專利名稱：光可控的基因表達(dá)系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)中的遺傳工程或合成生物學(xué)領(lǐng)域。具體的說(shuō)，本發(fā)明涉及基因表達(dá)領(lǐng)域。更具體的說(shuō)，本發(fā)明涉及新的基于光調(diào)控蛋白的可誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)和采用該表達(dá)系統(tǒng)調(diào)控宿主細(xì)胞中基因表達(dá)的方法。
背景技術(shù)：
在遺傳工程領(lǐng)域，準(zhǔn)確控制基因的表達(dá)可為研究和控制發(fā)育及其他生理過(guò)程提供有價(jià)值的工具?；虮磉_(dá)是復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，包括許多蛋白-蛋白之間的特異性相互作用?；虮磉_(dá)的第一步是DNA轉(zhuǎn)錄為RNA，須將轉(zhuǎn)錄因子遞送到控制基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子附近。轉(zhuǎn)錄因子，也稱為序列特異性DNA結(jié)合蛋白，是一種能夠特異性結(jié)合啟動(dòng)子DNA序列導(dǎo)致下游基因DNA序列轉(zhuǎn)錄成RNA的蛋白質(zhì)。轉(zhuǎn)錄因子可以是單一蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)復(fù)合體， 它與啟動(dòng)子的識(shí)別/結(jié)合能啟動(dòng)或阻止RNA聚合酶將DNA轉(zhuǎn)錄為RNA，可分為轉(zhuǎn)錄激活因子或轉(zhuǎn)錄阻遏因子。通常，轉(zhuǎn)錄因子至少含一個(gè)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并能募集協(xié)同因子(或稱輔激活蛋白)共同作用而結(jié)合啟動(dòng)子區(qū)的正確位點(diǎn)從而啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄因子除含DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域外一般還含轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域或轉(zhuǎn)錄阻遏結(jié)構(gòu)域，轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可相距DNA結(jié)合域適當(dāng)距離。傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因方法采用通用性或細(xì)胞類型特異性啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。用含目的基因和相應(yīng)啟動(dòng)子的DNA構(gòu)建物(也稱為靶轉(zhuǎn)錄元件)轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)或整合到宿主細(xì)胞基因組中，當(dāng)加入相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子結(jié)合后，即可引發(fā)目的基因在給定細(xì)胞類型中轉(zhuǎn)錄然后翻譯表達(dá)為相應(yīng)的蛋白質(zhì)。調(diào)節(jié)外源基因在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄表達(dá)的另一種方法是采用可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。這種可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子具體包括兩大類(I)化學(xué)物質(zhì)可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子和基因表達(dá)系統(tǒng)，和
(2)物理方法可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子和基因表達(dá)系統(tǒng)?；瘜W(xué)誘導(dǎo)物質(zhì)包括小分子藥物，其典型的例子是抗生素如四環(huán)素[Gossen, M.和H. Bujard等，Proc Natl Acad Sci USA,1992. 89(12) :5547-5551 ；Gossen, M 等 ，Science, 1995. 268(5218) :1766-1769]和鏈霉素[Fussenegger,M.等.,NatBiotechnol, 2000. 18(11) 1203-1208.];激素[Wang, Y.等.，Proc Natl Acad Sci U S A, 1994. 91 (17) :8180-8184]及其類似物；金屬離子(典型的例子是銅離子)[Mullick, A.等，BMCBiotechnol, 2006. 6 :43.]及其他誘導(dǎo)物如乙醒[Weber,W.等.Nat Biotechnol, 2004. 22(11) :1440-1444. ;Weber，W.，等，Metab Eng, 2005. 7 (3)174-181.]。物理方法可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子和基因表達(dá)系統(tǒng)主要包括，紫外線(UV)調(diào)控的“囚籠(caged) ”技術(shù)[Keyes,ff. M.和 A. A. Mills, Trends Biotechnol, 2003. 21 (2) :53-55.];遠(yuǎn)紅外光控制熱激效應(yīng)介導(dǎo)的基因表達(dá)系統(tǒng)[Kamei，Y.等,Nat Methods, 2009. 6 (I) :79-81.]。以上方法中化學(xué)物質(zhì)可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子和基因表達(dá)系統(tǒng)雖已獲得較廣泛應(yīng)用，但存在一些缺點(diǎn)，如(1) 一些誘導(dǎo)物具有多效性，會(huì)影響其它內(nèi)源基因的表達(dá)，從而使結(jié)果分析復(fù)雜化。