專利名稱：檢測(cè)鴨瘟病毒抗體的ul55重組原核表達(dá)蛋白及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動(dòng)物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種基因工程制品和其制備方法。具體地說(shuō)是一種應(yīng)用基因工程技術(shù)制備檢測(cè)鴨瘟抗體的DPV-UL55基因重組原核表達(dá)檢測(cè)抗原蛋白及其制備方法。
背景技術(shù)：
鴨瘟(duck plague, DP)是由皰疹病毒科中的DPV引起的常見(jiàn)于鴨、鵝、天鵝等水禽的一種高度致死性傳染病。鴨瘟自上世紀(jì)20年代首先在荷蘭被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，已有80多年的歷史了。該病在世界各養(yǎng)鴨地區(qū)都有分布，給世界各國(guó)的水禽養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。其預(yù)防和控制已直接關(guān)系到水禽養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展。臨床和實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)證實(shí)DPV弱毒疫苗是預(yù)防控制DP的有效生物制劑，而對(duì)DPV特異性抗體的監(jiān)測(cè)是評(píng)價(jià)DPV弱毒疫苗免疫效果及制定合理的免疫程序的關(guān)鍵。目前，用于檢測(cè)DPV抗體的方法大多是基于DPV全病毒作為抗原的檢測(cè)方法。但其存在以下不足一是在操作過(guò)程中不可避免造成散毒；二是由于DPV全病毒作為診斷抗原其制備的復(fù)雜性以及純度不夠理想使其不易推廣。阻礙了以全病毒作為診斷抗原監(jiān)測(cè)DPV抗體的大規(guī)模應(yīng)用。利用原核表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的一些基因工程蛋白可以保持必要的抗原性，而且其制備和純化過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單，能夠用于病毒感染抗體的檢測(cè)。因此研究和應(yīng)用DPV UL55基因原核表達(dá)產(chǎn)物對(duì)于DPV預(yù)防和控制具有重要的理論和臨床意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種DPV UL55基因原核表達(dá)蛋白及其制備方法。其目的在于提供一種無(wú)散毒危險(xiǎn)、穩(wěn)定性好、靈敏度高、可實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)、成本低，制備方法簡(jiǎn)單易于推廣的檢測(cè)鴨瘟病毒抗體的原核表達(dá)檢測(cè)抗原及其制備方法。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種檢測(cè)鴨瘟病毒抗體的重組原核表達(dá)蛋白，該檢測(cè)鴨瘟病毒抗體的重組原核表達(dá)蛋白由SEQ ID NO :2的氨基酸序列表定義；是SEQ ID NO :1核苷酸序列的原核表達(dá)產(chǎn)物?！N檢測(cè)鴨瘟病毒抗體的原核表達(dá)蛋白的制備方法，包括以下步驟(1)設(shè)計(jì)擴(kuò)增DPV-UL55基因的特異性引物；(2)通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得UL55基因片段；(3)對(duì)UL55基因進(jìn)行克隆、測(cè)序鑒定；(4)將UL55基因定向亞克隆至pET3h原核表達(dá)載體；(5)UL55基因在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)；將重組表達(dá)質(zhì)粒pET3h-UL55轉(zhuǎn)化宿主菌大腸桿菌BL21 (DE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；(6)UL55基因表達(dá)蛋白的純化；(7)重組UL55蛋白的復(fù)性和檢測(cè)。所述的制備方法，步驟(6)具體做法為
①待純化樣的制備離心收集表達(dá)菌液收集誘導(dǎo)表達(dá)的菌液離心取沉淀，將菌體沉淀用 20mmolTris-HCl (pH8. 0)懸浮，直接進(jìn)行包涵體洗滌法純化重組ULL55蛋白的或_20°C保存②重組ULL55蛋白的包涵體洗滌法純化取出離心收集并用20mmolTriS-HCl (pH8. 0)懸浮的表達(dá)菌(-20 V保存的菌體沉淀，室溫下融化)，超聲波(冰浴)間歇破碎菌體O00w，30sec/次，5 10次)， 4 "C 10000r/min 離心 lOmin。將沉淀用 20ml 洗液(10mmol/L PBS+2mol/L 尿素 +1 % Triton X-100+20mMTris-HCl+2mM EDTA)懸浮，4 "C 10000r/min 離心 IOmin 后，沉淀再次用20ml洗液懸浮，重復(fù)洗滌五次后，用適量尿素溶液(lOmmol/L PBS+8M尿素+50mM "Tris-HCl+SOmMNaCl+lO^甘油)溶解沉淀，4°C保存?zhèn)溆?。所述的制備方法，步驟(7)具體做法為將包涵體洗滌純化得到的重組UL55蛋白分多次加入到復(fù)性緩沖液(50mM Tris-HCl pH 8. 0+0. 15M NaCl+lmM EDTA+ImMGSSG+IOmM GSSH)中，使尿素濃度按6M、5M、4M、3M、2M逐步降低，使變性蛋白逐漸復(fù)性，并控制蛋白終濃度在0. 