專利名稱：一種雞胚同時增殖h9亞型禽流感病毒及禽巴氏桿菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種雞胚同時增殖H9亞型禽流感病毒及禽巴氏桿菌的方法，屬于生物學(xué)領(lǐng)域，特別屬于獸用生物制品領(lǐng)域。背景技術(shù)：
目前，為了避免和減少在畜禽養(yǎng)殖生產(chǎn)中因反復(fù)接種疫苗而造成的畜禽應(yīng)激反應(yīng)和勞動力增加等問題，獸用生物制品研究者們紛紛著力于開發(fā)研制聯(lián)苗來應(yīng)用于實際生產(chǎn)中?，F(xiàn)在一般采取選擇不同材料增殖細(xì)菌、病毒，測定細(xì)菌、病毒液含量后分別經(jīng)相應(yīng)的濃縮后再按一定配比混合來制備各類聯(lián)苗。本領(lǐng)域的傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，雞胚不適于作為細(xì)菌培養(yǎng)基，只用作病毒傳代、增殖的材料，在病毒學(xué)的研究和疫苗生產(chǎn)中起重要作用。而在一些家禽細(xì)菌和病毒聯(lián)苗生產(chǎn)過程中，通常利用配制的各類培養(yǎng)基和雞胚分別做為增殖細(xì)菌和病毒的材料。這樣，不但生產(chǎn)成本較高，而且要經(jīng)過繁瑣的濃縮過程來實現(xiàn)聯(lián)苗對細(xì)菌、 病毒抗原的含量要求，增加了人力成本和對設(shè)備的要求。為了解決上述疫苗研發(fā)、生產(chǎn)的實際問題，本發(fā)明提出了一種采用雞胚同時增殖 H9亞型禽流感病毒和禽巴氏桿菌的方法，大大節(jié)約了此類聯(lián)苗的生產(chǎn)成本，減少了勞動強度，也減少了對濃縮設(shè)備的需要，同時也拓展了雞胚的用途。此外，本發(fā)明為其他相應(yīng)病毒和細(xì)菌聯(lián)苗的研發(fā)提供了思路。三、發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問題
本發(fā)明的目是提供一種采用雞胚同時增殖H9亞型禽流感病毒和禽巴氏桿菌的方法。技術(shù)方案
本發(fā)明的技術(shù)方案是采用雞胚同時增殖H9亞型禽流感病毒和禽巴氏桿菌的方法， 該方法是將H9亞型禽流感病毒和禽巴氏桿菌分別于不同時間經(jīng)尿囊腔接種同一雞胚，經(jīng) 37 °C繼續(xù)孵化至雞胚死亡，收獲死亡雞胚尿囊液。上述技術(shù)方案是按照以下步驟實施的
取H9亞型禽流感病毒尿囊液稀釋5000 10000倍后，0. Iml/枚尿囊腔接種9 10日齡SPF雞胚，37°C孵化48 60小時。將禽巴氏桿菌稀釋至含菌量5 100個/毫升，尿囊腔接種上述雞胚37°C繼續(xù)孵化12 M小時，將致死雞胚尿囊液回收，取樣純檢，計數(shù)活菌數(shù)和測定病毒含量。上述方法可以在生產(chǎn)同時繁殖同類的病毒和細(xì)菌相應(yīng)聯(lián)苗中得到應(yīng)用。有益效果
利用雞胚同時增殖H9亞型禽流感病毒和禽巴氏桿菌，節(jié)約了生產(chǎn)成本，拓展了雞胚的用途。所增殖的禽巴氏桿菌量較常規(guī)培養(yǎng)的含菌量大為提高，且增殖的H9亞型禽流感病毒量與正常單獨接種病毒所得的病毒含量、HA效價相當(dāng)。該方法可用于同時增殖H9亞型禽流感病毒和禽巴氏桿菌以用于相應(yīng)聯(lián)苗的生產(chǎn)。具體實施例方式
31.菌毒種
H9亞型禽流感病毒NJOl株[A / Duck / Nanjing / 01 / 1999 (H9N2)]由江蘇省農(nóng)科院獸醫(yī)研究所分離、鑒定、保存并經(jīng)中國農(nóng)科院哈爾濱獸醫(yī)研究所國家禽流感參考實驗室鑒定(劉宇卓，李銀，張敬峰，魏雪濤，梁國民，吳繼紅.一株鴨源H9亞型禽流病毒的分離及鑒定.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2007，3:153-154,165)。禽巴氏桿菌來源購自國家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心。菌種保藏號CVCC458.