如重金屬離子誘導(dǎo)的基因表達(dá)系統(tǒng)，重金屬離子不僅能誘導(dǎo)目的基因表達(dá)，還會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)其它重金屬離子誘導(dǎo)的基因的表達(dá)；(2) —些誘導(dǎo)物有潛在毒性從而影響其它基因的功能，例如重金屬離子對(duì)細(xì)胞有毒性，因而不能用于動(dòng)物或人體；(3)許多啟動(dòng)子體系在非誘導(dǎo)狀態(tài)下啟動(dòng)表達(dá)的活性很高，不能徹底關(guān)閉被調(diào)節(jié)基因，加入誘導(dǎo)劑前后的基因表達(dá)量比值(本文中也稱為誘導(dǎo)表達(dá)倍數(shù))較低，如激素表達(dá)系統(tǒng)[Wang，Y.等.，ProcNatl Acad Sci U S A，1994. 91(17) :8180-8184]，這類啟動(dòng)子體系不適合用于表達(dá)毒性基因以及低表達(dá)量即可引起顯著生物學(xué)效應(yīng)的基因；(4)有些化學(xué)物質(zhì)所誘導(dǎo)的基因表達(dá)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄因子由兩種或兩種以上蛋白質(zhì)共同構(gòu)成，例如基于FKBP-FRAP的基因表達(dá)系統(tǒng)[Rivera, V. M.等 ，Nat Med, 1996. 2 (9) :1028-1032.]，其轉(zhuǎn)錄因子由兩種融合蛋白構(gòu)成，導(dǎo)入細(xì)胞兩種不同蛋白的基因構(gòu)建物比導(dǎo)入一種蛋白基因構(gòu)建物困難更大或?qū)胄什睿?br> (5)化學(xué)誘導(dǎo)物只能在時(shí)間上調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，不能在空間上特異性調(diào)控某些細(xì)胞及組織的基因表達(dá)。而如上所述，現(xiàn)有的大部分物理方法可誘導(dǎo)的基因表達(dá)系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞的毒性高，如UV誘導(dǎo)的囚籠技術(shù)可能造成對(duì)細(xì)胞的不可逆性損傷；或遠(yuǎn)紅外激光控制熱激效應(yīng)的誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)可能激活其他內(nèi)源基因的表達(dá)，其設(shè)備操作復(fù)雜且昂貴[Kamei，Y.等，NatMethods,2009. 6(I) :79-81.]。然而，光是一種易于時(shí)間和空間操作的誘導(dǎo)物，一般對(duì)細(xì)胞無(wú)上述毒性，可采用的方法是把遠(yuǎn)源進(jìn)化物種的光可調(diào)節(jié)蛋白(也稱為光敏蛋白)引入高等真核細(xì)胞內(nèi)，將它們改造成為光調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子，便于光照調(diào)控目的基因的表達(dá)。預(yù)期這些蛋白質(zhì)不會(huì)干擾真核細(xì)胞的生理過(guò)程，在真核細(xì)胞中不會(huì)引起多重效應(yīng)或非特異效果。目前這方面的報(bào)道很少。Shimizu-Sato等人報(bào)道了適用于酵母細(xì)胞的光控基因表達(dá)系統(tǒng)[Shimizu-Sato,S 等 ，NatBiotechnol，2002. 20(10) : 1041-1044.]、美國(guó)專利 US6858429 敘述了通過(guò)基因工程技術(shù)將植物蛋白(植物色素phytochrome，簡(jiǎn)寫為Phy)和植物色素相互作用因子(phytochromeinteracting factor,簡(jiǎn)寫為PIF3)分別與雙雜交系統(tǒng)的酵母菌Gal4蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或Gal4的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(GAD)相連，構(gòu)成Gal4_Phy和PIF3-GAD兩種融合蛋白，當(dāng)用紅光照射時(shí)Gal4-Phy與PIF3-GAD兩個(gè)融合蛋白分子相互作用而結(jié)合，其中Gal4的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(AD)被帶到啟動(dòng)子附件從而啟動(dòng)下游基因轉(zhuǎn)錄；而用遠(yuǎn)紅外光刺激可使相互作用的這兩種融合蛋白解離，其中Gal4的AD不再結(jié)合于啟動(dòng)子從而終止下游基因的轉(zhuǎn)錄。雖然這個(gè)光誘導(dǎo)的啟動(dòng)子系統(tǒng)具有可逆性、誘導(dǎo)表達(dá)水平較高等優(yōu)點(diǎn)，但其缺點(diǎn)是植物色素Phy需在其生色團(tuán)藻青素(Phycocyanobilin)存在下才能與PIF3相互作用，而酵母細(xì)胞及哺乳動(dòng)物細(xì)胞不含這種物質(zhì)，必需外源加入宿主細(xì)胞中；而且此系統(tǒng)基于雙雜交原理，轉(zhuǎn)錄因子由兩種完整融合蛋白共同構(gòu)成，操作復(fù)雜。而且其基因構(gòu)建物較大導(dǎo)入細(xì)胞相對(duì)困難，限制了此系統(tǒng)的廣泛應(yīng)用。目前已知的其它光敏蛋白還有以黃素類物質(zhì)為生色團(tuán)的光敏蛋白(亦稱為黃素蛋白家族藍(lán)光受體)，分為三類一是含光-氧-電壓(light-oxygen-voltage, L0V)結(jié)構(gòu)域的光受體蛋白，如光敏色素；二是類似光裂解酶的隱花色素(photolyase-likecryptochromes);第三類是近些年來(lái)才發(fā)現(xiàn)的利用FAD的藍(lán)光蛋白(blue light usingFAD, BLUF)。光敏色素是含LOV結(jié)構(gòu)域的光受體蛋白質(zhì)最多的一類，研究較多的有向光素 I (phototropin I)、白領(lǐng)-I (WC-I)、白領(lǐng)-2 (WC-2)、PYP (光敏黃色蛋白，photoactive yellow protein)、Phy3、VIVID等。光敏色素通常是膜偶聯(lián)激酶蛋白，在藍(lán)光照射下發(fā)生自磷酸化改變激酶活性而調(diào)控相關(guān)的生理過(guò)程。