1 lmg/ml的范圍內(nèi)。4°C復(fù)性M 48h，收集稀釋復(fù)性的蛋白液，裝入透析袋 4°C透析(透析緩沖液50mM Tris-HCl pH 8. 0+50mM NaCl+0. 5mMEDTA+10%甘油+1 %甘氨酸)M 48h。透析后樣品經(jīng)8000g離心15min后收集上清，取其中20 μ 1進(jìn)行SDS-PAGE 分析，并以純化的的兔抗DPV為一抗，以HRP標(biāo)記羊抗兔IgG為二抗進(jìn)行Wfestern blotting 檢測(cè)。其余蛋白液用Bradford法測(cè)定蛋白的最終濃度，分裝后冷凍干燥濃縮備用。本發(fā)明制備的DPV UL55重組原核表達(dá)檢測(cè)抗原，是利用基因工程技術(shù)制備的基因工程制品。該產(chǎn)品的表達(dá)形式是一種融合蛋白。表達(dá)的融合蛋白的分子量為40KDa。將該產(chǎn)品的獲得設(shè)計(jì)為融合表達(dá)主要鑒于便于融合表達(dá)蛋白的純化和免疫原性的提高。該融合蛋白在表達(dá)時(shí)，大部分以非可溶性的包涵體形式表達(dá)，在純化之前對(duì)包涵體采用了較為溫和的包涵體裂解方式，因此包涵體蛋白裂解后又經(jīng)復(fù)性處理后，經(jīng)Western blot鑒定后表明其具有與天然蛋白相似的免疫反應(yīng)活性。經(jīng)裂解的包涵體蛋白經(jīng)12個(gè)月仍保持良好的均質(zhì)膠體狀態(tài)，無(wú)析出和沉淀現(xiàn)象，表明狀態(tài)穩(wěn)定。采用本發(fā)明方法生產(chǎn)的產(chǎn)品可用于(1)可作為檢測(cè)鴨瘟病毒抗體的Dot-ELISA和間接ELISA等方法的檢測(cè)抗原。(2)可作為預(yù)防鴨瘟病毒感染的基因工程亞單位疫苗。本產(chǎn)品的優(yōu)點(diǎn)體現(xiàn)在(1)由于所制備的檢測(cè)抗原是DPV UL55基因的原核表達(dá)重組蛋白，并非全病毒， 因此應(yīng)用此產(chǎn)品作為檢測(cè)抗原無(wú)散毒危險(xiǎn)。(2)所制備的產(chǎn)品作為ELISA抗原檢測(cè)DPV抗體具有檢測(cè)靈敏度高，特異性強(qiáng)，無(wú)交叉反應(yīng)的特點(diǎn)。(3)制備工藝簡(jiǎn)單、產(chǎn)品性能穩(wěn)定，成本低，產(chǎn)品附加值高，適合工廠化生產(chǎn)，易于推廣，市場(chǎng)應(yīng)用前景廣闊。


為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，凡是涉及蛋白表達(dá)的均同時(shí)提供原始彩照和黑白照。圖中涉及標(biāo)記及含義如下圖I-A為DPV UL55基因的PCR擴(kuò)增M指Maker III相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1指以正常DEF基因組DNA為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2指以DPV CHv毒株基因組DNA為模板的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物(箭頭所示的是其分子量大小，約為799bp)；圖I-B為重組質(zhì)粒pMD18-UL55的雙酶切鑒定M1指相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)III，M2為 DL2000相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1指重組質(zhì)粒pMD18-UL55用BamH I和Bio I雙酶切得到的兩個(gè)片段2指UL55 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(箭頭所示小片段的分子量大小約為799bp)；圖I-C為重組表達(dá)載體pET3h_UL55的單酶切和雙酶切鑒定M1為DL2000相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；M2指相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL15000 ；1是UL55基因的PCR產(chǎn)物；2指重組表達(dá)載體PET3M-UL55用BamH I和)(h0 I雙酶切得到的兩個(gè)片段(箭頭所示小片段的分子量大小約為799bp) ；3指重組表達(dá)載體pET3h-UL55用BamH I單酶切后得到的線性質(zhì)粒。圖2-A為重組表達(dá)蛋白的SDS-PAGE鑒定M為蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1為以 BL21為表達(dá)宿主的pET3h空載加IPTG誘導(dǎo)；2、3分別為未加誘導(dǎo)劑的UL55表達(dá)產(chǎn)物的上清和包涵體；4、5分別為IPTG誘導(dǎo)所產(chǎn)生的上清和包涵體(箭頭所示的蛋白質(zhì)分子量大小約為40KD)；圖2-B為誘導(dǎo)劑IPTG不同終濃度誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果1_6的IPTG濃度分別為1.0、 0. 8、、0· 6、0· 4、0· 2、和 0. lmmol/L ；圖2-C為不同溫度誘導(dǎo)pET3h_UL55表達(dá)結(jié)果1_3的溫度分別為37、30和25°C;圖2-D為不同時(shí)間誘導(dǎo)pET3^i-UL55表達(dá)結(jié)果1_5的誘導(dǎo)時(shí)間分別為4、5、6、7和 8h。