATP酶的肽段。
35.如權(quán)利要求31所述的用途，其特征在于，所述抑制劑選自 ⑴具有 SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 7 或 SEQ ID NO 8 所示的氨基酸序列的多肽； (ii)(i)中所限定的多肽的保守性變異多肽或其活性片段；或 (iii)(i)或(ii)中任意多肽或活性片段的組合。
全文摘要
本發(fā)明涉及濾泡素抑制素樣蛋白1(FSTL1)在調(diào)節(jié)鈉鉀ATP酶活性中的用途，具體涉及FSTL1在提高鈉鉀ATP酶活性從而治療、緩解或改善與該活性相關(guān)的疾病或癥狀的用途，或FSTL1抑制劑在降低鈉鉀ATP酶活性從而治療、緩解或改善與該活性相關(guān)的疾病或癥狀的用途，還提供了調(diào)節(jié)鈉鉀ATP酶活性的藥物或其篩選的新方法。本發(fā)明的多肽、核苷酸、組合物及方法在治療、緩解或改善與鈉鉀ATP酶活性相關(guān)的疾病或癥中具有巨大的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12P21/02GK102648977SQ201110046989
公開日2012年8月29日 申請(qǐng)日期2011年2月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月25日
發(fā)明者張方雄, 張旭, 李開誠(chéng), 陸瑩瑾, 鮑嵐 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院