大多數(shù)光敏色素的C端為絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域N端為結(jié)合黃素分子的兩個(gè)LOV結(jié)構(gòu)域，藍(lán)光照射時(shí)LOV結(jié)構(gòu)域與黃素分子共價(jià)結(jié)合生成黃素-半胱酰胺加成產(chǎn)物引起黃素結(jié)合口袋空間構(gòu)象變化，導(dǎo)致C端激酶結(jié)構(gòu)域改變其激酶活性，但此過(guò)程完全可逆。此外，兩個(gè)LOV結(jié)構(gòu)域中，L0V2光敏性比LOVl更高。Masayuki Yazawa 等利用擬南芥的 FKFl (flavin-binding, kelch repeat, fbox I)與GI (GIGANTEA)蛋白二者經(jīng)藍(lán)光激發(fā)后可發(fā)生相互作用的原理，將FKFl和GI分別與雙雜交系統(tǒng)酵母菌Gal4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和單純皰疹病毒顆粒蛋白16(VP16)的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(AD)相連，組成 Gal4_FKFl 和 VP16-GI 雙轉(zhuǎn)錄因子[Yazawa, M.,等,NatBiotechnol,2009. 27(10) :941-945. ] Gal4_FKFl因其中的Gal4含有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域可先結(jié)合啟動(dòng)子但單獨(dú)不能啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，用藍(lán)光刺激時(shí)VP16-GI即與Gal4-FKF1相互作用(具體是FKFl與GI相互作用)方才啟動(dòng)下游基因轉(zhuǎn)錄。這個(gè)系統(tǒng)的缺點(diǎn)是FKFl和GI蛋白基因構(gòu)建物較大導(dǎo)入細(xì)胞較難和誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)提高的倍數(shù)較低，最高僅為5倍左右。來(lái)自擬南芥(Arabidopsis thaliana)的隱花色素是第一個(gè)被分離得到的植物藍(lán)光光敏蛋白，研究比較多的有隱花色素 I (Cryptochromes I, CRYI)、隱花色素 2 (Cryptochromes 2, CRY2)、光敏色素A (phytochrome A, phyA)和光敏色素B (phytochrome B, phyB)等,主要功能是接受晝夜節(jié)律光調(diào)節(jié)高等植物的生長(zhǎng)和運(yùn)動(dòng)。隱花色素的氨基酸序列和生色團(tuán)組成與光裂解蛋白很 相似，多數(shù)隱花色素的大小為70kD-80kD，包含相對(duì)保守的N端PHR(光裂酶相關(guān))結(jié)構(gòu)域和長(zhǎng)度差異較大的C端未知結(jié)構(gòu)域，其PHR結(jié)構(gòu)域可非共價(jià)結(jié)合黃素。有研究利用擬南芥CRY2(隱花色素2)與CIBl (隱花色素2相互作用的螺旋環(huán)螺旋I)蛋白二者經(jīng)藍(lán)光激發(fā)后可發(fā)生相互作用，將CRY2和CIBl分別與雙雜交系統(tǒng)的酵母菌Gal4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和Gal4的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(GAD)相連，組成Gal4_CRY2和CIBl-GAD雙轉(zhuǎn)錄因子，用藍(lán)光刺激時(shí)CIBl-GAD與已與Gal4反應(yīng)元件結(jié)合的Gal4_CRY2相互作用(具體是CRY2與CIBl相互作用)在酵母細(xì)胞中可啟動(dòng)下游基因表達(dá)[Kennedy,M. J.，等.，Nat Methods, 2010. 7 (12)973-975]。該系統(tǒng)無(wú)需加入外源生色團(tuán)，但此系統(tǒng)也是基于雙雜交原理，轉(zhuǎn)錄因子由兩種完整融合蛋白共同構(gòu)成，操作復(fù)雜。而且在非誘導(dǎo)狀態(tài)下目的基因也有一定的表達(dá)，因而應(yīng)用有限。包含BLUF結(jié)構(gòu)域的藍(lán)光受體蛋白和包含LOV結(jié)構(gòu)域的光受體蛋白與隱花色素不同的是，前者光照激活后不會(huì)與黃素生色團(tuán)反應(yīng)生成共價(jià)產(chǎn)物，而是導(dǎo)致生色團(tuán)構(gòu)象變化引起黃色吸收光發(fā)生IOnm紅移。包含BLUF結(jié)構(gòu)域的光受體蛋白研究最多的是AppA，它是球狀紅桿菌(Rhodobactersphaeroides)的一種轉(zhuǎn)錄抗阻遏蛋白，黑暗時(shí)AppA與細(xì)胞中的一種PpsR轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合形成AppA-PpsR2復(fù)合物，使PpsR不能結(jié)合DNA ;強(qiáng)藍(lán)光照射可使AppA從復(fù)復(fù)合物上解離而釋放PpsR形成四聚體結(jié)合于特定DNA序列導(dǎo)致阻遏相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。如上所述，目前已有的廣泛用于生命科學(xué)領(lǐng)域的基因表達(dá)系統(tǒng)大多數(shù)采用化學(xué)誘導(dǎo)劑調(diào)控，雖然其誘導(dǎo)效果較好，背景低、表達(dá)強(qiáng)度高，但缺點(diǎn)是許多系統(tǒng)具有多效性因而副作用廣泛和有潛在的細(xì)胞毒性等。更為重要的是，化學(xué)誘導(dǎo)劑不能在空間上精確調(diào)控基因的表達(dá)；而物理方法調(diào)節(jié)基因表達(dá)的系統(tǒng)目前很少，雖能在空間上一定程度調(diào)控特定細(xì)胞或組織的基因表達(dá)，但細(xì)胞毒性強(qiáng)可能造成不可逆損傷或?qū)嶋H的操作困難。少數(shù)幾種基于光敏蛋白的基因表達(dá)系統(tǒng)，由于誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)水平低、需要加入外源化學(xué)物質(zhì)、轉(zhuǎn)錄因子由多種蛋白構(gòu)成其基因構(gòu)建物較大難以導(dǎo)入細(xì)胞等原因限制了其應(yīng)用。