圖3為重組UL55蛋白純化效果和免疫原性的檢測(cè)A，SDS-PAGE分析M為蛋白標(biāo)準(zhǔn)(KD) ；1為包涵體洗滌法純化后透析復(fù)性的重組UL55蛋白；2為5次洗滌后的重組UL55 包涵體蛋白；B，Western blotting分析箭頭所指是以兔抗DPV抗體為一抗檢測(cè)復(fù)性的重組UL55蛋白(約為20KD)。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。實(shí)施例1檢測(cè)鴨瘟病毒抗體的UL55重組原核表達(dá)檢測(cè)抗原及制備方法1、材料方法以下將參照附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。優(yōu)選實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。1. 1菌株、質(zhì)粒和毒株質(zhì)粒pMD18-T，購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；原核表達(dá)質(zhì)粒pET3h(+)，Novagen 公司產(chǎn)品；克隆宿主菌E. coli DH5a、表達(dá)宿主菌E. coli BL21(DE3)和DPV CHv強(qiáng)毒株，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)禽病研究中心提供。1. 2試驗(yàn)鴨胚和血清
10日齡鴨胚，其種鴨DPV和抗體均為陰性；兔抗DPV抗體，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)禽病研究中心提供。1. 3主要試劑瓊脂糖、2X傻瓜PCR Mixture、DNA連接酶Mixture、限制性內(nèi)切酶BamH I和Xhol、 UltraPure 質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒和UltraPureTM DNA回收試劑盒等分子生物學(xué)試劑及試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司、北京賽百盛基因技術(shù)有限公司、華美生物工程公司和Bio-Rad 公司；其它試劑均為分析純，購(gòu)自上海生工生物技術(shù)有限公司。2實(shí)驗(yàn)方法2. 1 DPV UL55 基因的克隆2. 1. 1引物設(shè)計(jì)利用Primer Premier5. 0 軟件，參考 UL55 基因序列(GenBank 登錄號(hào)EU071034)， 由寶生物生物技術(shù)有限公司合成。引物序列F :5，-GGATCCATGGCCGACGCGAAGGCGGT-3’ (劃線部分為 BamH I 位點(diǎn))；R :5，-CTCGAGGCTTGGGTCTTTACTTTTTGCGCGGAAC-3 (劃線部分為 Xho I 位點(diǎn))。合成后，以適量滅菌去離子水溶解，使其終濃度為20mmol/L，_20°C保存?zhèn)溆谩?. 1. 2DPV基因組DNA的提取2. 1. 2. IDEF的制作方法取IOd日齡健康鴨胚，分別用5%碘酒和75%酒精消毒蛋殼表面。無(wú)菌操作條件下將胚體取出并用PBS將胚體洗凈，剪去頭、翅、腿和內(nèi)臟，PBS沖洗后將胚體剪成Imm大小的小塊，加PBS適量，之后置于三角瓶?jī)?nèi)，加細(xì)胞分散劑(體積分?jǐn)?shù)為2.5%的胰蛋白酶)15(^1/胚，于371水浴中消化；31^11。立即將細(xì)胞懸液以4000r/ min離心5min，傾棄上清，細(xì)胞沉淀用適量的MEM懸浮后，用5層紗布過(guò)濾，向?yàn)V液中加入 10%小牛血清和100IU/mL雙抗后，分裝于IOOmL細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，7mL/瓶，水平靜置于37°C 細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。2. 1. 2. 2 DPV增殖取剛剛長(zhǎng)成致密單層的DEF，棄生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)液，用滅菌PBS清洗細(xì)胞表面2次后，加入DPV病毒液2 3mL覆蓋細(xì)胞表面進(jìn)行吸附，37°C吸附120min后棄病毒液，然后加含3%小牛血清和100IU/mL雙抗的MEM維持營(yíng)養(yǎng)液，之后37°C培養(yǎng)。同時(shí)做未接毒的DEF對(duì)照。2. 1. 2. 3 DNA提取方法直接從感染細(xì)胞中提取DPV基因組DNA的具體步驟如下 (1)選取用DPV種毒感染后細(xì)胞病變(CPE)達(dá)60% 70%的DEF(100mL細(xì)胞瓶)；同時(shí)選取細(xì)胞形態(tài)正常的DEF作對(duì)照；(2)傾去細(xì)胞培養(yǎng)液，加入500 μ 1的細(xì)胞裂解液，同時(shí)加蛋白酶K(10mg/mL)至終濃度為200 μ g/mL，輕輕混勻后，37°C孵育IOmin ； (3)將細(xì)胞懸浮液倒入EP離心管中，并用500μ 1的飽和酚洗滌殘存于細(xì)胞瓶?jī)?nèi)的裂解物，倒入離心管中； (4)用飽和酚/氯仿及氯仿抽提2次，再用水飽和乙醚處理2次；(5)加1/10倍體積3mol/ L NaAC,混勻后，加入2倍體積冷無(wú)水乙醇，_20°C放置30 60min ； (6) 13000r/min離心 20min，沉淀用預(yù)冷的70%乙醇洗滌兩次；(7)真空抽干后，溶于適量TE緩沖液中，加入1 μ 1 RNA酶，37°C作用30min，_20°C保存?zhèn)溆谩?. 1. 3PCR 擴(kuò)增 DPV UL55 基因PCR反應(yīng)體系為