2.H9亞型禽流感病毒的接種取H9亞型禽流感病毒NJOl株尿囊液(病毒含量EID5tl為 IO-8 3VO. 1ml)，用滅菌生理鹽水稀釋10000倍后，尿囊腔接種9日齡雞胚20枚，0. Iml/枚， 置37°C孵化52小時。3.禽巴氏桿菌的接種取保存的禽巴氏桿菌培養(yǎng)液，稀釋至含5 100個巴氏桿菌每毫升，再次尿囊腔接種上述雞胚中，0. Iml/枚，置37°C繼續(xù)孵化至雞胚死亡。4.收獲上述死亡雞胚尿囊液，分別測定HA和進(jìn)行純檢和活菌計數(shù)，并將尿囊液過濾除菌后測定其病毒含量(EID5CI)。通過純檢和活菌計數(shù)，尿囊液內(nèi)所含細(xì)菌為單一巴氏桿菌，每毫升含菌量達(dá)到 4X IOltlCFU,比傳統(tǒng)培養(yǎng)基增殖的每毫升含菌量(IX IO8 IXlO9 CFU)大為提高。測定尿囊液HA為29，病毒含量(EID5tl)為I(T8 63A). Iml,與正常單獨接種病毒所得的病毒含量、HA效價相當(dāng)。所述方法可以在生產(chǎn)H9亞型禽流感病毒和禽巴氏桿菌聯(lián)苗中得到應(yīng)用，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以想到的。
權(quán)利要求
1.一種雞胚同時增殖H9亞型禽流感病毒及禽巴氏桿菌的方法，其特征在于利用雞胚同時繁殖H9亞型禽流感病毒和禽巴氏桿菌兩種病原。
2.按照權(quán)利要求1所述的一種雞胚同時增殖H9亞型禽流感病毒及禽巴氏桿菌的方法， 其特征在于先將H9亞型禽流感病毒接種雞胚后孵化一定時間后，再接種禽巴氏桿菌后繼續(xù)孵化直至雞胚死亡，獲取雞胚尿囊液。
3.按照權(quán)利要求1或2所述的一種雞胚同時增殖H9亞型禽流感病毒及禽巴氏桿菌的方法，其特征在于先將H9亞型禽流感病毒尿囊液稀釋1000 10000倍后，尿囊腔接種9 11日齡雞胚，0. Iml/枚，37 °C繼續(xù)孵化40 60小時；再將禽巴氏桿菌稀釋至含菌量5 100個/毫升，再次尿囊腔接種已接種過H9亞型禽流感病毒并已孵化40 60小時的雞胚中，0. Iml/枚，置37°C繼續(xù)孵化至雞胚死亡，收獲尿囊液分別測定病毒含量及細(xì)菌含量。
4.權(quán)利要求1-3所述方法在生產(chǎn)H9亞型禽流感病毒和禽巴氏桿菌聯(lián)苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種雞胚同時增殖H9亞型禽流感病毒及禽巴氏桿菌的方法，屬于生物學(xué)領(lǐng)域，特別屬于獸用生物制品領(lǐng)域。該方法包括以下步驟先將H9亞型禽流感病毒尿囊液經(jīng)稀釋后尿囊腔接種雞胚，37℃孵化一定時間后再次接種經(jīng)稀釋后的禽巴氏桿菌菌液，繼續(xù)孵化至雞胚死亡，收獲含有H9亞型禽流感病毒及禽巴氏桿菌的尿囊液。本發(fā)明方法獲得的同時含有H9亞型禽流感病毒及禽巴氏桿菌的尿囊液具有菌落含量較常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)高、病毒含量及HA與常規(guī)雞胚繁殖相當(dāng)，且操作簡便，節(jié)約成本等優(yōu)點，可用于相應(yīng)獸用生物制品細(xì)菌和病毒聯(lián)苗的研發(fā)和生產(chǎn)。
文檔編號C12N7/00GK102174444SQ201110047388
公開日2011年9月7日 申請日期2011年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月28日
發(fā)明者劉宇卓, 吳繼紅, 張敬峰, 李銀, 梁國民, 趙冬敏, 魏雪濤, 黃欣梅 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院