本申請(qǐng)人認(rèn)為可以通過(guò)新思路創(chuàng)造出一種新的，更優(yōu)秀的光調(diào)控轉(zhuǎn)錄表達(dá)系統(tǒng)。這個(gè)系統(tǒng)可以克服前人研究的缺陷，并可被廣泛用于生物醫(yī)藥科學(xué)與技術(shù)研究中。經(jīng)過(guò)潛心研究，本申請(qǐng)人發(fā)明了一種新型的光可控基因表達(dá)系統(tǒng)，它由重組光敏轉(zhuǎn)錄因子及其對(duì)應(yīng)的靶轉(zhuǎn)錄單元兩部分組成，具有良好的基因表達(dá)調(diào)控能力，可以在時(shí)間和空間上共同調(diào)控基因的表達(dá)。因此，本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種新型的光可控基因表達(dá)系統(tǒng)。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供用所述光可控基因表達(dá)系統(tǒng)調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞中基因表達(dá)的方法。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供含有所述光可控基因表達(dá)系統(tǒng)的真核表達(dá)載體。本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供裝有所述光可控基因表達(dá)系統(tǒng)各組分的試劑盒。發(fā)明概述
本發(fā)明涉及一種光可控基因表達(dá)系統(tǒng)，包括兩個(gè)部分a)重組光敏轉(zhuǎn)錄因子編碼基因，所述重組光敏轉(zhuǎn)錄因子包括作為DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的第一多肽、作為光敏結(jié)構(gòu)域的第二多肽和作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域的第三多肽；b)靶轉(zhuǎn)錄單元，包括識(shí)別/結(jié)合所述第一多肽的至少一個(gè)反應(yīng)元件、與之連接的啟動(dòng)子和待轉(zhuǎn)錄核酸序列。按照本發(fā)明的光可控基因表達(dá)系統(tǒng)，第一部分中重組光敏轉(zhuǎn)錄因子的第一多肽為DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域,它能夠特異性地識(shí)別反應(yīng)元件,單獨(dú)不能夠結(jié)合到反應(yīng)元件上或者是結(jié)合能力很弱，需要第二多肽來(lái)輔助其結(jié)合到反應(yīng)元件。第一多肽可選自螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、鋅指基序或鋅簇DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、亮氨酸拉鏈DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、翼狀螺旋DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、翼狀螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋、螺旋-環(huán)-螺旋DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、高遷移率族DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、B3 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。第二多肽為光敏結(jié)構(gòu)域，通常來(lái)自以黃素類為生色團(tuán)的光敏蛋白；第三多肽為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，包括轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄阻遏結(jié)構(gòu)域。第一多肽、第二多肽和第三多肽之間可以直接連接，也可操作性地通過(guò)接頭肽連接。接頭肽的氨基酸個(gè)數(shù)是可變的(如0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10個(gè)或更多)。第一多肽、第二多肽可構(gòu)成一種光可控的DNA結(jié)合蛋白融合蛋白(簡(jiǎn)稱為光可控DNA結(jié)合蛋白)，可以用于體外研究重組光敏轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合特點(diǎn)。本發(fā)明的光可控基因表達(dá)系統(tǒng)中，第二部分靶轉(zhuǎn)錄單元中的反應(yīng)元件、啟動(dòng)子和待轉(zhuǎn)錄核酸序列之間也可直接連接，或操作性連接。按照本發(fā)明的光可控基因表達(dá)系統(tǒng)，第一部分中的重組光敏轉(zhuǎn)錄因子還可進(jìn)一步包含附加的多肽，如促進(jìn)重組光敏轉(zhuǎn)錄因子融合蛋白向細(xì)胞核運(yùn)輸?shù)牡谒亩嚯?即細(xì)胞核定位信號(hào)肽)。第四多肽與第一、第二、第三多肽可直接連接或通過(guò)接頭肽連接。本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明的光可控基因表達(dá)系統(tǒng)的真核表達(dá)載體。所述表達(dá)載體可以是單獨(dú)含有重組光敏轉(zhuǎn)錄因子編碼基因的載體，也可以是單獨(dú)含有靶轉(zhuǎn)錄單元的真核表達(dá)載體，所述祀轉(zhuǎn)錄單元中含有反應(yīng)元件-啟動(dòng)子但待轉(zhuǎn)錄核酸序列空缺?；蛘?也可以是同時(shí)含有重組光敏轉(zhuǎn)錄因子編碼基因和靶轉(zhuǎn)錄單元中的反應(yīng)元件-啟動(dòng)子的真核表達(dá)載體。本發(fā)明也涉及用本發(fā)明的光可控基因表達(dá)系統(tǒng)在宿主細(xì)胞中調(diào)控基因表達(dá)的方法，包括以下步驟a)將所述光可控基因表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建在真核質(zhì)粒表達(dá)載體中；b)引入含被調(diào)控基因的宿主細(xì)胞；和c)光照誘導(dǎo)所述宿主細(xì)胞，使所述宿主細(xì)胞中的被調(diào)控的核苷酸進(jìn)行表達(dá)。