2χ傻瓜 PCR Mixtrue12.5μ1DPV基因組DNA2.4μ1Pl(20pmol / μ )0.5μ1Ρ2 (20ρηιο1/μ1)0.5μ1超純水9.1μ1Total volume25μ1 /Sample輕輕混勻，2000r/min瞬時(shí)離心后進(jìn)行PCR。反應(yīng)參數(shù)95°C預(yù)變性IOmin ；94°C變性 40s, 66. 2°C退火 40s，72°C延伸 lmin，循環(huán)30次；最后72°C延伸lOmin，于4°C保存?zhèn)溆?。?μ 1 PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳，設(shè)Maker III和空白對(duì)照，觀察擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度。2. 1. 4UL55基因的pMD18_T克隆、鑒定與測(cè)序在優(yōu)化好的PCR條件下用保真PCR Mixture擴(kuò)增UL55基因，產(chǎn)物按大連寶生物公司的T克隆試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行T克隆并送大連寶生物公司測(cè)序確認(rèn)。將T克隆菌種接種于5ml的LB液體培養(yǎng)基(含Amp 50 μ g/ml)中，37°C水浴振搖培養(yǎng)過(guò)夜，次日提取重組質(zhì)粒，提取方法按北京賽百盛基因技術(shù)有限公司質(zhì)粒抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，抽提的重組質(zhì)粒命名為PMD18-UL55。然后分別以BamH I/Xho I雙酶切消化與 BamH I單酶切消化，1. 0%凝膠電泳觀察結(jié)果。同時(shí)做PCR擴(kuò)增目的基因。酶切體系如下
BamHIBamH I/Xho IpMD18-UL55 質(zhì)粒8·0μ116.0μ1\ BamHIΙ.ΟμΙΙ.ΟμΙXhoI-Ι.ΟμΙIOxH BufferΙ.ΟμΙ2.0μ1超純水補(bǔ)足至10μ120μ1
2. 2原核表達(dá)質(zhì)粒pET3h-UL55的構(gòu)建、誘導(dǎo)表達(dá)與表達(dá)條件優(yōu)化 2. 2. 1原核表達(dá)質(zhì)粒pET3h-UL55的構(gòu)建與鑒定
2.2. 1. 1目的片段的酶切與連接限制性內(nèi)切酶BamH I和)(h0 I分別雙酶切
PMD18-UL55質(zhì)粒和原核表達(dá)載體pET3h(+)，酶切體系均為
pMD18-UL55 質(zhì)粒原核表達(dá)載體pET32a(+)8.0μ1BamHIBamHIΙ.ΟμΙXho IXhoIΙ.ΟμΙIOxH bufferIOxH buffer2.0μ1超純水補(bǔ)足至、超純水補(bǔ)足至20μ1 37°C水浴4h，按DNA回收試劑盒使用說(shuō)明分別回收目的片段后，按照下列連接體系16 °C連接過(guò)夜?；厥漳康钠蜺L554.7μ1
Γ pET32a雙酶切回收片段2.3μ1
2xDNA 連接酶 Mixtrue 7.5μ1 超純水補(bǔ)足至_ 15μ12. 2. 1. 2重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化采用氯化鈣法制備Dffia感受態(tài)細(xì)胞。之后，取連接液 10 μ 1加到含200 μ 1感受態(tài)Dffia的離心管中，混勻后冰浴30min ；置于42°C水浴90sec，然后迅速冰浴anin ；加入不含Amp的LB液體培養(yǎng)基800 μ 1，37°C振搖(150r/min)培養(yǎng)1 1. 5h ；取200 μ 1培養(yǎng)物涂布于含IOOy g/mLAmp的LB平板，37 °C培養(yǎng)過(guò)夜，次日挑取單個(gè)菌落接種于5mL的LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)12 16h，同時(shí)設(shè)立空載體轉(zhuǎn)化組(空載體 10 μ 1+感受態(tài)Dffia 200 μ 1)、無(wú)載體對(duì)照組(滅菌超純水10 μ 1+感受態(tài)Dffia 200 μ 1)。2. 2. 1. 3重組質(zhì)粒的酶切和PCR鑒定將上述保存的克隆菌種接種于5ml的LB液體培養(yǎng)基(含Amp 50yg/ml)中，37°C水浴振搖培養(yǎng)過(guò)夜，次日按常規(guī)方法提取重組質(zhì)粒， 然后用Β ο I單酶切、BamH I和Β ο I雙酶切鑒定該重組質(zhì)粒，其酶切體系如下
BamH IBamH V Xho I
pET32a-UL55 質(zhì)粒8.0μ1Ι .ΟμΙΙ.ΟμΙBamHI-Xho IΙ.ΟμΙΙ.ΟμΙ 'IOxH BufferΙ.ΟμΙ2.0μ1
超純水補(bǔ)足至10μ120μ1然后，以上述重組質(zhì)粒為模板，利用方法2. 1. 1中的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，其方法和擴(kuò)增條件同上，取PCR產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)。經(jīng)過(guò)酶切和PCR鑒定，獲得重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a-UL55。2. 2. 2重組表達(dá)質(zhì)粒pET3h_UL55的誘導(dǎo)表達(dá)2. 2. 2. 1重組質(zhì)粒pET3h-UL55的提取挑取2. 2. 1. 