本發(fā)明的在宿主細(xì)胞中調(diào)控基因表達(dá)的方法，所涉及的光照方法，包括光源的選擇和光源的控制。光源非限制地包括LED燈、白熾燈、熒光燈、激光；光照方法包括光照量、光照時(shí)間、光照強(qiáng)度及光照頻率的選定。用掃描、投影、光模具等方法在空間上控制目的基因的表達(dá)也包含在本發(fā)明范圍中。本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種試劑盒，該試劑盒裝有含本發(fā)明光可控基因表達(dá)系統(tǒng)的真核表達(dá)載體或/和轉(zhuǎn)染了所述轉(zhuǎn)錄因子的真核表達(dá)載體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，及相應(yīng)的說(shuō)明書(shū)。本發(fā)明的試劑盒還可裝有含反應(yīng)元件-啟動(dòng)子、但待轉(zhuǎn)錄核酸序列空缺的靶轉(zhuǎn)錄單元的真核表達(dá)載體。發(fā)明詳述本發(fā)明提供一種基于光敏多肽的、光可控基因表達(dá)系統(tǒng)，用于在時(shí)間和空間上調(diào)節(jié)目的基因在真核生物宿主細(xì)胞中的表達(dá)。本發(fā)明的光可控基因表達(dá)系統(tǒng)涉及至少兩個(gè)部分第一部分是能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)的重組光敏轉(zhuǎn)錄因子融合蛋白的編碼核苷酸序列，該融合蛋白由三個(gè)或四個(gè)多肽組成，其中第一多肽是其DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，第二多肽為光 敏結(jié)構(gòu)域，第三多肽為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，第四多肽為核定位信號(hào)片段；第二部分是由反應(yīng)元件-啟動(dòng)子-待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列組成的祀轉(zhuǎn)錄單元核苷酸序列，其中的反應(yīng)元件為上述重組光敏轉(zhuǎn)錄因子融合蛋白第一多肽所識(shí)別/結(jié)合的DNA核苷酸基序，啟動(dòng)子通常為最小啟動(dòng)子，也可以是其他完整的啟動(dòng)子。第一部分的三個(gè)或四個(gè)多肽優(yōu)選采用有關(guān)蛋白的截短的功能活性片段(即結(jié)構(gòu)域)。可通過(guò)基因工程技術(shù)將本發(fā)明的光可控基因表達(dá)系統(tǒng)的第一部分和第二部分構(gòu)建在一個(gè)真核表達(dá)載體中或分別構(gòu)建在二個(gè)真核表達(dá)載體中。針對(duì)特定的宿主細(xì)胞類型采用不同的常規(guī)方法將其導(dǎo)入宿主細(xì)胞，使之表達(dá)本發(fā)明的重組光敏轉(zhuǎn)錄因子融合蛋白，用適當(dāng)波長(zhǎng)的光照射可導(dǎo)致其第二光敏多肽二聚化能力改變，使重組光敏轉(zhuǎn)錄因子的二聚化能力發(fā)生變化，二聚化的轉(zhuǎn)錄因子可結(jié)合于本發(fā)明第二部分靶轉(zhuǎn)錄單元核苷酸序列中的反應(yīng)元件，并通過(guò)該融合蛋白的第三多肽的轉(zhuǎn)錄激活/阻遏結(jié)構(gòu)域和募集的宿主細(xì)胞本身的其它轉(zhuǎn)錄輔因子，一起協(xié)同作用于該靶轉(zhuǎn)錄單元中的啟動(dòng)子，從而調(diào)節(jié)(啟動(dòng)或阻遏)目的基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。本發(fā)明提供的這種光可控基因表達(dá)系統(tǒng)，可利用幾乎不會(huì)損傷細(xì)胞或機(jī)體的光照射，在時(shí)間上和空間上調(diào)節(jié)目的蛋白基因在真核宿主細(xì)胞中的表達(dá)。本發(fā)明的這種光可控基因表達(dá)系統(tǒng)，可利用不同的光源和光照條件在空間上調(diào)節(jié)目的蛋白基因在真核宿主細(xì)胞中的表達(dá)。所用的光廉價(jià)、易于獲得、對(duì)細(xì)胞沒(méi)有毒性。本文所用術(shù)語(yǔ)的定義和解釋“光可控”，“光敏”和“光誘導(dǎo)”的蛋白在本文中含義相同，可互換使用，指對(duì)光照敏感的、可用相應(yīng)波長(zhǎng)的光以不同強(qiáng)度或不同頻率照射，調(diào)節(jié)該蛋白的構(gòu)象或構(gòu)型從而影響其活性，包括激活、增強(qiáng)或阻遏其活性?！八拗鳌敝刚婧松?，包括單細(xì)胞真核生物如酵母菌，和多細(xì)胞真核生物，如植物和動(dòng)物，尤其是哺乳動(dòng)物，包括人?！八拗骷?xì)胞”指構(gòu)成真核生物組織的細(xì)胞和已建立的真核生物細(xì)胞系，只要這些細(xì)胞或細(xì)胞系與待表達(dá)的目的蛋白質(zhì)、所用的篩選體系或發(fā)酵培養(yǎng)體系相容。包括單細(xì)胞真核生物細(xì)胞，如培養(yǎng)的BY4741和AH109釀酒酵母菌細(xì)胞、裂殖酵母菌、P. pastoris酵母菌、乳酸克雷伯氏菌、H. polymorpha菌(其綜述見(jiàn)Fleer等人Curr Opin Biotechnol,1992.3(5) :486-496和真菌細(xì)胞。已建立的可體外傳代培養(yǎng)永生不死的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，其非限制性的例子包括人胚腎上皮細(xì)胞(HEK293)、非洲綠猴腎成纖維細(xì)胞C0S-7、人宮頸癌細(xì)胞(Hela)、小鼠成纖維細(xì)胞(NIH 3T3)等。宿主細(xì)胞也包括正常細(xì)胞，如出于基因治療目的離體轉(zhuǎn)基因或同源重組的動(dòng)物胚胎細(xì)胞，對(duì)基因治療目的有特殊價(jià)值的細(xì)胞類型，包括造血干細(xì)胞、成骨細(xì)胞、肝細(xì)胞、白細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞和皮膚上皮及氣管上皮細(xì)胞；離體轉(zhuǎn)基因或同源重組的動(dòng)物胚胎干細(xì)胞和受精卵細(xì)胞。。宿主細(xì)胞還包括非哺乳動(dòng)物的真核細(xì)胞，如昆蟲(chóng)(例如Sp. frugiperda)細(xì)胞，和植物細(xì)胞，如；轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。所謂轉(zhuǎn)基因細(xì)胞包括轉(zhuǎn)入了本發(fā)明重組光敏轉(zhuǎn)錄因子基因和/或含目的蛋白基因的靶轉(zhuǎn)錄單元的細(xì)胞，本發(fā)明的重組光敏轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)可控的光照射能很好地調(diào)節(jié)目的基因在這些細(xì)胞中的表達(dá)。在昆蟲(chóng)細(xì)胞中的表達(dá)可采用桿狀病毒表達(dá)載體(見(jiàn)例如0' Reilly等人(1992)《桿狀病毒表達(dá)載體實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》，Stockton出版社)，可用的桿狀病毒載體包括pAc系列(Smith，G. E.，M. D. Summers，和 M. J. Fraser，Mol Cell Biol, 1983. 3(12) :2156-2165)和 pVL 系列((Luckow, V. A.和 M. D. Summers, Virology, 1989. 170 (I) :31-39)。
“目的蛋白”也可稱為“感興趣蛋白”指任何有用的蛋白，例如可用于預(yù)防或治療目的或其他用途的、需要在真核宿主細(xì)胞中表達(dá)的有用真核生物蛋白質(zhì)，包括天然的或人工修飾或突變的有用蛋白質(zhì)，特別是必須經(jīng)翻譯后修飾(如糖基化、酰胺化等修飾)才有活性的蛋白質(zhì)，它們?cè)谡婧思?xì)胞中表達(dá)才能獲得這種修飾?！皥?bào)告蛋白”為目的蛋白的一種，指其表達(dá)容易被檢測(cè)的有用蛋白質(zhì)。為便于檢測(cè)本發(fā)明基于光敏多肽的、光可誘導(dǎo)的目的蛋白基因表達(dá)系統(tǒng)的效果，可以選擇以下已知的廣泛應(yīng)用的報(bào)告蛋白螢火蟲(chóng)熒光素酶(Flue)、綠色熒光蛋白(GFP)，氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、￠-半乳糖苷酶(LacZ)等。但本發(fā)明的光可誘導(dǎo)目的蛋白基因表達(dá)系統(tǒng)不限于表達(dá)報(bào)告蛋白，而可用于表達(dá)任何有用的目的蛋白。“基因”，蛋白質(zhì)的“編碼核苷酸序列”，“待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列”在本文中含義相同可互換使用，指天然或重組的攜帶蛋白質(zhì)氨基酸序列信息密碼子的DNA序列，也指編碼功能性RNA，如反義RNA的DNA序列?！澳康牡鞍谆颉?、“目的蛋白的編碼核苷酸序列”或簡(jiǎn)稱為“目的基因”在本文中含義相同，可互換使用，指編碼目的蛋白的基因，通常為脫氧核糖核酸DNA雙鏈序列。這種基因可包含在宿主細(xì)胞的染色體DNA序列中或包含在人工構(gòu)建的表達(dá)載體中，如本發(fā)明的靶轉(zhuǎn)錄單元序列中。同樣，“報(bào)告基因”指編碼報(bào)告蛋白的基因。“轉(zhuǎn)錄”在本文中專指真核生物宿主細(xì)胞中通過(guò)RNA聚合酶將目的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生攜帶該基因信息RNA的過(guò)程。真核生物基因的轉(zhuǎn)錄比原核生物復(fù)雜得多，真核生物的三類RNA聚合酶I、II和III分別轉(zhuǎn)錄三類真核基因DNA，產(chǎn)生三類RNA(rRNA、mRNA、tRNA)及反義RNA。文中的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄過(guò)程為RNA聚合酶II啟動(dòng)的轉(zhuǎn)錄，即DNA轉(zhuǎn)錄為mRNA?！稗D(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)”本文指真核基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)，包括啟動(dòng)或阻遏轉(zhuǎn)錄，增強(qiáng)或抑制轉(zhuǎn)錄，上調(diào)或下調(diào)轉(zhuǎn)錄?！氨磉_(dá)”、“目的蛋白基因表達(dá)”、“基因表達(dá)”在本文中含義相同可互換使用，指目的基因的DNA序列轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生攜帶該基因信息的RNA(mRNA或反義RNA)和該RNA攜帶的信息在核糖體中被翻譯產(chǎn)生目的蛋白二者，即轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生信息RNA和翻譯產(chǎn)生目的蛋白都叫做表達(dá)。本文包括這二種含義，主要指產(chǎn)生目的蛋白。“轉(zhuǎn)錄因子”或“轉(zhuǎn)錄因子融合蛋白”在本文中含義相同可互換使用，指真核生物的轉(zhuǎn)錄因子，它不是一個(gè)蛋白質(zhì)，而是多個(gè)相互作用的蛋白或多肽的統(tǒng)稱，可以是天然的或人工改造的或人為融合的，包括能識(shí)別/結(jié)合靶轉(zhuǎn)錄單元核苷酸序列中的反應(yīng)元件的多肽和能募集其它轉(zhuǎn)錄激活/阻遏輔因子的多肽，通過(guò)與靶轉(zhuǎn)錄單元中反應(yīng)元件的結(jié)合和相互作用，與募集的其它轉(zhuǎn)錄激活或阻遏輔因子一起作用于待轉(zhuǎn)錄核酸序列上游的啟動(dòng)子，從而啟動(dòng)并調(diào)節(jié)目的蛋白基因的轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄因子視其組成的不同可分為“轉(zhuǎn)錄激活因子”或“轉(zhuǎn)錄阻遏因子”，二者統(tǒng)稱“轉(zhuǎn)錄因子”。