3已鑒定含陽(yáng)性重組質(zhì)粒 pET32a-UL55的Dffia菌種劃線接種于含Amp 50g/mL的LB瓊脂平板上，37 °C培養(yǎng)過(guò)夜， 次日取單個(gè)菌落接種于5mL LB液體培養(yǎng)基上，劇烈振蕩培養(yǎng)10 16h，離心收集菌液，按 UltraPure 質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒說(shuō)明進(jìn)行重組質(zhì)粒的提取與純化。2. 2. 2. 2重組質(zhì)粒pET3h_UL55轉(zhuǎn)化表達(dá)菌采用氯化鈣法制備E. coli BL(DE3) 感受態(tài)細(xì)胞，并將上述提取的重組質(zhì)粒pET3h-UL55轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌E. coli BL(DE3) 中，方法同2. 2. 1. 2。2. 2. 2. 3重組質(zhì)粒pET3h-UL55的誘導(dǎo)表達(dá)從上述LB固體培養(yǎng)基(含Amp50 μ g/ mL)上，挑取陽(yáng)性克隆菌，接種LB液體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)過(guò)夜，次日取菌液按1 50的比例接入5mL LB液體培養(yǎng)基(含Amp 50 μ g/mL)中，劇烈振蕩培養(yǎng)至0D600 = 0. 4時(shí)，分別加入IPTG至終濃度為1. Ommol/L,誘導(dǎo)3h后，收集ImL培養(yǎng)菌液，4°C 13000r/min離心2min， 棄上清，沉淀中加入80 μ 1超純水和20 μ 1 5X SDS上樣緩沖液，10(TC水浴加熱變性5 lOmin，進(jìn)行12% SDS-PAGE凝膠電泳，觀察表達(dá)結(jié)果。
2. 2. 2. 4重組質(zhì)粒pET3h_UL55表達(dá)產(chǎn)物的可溶性分析將誘導(dǎo)表達(dá)的IOOmL菌液和未誘導(dǎo)表達(dá)的IOOmL菌液，分別按以下步驟處理4°C lOOOOr/min離心5min，菌體沉淀用20mL 20mmol Tris-HCl (pH8. 0)懸?。恢胈20°C過(guò)夜后，加溶菌酶至終濃度為lmg/mL，4°C 攪拌30min,超聲波(冰浴)間歇破碎菌體(600w, 30sec/次，10次)，4°C 10000r/min離心 lOmin，取上清備用；沉淀用 IOmL 洗液(10mmol/L PBS+2mol/L 尿素+0. 2% Triton X-100) 懸浮，4°C，lOOOOr/min離心IOmin后，沉淀再次用IOmL洗液懸浮，重復(fù)洗滌五次后，用適量尿素溶液(lOmmol/L PBS+8mol/L尿素)溶解沉淀，低溫保存?zhèn)溆?。分別取適量的上清和尿素溶液溶解的沉淀，向其中加入80 μ 1超純水和20 μ 15 X SDS上樣緩沖液，100°C水浴加熱變性5 lOmin，進(jìn)行12% SDS-PAGE凝膠電泳，將凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色后，觀察結(jié)果。2. 2. 3重組質(zhì)粒pET3h_UL55誘導(dǎo)條件的優(yōu)化2. 2. 3. 1誘導(dǎo)劑IPTG的濃度優(yōu)化按2. 2. 2. 3方法，取含重組質(zhì)粒pET32a-UL55 的表達(dá)宿主菌BL21 (DE3)，接種5mL LB液體培養(yǎng)基(含Amp 50 μ g/mL)中，37 °C振搖培養(yǎng)過(guò)夜。次日按1 50轉(zhuǎn)接種于5mL LB液體培養(yǎng)基(含Amp 50 μ g/mL)中，37°C培養(yǎng)培養(yǎng)至0D600值約0. 4時(shí)，取其中6只試管，分別加入IPTG至終濃度為0. Immol/L、0. 2mmol/L、 0. 4mmol/L、0. 6mmol/L、0. 8mmol/L、l. Ommo 1/L 37°C誘導(dǎo)培養(yǎng) 4h 后，按上述方法對(duì)樣品進(jìn)行處理，12% SDS-PAGE電泳，觀察結(jié)果。2. 2. 3. 2溫度條件優(yōu)化按上述方法，取含重組質(zhì)粒pET3h-UL55的表達(dá)宿主菌 BL21(DE3)，接種5mL LB液體培養(yǎng)基(含Amp 50 μ g/mL)中，37°C振搖培養(yǎng)過(guò)夜。次日按 1 50轉(zhuǎn)接種于5mL LB液體培養(yǎng)基(含Amp 50 μ g/mL)中，37°C培養(yǎng)培養(yǎng)至0D600值約 0. 4時(shí)，取其中3只試管，分別加入IPTG至終濃度為0. 2mmol/L，分別置于25°C、30°C、37°C 誘導(dǎo)培養(yǎng)4h，按2. 2. 2. 3方法對(duì)樣品進(jìn)行處理，12% SDS-PAGE電泳，觀察結(jié)果。2. 2. 3. 3誘導(dǎo)時(shí)間優(yōu)化取含重組質(zhì)粒pET3h_UL55的表達(dá)宿主菌BL21 (DE3)，接種5mL LB液體培養(yǎng)基(含Amp 50 μ g/mL)上，37°C振搖培養(yǎng)過(guò)夜。次日按1 50轉(zhuǎn)接種于 5mL LB液體培養(yǎng)基(含Amp 50 μ g/mL)上，繼續(xù)培養(yǎng)至0D600值約0. 4時(shí)，加入IPTG至終濃度為0. 8mmol/L，37°C誘導(dǎo)培養(yǎng)，分別于誘導(dǎo)后4、5、6、7、8h，吸取ImL培養(yǎng)液，按2. 2. 2. 3 方法對(duì)樣品進(jìn)行處理，12% SDS-PAGE電泳，觀察結(jié)果。2. 3重組UL55蛋白的大量制備、純化與復(fù)性2. 3. 