“靶轉(zhuǎn)錄單元”指人造的由反應(yīng)元件、啟動(dòng)子和待轉(zhuǎn)錄核酸序列組成的DNA序列(不是蛋白質(zhì))，其中反應(yīng)元件通常位于啟動(dòng)子上游，有時(shí)也可位于啟動(dòng)子下游，待轉(zhuǎn)錄核酸序列位于反應(yīng)元件和啟動(dòng)子的下游，三者可直接相連或操作性(即可隔開(kāi)若干個(gè)核苷酸)相連?！胺磻?yīng)元件”指轉(zhuǎn)錄因子特異性識(shí)別/結(jié)合的一個(gè)或多個(gè)順式DNA基序，不同的轉(zhuǎn)錄因子有與其相對(duì)應(yīng)的不同的反應(yīng)元件，轉(zhuǎn)錄因子包含能與這種DNA基序結(jié)合的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子與其相對(duì)應(yīng)的反應(yīng)元件特異性結(jié)合后，轉(zhuǎn)錄因子的第三多肽募集的輔因子協(xié)同作用于啟動(dòng)子，激活或阻遏其下游目的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生相應(yīng)的RNA。在本發(fā)明中，反應(yīng)元件指能夠與重組光敏轉(zhuǎn)錄因子的第一多肽特異性識(shí)別/結(jié)合的DNA基序，例如Gal4的反應(yīng)元件為長(zhǎng)17bp的DNA基序(序列67)?！皢?dòng)子”指啟動(dòng)和導(dǎo)致其下游基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生RNA的DNA序列。啟動(dòng)子可以是天然基因的啟動(dòng)子或人工修飾的啟動(dòng)子。不同的啟動(dòng)子可指導(dǎo)基因在不同發(fā)育階段的不同類型的組織或細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄，或?qū)Σ煌h(huán)境或生理?xiàng)l件反應(yīng)時(shí)的基因表達(dá)。啟動(dòng)子通常可分為“組成型啟動(dòng)子”、“可誘導(dǎo)啟動(dòng)子”或“可調(diào)控啟動(dòng)子”；按組織和細(xì)胞劃分可分為“細(xì)胞特異性啟動(dòng)子”、“組織特異性啟動(dòng)子”、“發(fā)育特異性啟動(dòng)子”或“細(xì)胞分化特異性啟動(dòng)子”?？杀磉_(dá)的天然細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白基因上游都有與其相配的啟動(dòng)子，不同的基因DNA片段可以有相同的啟動(dòng)子。可用于表達(dá)本發(fā)明重組光敏轉(zhuǎn)錄因子的常用組成型啟動(dòng)子的非限制性例子有來(lái)源于多瘤病毒、腺病毒2、巨細(xì)胞病毒CMV和猿病毒40 (SV40)的啟動(dòng)子。可用于表達(dá)本發(fā)明重組光敏轉(zhuǎn)錄因子的組織特異性啟動(dòng)子的非限制例子還包括清蛋白啟動(dòng)子(肝特異性，Pinkert, C. A.等，Genes Dev, 1987. 1(3) :268-276),淋巴特異性啟動(dòng)子(Calame,K.和 S. Eaton, Adv Immunol, 1988. 43 :235-275.)，特別是 T 細(xì)胞受體的啟動(dòng)子(ffinoto,A.和 D. Baltimore, EMBO J, 1989. 8(3) :729-733)和免疫球蛋白的啟動(dòng)子(Banerji, J.，L. Olson，和 W. Schaffner，Cell, 1983. 33(3) :729-740. ；Queen, C.和 D. Baltimore, Cell,1983. 33(3) :741-748)。神經(jīng)元特異性啟動(dòng)子(例如，神經(jīng)纖維啟動(dòng)子，Talbott, R. L.，etal. , Proc Natl Acad Sci U S A, 1989. 86(15) :5743-5747)，胰特異性啟動(dòng)子(Edlund,T.等.，Science, 1985. 230(4728) :912-916)和哺乳動(dòng)物腺特異性啟動(dòng)子(例如，牛乳乳清啟動(dòng)子，美國(guó)專利4873316號(hào))。發(fā)育調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子也包括在內(nèi)，例如鼠hox啟動(dòng)子(Kessel，M.和 P. Gruss, Science, 1990. 249(4967) :374-379)和 a -胎蛋白啟動(dòng)子(Camper, S. A.和 S. M. Tilghman, Genes Dev, 1989. 3 (4) :537-546)。多數(shù)真核基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游大約-25于-30位核苷酸處有富含AT的區(qū)域稱為TATA盒，本文稱為“最小啟動(dòng)子”，它確定了目的基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，但本身不足以有效地啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄。在TATA盒上游還有其它轉(zhuǎn)錄必須的核苷酸基序，即本文所述的轉(zhuǎn)錄因子其特異性識(shí)別/結(jié)合的反應(yīng)元件，該反應(yīng)元件被其相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合后向最小啟動(dòng)子傳達(dá)反應(yīng)性，并在轉(zhuǎn)錄因子募集的輔因子協(xié)同作用下激活最小啟動(dòng)子引起下游目的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生相應(yīng)的RNA。
“載體”、“表達(dá)載體”、“基因表達(dá)載體”、“重組基因表達(dá)載體”或“質(zhì)粒”在本文中含義相同可互換使用，指能在真核細(xì)胞中表達(dá)重組目的蛋白的載體，這種真核表達(dá)載體可以是人工構(gòu)建的質(zhì)?；蛑亟M病毒載體“轉(zhuǎn)染”指宿主細(xì)胞經(jīng)物理或化學(xué)方法，如電穿孔、磷酸鈣共沉淀、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺或DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、DNA粒子轟擊和顯微注射等處理，使細(xì)胞攝入外源加入的攜帶基因的表達(dá)載體，或通過(guò)生物學(xué)媒介，如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、受體介導(dǎo)的DNA攝取等將攜帶基因的表達(dá)載體 遞送入宿主細(xì)胞中。