1菌體的大量培養(yǎng)具體步驟為(1)將含pET3^i-UL55質(zhì)粒的表達(dá)菌E. coli BL21(DE3)接種于 200mlLB液體培養(yǎng)基(含50 μ g/ml Amp)中，37°C培養(yǎng)16h，作為種子菌；(2)向已滅菌的 LB液體培養(yǎng)基(含50 μ g/ml Amp)中加入種子菌(按5 % ν/ν的比例加)；(3)在180r/ min, 370C，pH 7. O的條件下培養(yǎng)，待培養(yǎng)至菌液OD6tltl = 0. 6左右時(shí)，加入IPTG至終濃度為 0. 2mmol/L，37°C誘導(dǎo)培養(yǎng)4h ； (4)收集培養(yǎng)好的菌液(約5L), 8000r/min離心IOmin后收集菌體沉淀，用適量iTris-HCl (20mmol/L，pH 8.0)重懸后，加入溶菌酶使其終濃度為Img/ ml，-20°C保存?zhèn)溆谩?. 3. 2重組UL55蛋白的包涵體洗滌法大量純化取出-20°C保存的菌體沉淀，室溫下融化后，超聲波(冰浴)間歇破碎菌體 (200w,30sec/ 次，5 10 次)，4°C 10000r/min 離心 IOmin0 將沉淀用 20ml 洗液(IOmmol/ LPBS+2mol/L 尿素+1 % Triton X-100+20mM Tris-HCl+2mM EDTA)懸浮，4 °C 10000r/min離心IOmin后，沉淀再次用20ml洗液懸浮，重復(fù)洗滌五次后，用適量尿素溶液(lOmmol/ LPBS+8M 尿素+50mM Tris-HCl+50mM NaCl+10%甘油)溶解沉淀，4°C保存?zhèn)溆谩?. 3. 3重組UL55蛋白的復(fù)性和檢測(cè)將包涵體洗滌純化得到的重組UL55蛋白分多次加入到復(fù)性緩沖液(50mM Tris-HClpH 8. 0+0. 15M NaCl+lmM EDTA+ImM GSSG+lOmM GSSH)中，使尿素濃度按 6M、5M、 4M、3M、2M逐步降低，使變性蛋白逐漸復(fù)性，并控制蛋白終濃度在0. 1 lmg/ml的范圍內(nèi)。4°C復(fù)性M 48h，收集稀釋復(fù)性的蛋白液，裝入透析袋4°C透析(透析緩沖液50mM Tris-HCl pH 8. 0+50mM NaCl+0. 5mM EDTA+10%甘油+1 %甘氨酸)M 48h。透析后樣品經(jīng) 8000g離心15min后收集上清，取其中20 μ 1進(jìn)行SDS-PAGE分析，并以純化的的兔抗DPV為一抗，以HRP標(biāo)記羊抗兔IgG為二抗進(jìn)行Wfestern blotting檢測(cè)。其余蛋白液用Bradford 法測(cè)定蛋白的最終濃度，分裝后冷凍干燥濃縮備用。再重復(fù)大量表達(dá)兩次并分別純化UL55重組蛋白，共得到3批不同表達(dá)和純化的 UL55重組蛋白。3實(shí)驗(yàn)結(jié)果3. 1 DPV UL55基因的擴(kuò)增、T-克隆與鑒定結(jié)果3. 1. 1UL55基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果以DPV CHv毒株基因組DNA為模板對(duì)UL55基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其產(chǎn)物經(jīng)1. 0%瓊脂糖凝膠電泳，獲得了一條約799bp的特異性DNA條帶，而以正常DEF基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，無(wú)特異性條帶，這與預(yù)期結(jié)果一致(圖1-A)。3. 1.2UL55基因T克隆鑒定結(jié)果PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，與pMD18-T載體連接并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5 α，得到的T 克隆命名為PMD18-UL55。對(duì)pMD18_UL55進(jìn)行PCR、酶切(圖1-B)和測(cè)序鑒定，結(jié)果表明， T克隆獲得的UL55基因序列同已知的DPV UL55基因序列完全一致。3. 2原核表達(dá)質(zhì)粒pET3h_UL55的構(gòu)建與鑒定、誘導(dǎo)表達(dá)及其優(yōu)化結(jié)果3. 2. 1重組表達(dá)質(zhì)粒pET3h_UL55的構(gòu)建與酶切鑒定以BamH I和Xho I雙酶切T克隆質(zhì)粒后回收目的片斷，與經(jīng)相同酶切的 pET-32a(+)表達(dá)載體連接，轉(zhuǎn)化DH5 α，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pET3h-UL55 (理論大小約為 6169bp)，經(jīng)BamH I和Xho I雙酶切后得到的兩條片斷的大小分別約為5370bp和799bp (見(jiàn)圖1-C)，與理論值相符，表明原核表達(dá)載體被成功構(gòu)建。3. 2. 2重組質(zhì)粒pET3h_UL55的誘導(dǎo)表達(dá)3. 2. 2. 1重組質(zhì)粒pET3h-UL55的誘導(dǎo)表達(dá)將重組質(zhì)粒pET3h_UL55轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21 (DE3)在含Amp的LB瓊脂平板上篩選到了白色菌落。將含重組質(zhì)粒pET3h_UL55 的表達(dá)宿主菌BL21(DE3)用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)、未用IPTG誘導(dǎo)、空載體pET_32a(+)轉(zhuǎn)化菌株誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果表明空載體pET-32a(+)轉(zhuǎn)化菌株誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)菌株都未出現(xiàn)特異性蛋白條帶；重組表達(dá)質(zhì)粒pET3h-UL55表達(dá)的重組UL55蛋白在40KD處(圖2-A)。3. 2. 2. 2重組質(zhì)粒pET3h-UL55表達(dá)產(chǎn)物的可溶性分析誘導(dǎo)表達(dá)的IOOmL菌液經(jīng)可溶性分析處理后，電泳結(jié)果顯示表達(dá)蛋白主要存在于沉淀中，說(shuō)明重組表達(dá)蛋白在菌體中大量以不溶的包涵體形式存在。3. 2. 3重組質(zhì)粒pET3h_UL55誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化
3. 2. 3. 1 IPTG濃度的優(yōu)化在37°C條件下，加入IPTG使其終濃度分別為0. Immol/ L、0. 2mmol/L、0. 4mmol/L、0. 6mmol/L、0. 8mmol/L、l. Ommo 1/L 誘導(dǎo)培養(yǎng) 4h,結(jié)果顯示未加誘導(dǎo)劑的對(duì)照管無(wú)特異性蛋白條帶；隨IPTG濃度的增高，蛋白誘導(dǎo)量沒(méi)有明顯差別(圖 2-B)。但是比較而言，IPTG濃度為0. 2mmol/L時(shí)，蛋白表達(dá)量略高。因此，可選擇0. 2mmol/ L的IPTG濃度作為誘導(dǎo)表達(dá)濃度。3. 2. 3. 2誘導(dǎo)溫度條件的優(yōu)化37°C培養(yǎng)培養(yǎng)至0D600值約0. 4時(shí)，取3只滅菌試管，分裝5mL/管，分別加入IPTG至終濃度為0. 2mmol/L，分別置于25°C、30°C、37°C誘導(dǎo)培養(yǎng)4h，結(jié)果溫度在25°C時(shí)，誘導(dǎo)蛋白量較少，37°C時(shí)最高(圖2-C)，說(shuō)明隨著溫度升高，蛋白誘導(dǎo)量逐漸增加。因此，選擇溫度37°C為最佳誘導(dǎo)溫度。3. 2. 3. 3誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化在IPTG濃度為0. 2mmol/L，37°C條件下，采用4 8h不同誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果隨著時(shí)間的增加誘導(dǎo)產(chǎn)生的重組蛋白表量降低。誘導(dǎo)5 8h的重組蛋白表達(dá)量均顯著低于4h誘導(dǎo)組；而誘導(dǎo)6 他，其重組蛋白表達(dá)量低于證且彼此間相比無(wú)明顯變化(圖2-D)。因此，選擇4h作為最佳誘導(dǎo)時(shí)間。3.3重組UL55蛋白的純化結(jié)果通過(guò)大量擴(kuò)大培養(yǎng)，收集到了大量含有重組UL55蛋白的菌體沉淀，經(jīng)溶菌酶裂解、超聲破碎、洗滌和溶解包涵體、變性蛋白透析復(fù)性等過(guò)程獲得了大量純化的重組UL55 蛋白，通過(guò)SDS-PAGE分析顯示純化的重組UL55蛋白具有較高的純度(圖3-A)，Western blotting分析顯示該重組UL55蛋白能與抗DPV陽(yáng)性血清發(fā)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)(圖3-B)， 表明該重組蛋白具有較高的免疫原性，可作為臨床上檢測(cè)鴨瘟抗體的檢測(cè)抗原。實(shí)施例2、UL55-ELISA法檢測(cè)DPV抗體方法的建立和應(yīng)用上述實(shí)施例獲得的重組UL55蛋白，抗DPV鴨血清(為弱毒疫苗免疫后14d的免疫鴨血清，中和效價(jià)為1 8)，抗DHV(鴨肝炎病毒)、RA(鴨里默氏桿菌)、Salm0nella(沙門氏菌)、鴨腫頭出血癥病毒、流感病毒和E. coli (大腸桿菌)鴨血清及非免疫鴨陰性血清，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)禽病研究中心提供；羊抗鴨IgG-HRP(辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的羊抗鴨IgG)和四甲基聯(lián)苯胺(TMB)均購(gòu)自美國(guó)KPL公司；牛血清白蛋白(BSA)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。1 UL55-ELISA法檢測(cè)DPV抗體方法的建立1. 1重組UL55蛋白包被濃度和血清稀釋度的確定采用方陣方法確定最佳抗原包被濃度和血清稀釋濃度，用包被液對(duì)濃度為^ig/ mL的復(fù)性后的重組UL55蛋白進(jìn)行系列稀釋(1 IOU 20,1 40,1 80,1 160、 1 320)，包被酶標(biāo)反應(yīng)板，每孔包被100 μ 1，每個(gè)滴度平行包被兩列，將鴨血清(抗DPV陽(yáng)性血清或非免疫鴨陰性血清)按1 10、1 20、1 40、1 80、1 160、1 320的稀釋度進(jìn)行系列稀釋，羊抗鴨IgG-HI^Mtl 2000稀釋，用間接ELISA方法測(cè)定，選擇陽(yáng)性血清的OD45tlnm值接近1. 0，陰性血清的OD45tlnm值較小，Ρ/Ν值最大的UL55蛋白和鴨血清的稀釋度為此ELISA的抗原抗體反應(yīng)的最適工作濃度。重組UL55蛋白抗原用包被液作系列稀釋后，再加1 10-1 320稀釋的陽(yáng)性血清或陰性血清；另加1 2000稀釋的羊抗鴨IgG-HRP酶標(biāo)二抗，加底物顯色液，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定OD45tlnm值。純化抗原包被濃度在0. 4mg/ml 0. 0125mg/ml之間時(shí)，陽(yáng)性血清的稀釋度為1 10-1 320時(shí)，不同稀釋度的抗體的OD45tlnm值見(jiàn)表1。當(dāng)P/N值最大為9. 667 的時(shí)候，由方陣滴定所得的最佳抗原包被濃度為2. 0μ g/ΙΟΟμ 1時(shí)，陽(yáng)性血清的稀釋度為
111 160。各抗原抗體濃度對(duì)應(yīng)的P/N值見(jiàn)表2。
表1方陣滴定的OD45tlnm結(jié)果
Item抗原稀釋度
不同稀釋度抗體的OD450nm
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)鴨瘟病毒抗體的重組原核表達(dá)蛋白，其特征在于該檢測(cè)鴨瘟病毒抗體的重組原核表達(dá)蛋白由SEQ ID NO 2的氨基酸序列表定義；是SEQ ID NO 1核苷酸序列的原核表達(dá)產(chǎn)物。
2.一種檢測(cè)鴨瘟病毒抗體的原核表達(dá)蛋白的制備方法，其特征在于，包括(1)設(shè)計(jì)擴(kuò)增DPV-UL55基因的特異性引物；(2)通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得UL55基因片段；(3)對(duì)UL55基因進(jìn)行克隆、測(cè)序鑒定；(4)將UL55基因定向亞克隆至pET3h原核表達(dá)載體；(5)UL55基因在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)；將重組表達(dá)質(zhì)粒pET3h-UL55轉(zhuǎn)化宿主菌大腸桿菌BL21 (DE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；(6)UL55基因表達(dá)蛋白的純化；(7)重組UL55蛋白的復(fù)性和檢測(cè)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟(6)具體做法為 ①待純化樣的制備離心收集表達(dá)菌液收集誘導(dǎo)表達(dá)的菌液離心取沉淀，將菌體沉淀用 20mmolTris-HCl (pH8. 0)懸浮，直接進(jìn)行包涵體洗滌法純化重組ULL55蛋白的或_20°C保存②重組ULL55蛋白的包涵體洗滌法純化取出離心收集并用20mmolTriS-HCl (pH8. 0)懸浮的表達(dá)菌(-20 V保存的菌體沉淀，室溫下融化后)，超聲波(冰浴)間歇破碎菌體O00w，30sec/次，5 10次)， 4 "C 10000r/min 離心 lOmin。將沉淀用 20ml 洗液(10mmol/L PBS+2mol/L 尿素 +1 % Triton X-100+20mMTris-HCl+2mM EDTA)懸浮，4 °C 10000r/min 離心 IOmin 后，沉淀再次用20ml洗液懸浮，重復(fù)洗滌五次后，用適量尿素溶液(lOmmol/L PBS+8M尿素+50mM "Tris-HCl+SOmMNaCl+lO^甘油)溶解沉淀，4°C保存?zhèn)溆谩?br> 4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟(7)具體做法為將包涵體洗滌純化得到的重組UL55蛋白分多次加入到復(fù)性緩沖液(50mM Tris-HCl pH8. 0+0. 15M NaCl+lmM EDTA+ImM GSSG+lOmM GSSH)中，使尿素濃度按611、511、4] 、311、211逐步降低，使變性蛋白逐漸復(fù)性，并控制蛋白終濃度在0. 1 lmg/ml的范圍內(nèi)。4°C復(fù)性M 48h，收集稀釋復(fù)性的蛋白液，裝入透析袋4°C透析(透析緩沖液50mMTris-HCl pH 8. 0+50mM NaCl+0. 5mM EDTA+10%甘油+1%甘氨酸) 48h。透析后樣品經(jīng)8000g離心15min后收集上清，取其中20 μ 1進(jìn)行SDS-PAGE分析，并以純化的的兔抗DPV為一抗，以HRP標(biāo)記羊抗兔IgG為二抗進(jìn)行Western blotting檢測(cè)。其余蛋白液用Bradford法測(cè)定蛋白的最終濃度，分裝后冷凍干燥濃縮備用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種用于檢測(cè)鴨瘟病毒抗體的UL55重組原核表達(dá)蛋白及制備方法，該檢測(cè)鴨瘟病毒抗體的重組原核表達(dá)蛋白由SEQ ID NO2的氨基酸序列表定義；是SEQ ID NO1核苷酸序列的原核表達(dá)產(chǎn)物。制備方法包括(1)設(shè)計(jì)擴(kuò)增DPV-UL55基因的特異性引物；(2)通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得UL55基因片段；(3)對(duì)UL55基因進(jìn)行克隆、測(cè)序鑒定；(4)將UL55基因定向亞克隆至pET32a原核表達(dá)載體；(5)UL55基因在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)；(6)UL55基因表達(dá)蛋白的純化；(7)重組UL55蛋白的復(fù)性和檢測(cè)。本產(chǎn)品可以作為檢測(cè)鴨瘟病毒抗體的間接ELISA和Western Blot方法的檢測(cè)抗原，也可以作為預(yù)防鴨瘟病毒感染的基因工程亞單位疫苗。
文檔編號(hào)C12N15/38GK102174087SQ201110047060
公開(kāi)日2011年9月7日 申請(qǐng)日期2011年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月28日
發(fā)明者吳英, 汪銘書(shū), 程安春, 陳孝躍 申請(qǐng)人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物工程技術(shù)中心