這些載體進(jìn)入宿主細(xì)胞后可作為游離體形式存在于胞質(zhì)中，或整合入細(xì)胞染色體中，在適當(dāng)條件下該細(xì)胞可瞬時(shí)表達(dá)或長(zhǎng)期表達(dá)載體所攜帶的基因編碼的蛋白質(zhì)或功能性RNA。這種宿主細(xì)胞就叫做被載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。用表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的方法可參見(jiàn)Sambrooka等人(分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，第二版，冷泉港出版社(1989))，和其它有關(guān)教材。本發(fā)明基于光敏多肽的、光可控基因表達(dá)系統(tǒng)第一部分的重組光敏轉(zhuǎn)錄因子是由三種或四種功能性多肽片段直接通過(guò)肽鍵串聯(lián)連接或通過(guò)接頭肽串聯(lián)連接形成的融合蛋白。在適當(dāng)波長(zhǎng)的光照射下，該融合蛋白能結(jié)合于本發(fā)明第二部分靶轉(zhuǎn)錄單元核苷酸序列的反應(yīng)元件，并通過(guò)其轉(zhuǎn)錄激活/阻遏結(jié)構(gòu)域和募集宿主細(xì)胞本身的轉(zhuǎn)錄輔因子，一起協(xié)同作用于靶轉(zhuǎn)錄單元中的啟動(dòng)子，從而啟動(dòng)或阻遏靶轉(zhuǎn)錄單元中目的蛋白基因的表達(dá)。本文中，“重組光敏轉(zhuǎn)錄因子融合蛋白”與“重組光敏轉(zhuǎn)錄因子”含義相同，可互換使用。本發(fā)明的重組光敏轉(zhuǎn)錄因子含有第一多肽，該多肽雖能特異性識(shí)別所述靶轉(zhuǎn)錄單元核苷酸序列中的反應(yīng)元件但不能與其結(jié)合或結(jié)合能力弱，只有在第二多肽的協(xié)助下轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生同質(zhì)二聚化后第一多肽方能結(jié)合反應(yīng)元件；第一多肽選自螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、鋅指基序或鋅簇DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、亮氨酸拉鏈DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、翼狀螺旋DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、翼狀螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、螺旋-環(huán)-螺旋DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、高遷移率族DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、B3 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。分析相關(guān)文獻(xiàn)，可用作本發(fā)明的第一多肽優(yōu)選包括但不限于Gal4蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、LexA蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、Lac阻遏蛋白LacI的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、\噬菌體cl阻遏蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、四環(huán)素阻遏蛋白TetR的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、色氨酸阻遏蛋白TrpR的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域等，更優(yōu)選Gal4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和LexA的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。Gal4是釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)的轉(zhuǎn)錄激活蛋白，能識(shí)別/結(jié)合基因啟動(dòng)子的上游反應(yīng)元件-UAStj基序(序列67)。Gal4的N末端第1-94位氨基酸為DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，此DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域是一種鋅簇DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中第1-65位氨基酸用于DNA特異性識(shí)別，第66-94位氨基酸用于二聚化，Gal4需形成同質(zhì)二聚體才能結(jié)合反應(yīng)元件發(fā)揮其作用[Marmorstein, R.等.，Nature, 1992. 356 (6368)408-411]?；贕al4/UAS的雙雜交系統(tǒng)是用于研究基因表達(dá)的一種有效工具。例如，普洛麥格公司(Promega)公司生產(chǎn)的哺乳動(dòng)物雙雜交系統(tǒng)(CheckMate Mammalian Two-HybridSystem)就采用了此Gal4/UAS系統(tǒng)。LexA蛋白是存在于大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的一種轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白，能調(diào)控20多種基因的轉(zhuǎn)錄，它二聚化后能識(shí)別/結(jié)合基因啟動(dòng)子上游的反應(yīng)元件(序列68)回文結(jié)構(gòu)阻止RNA聚合酶對(duì)后面基因的轉(zhuǎn)錄。LexA含有202個(gè)氨基酸，其DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域是一種翼狀螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中第1-87位氨基酸用于DNA特異性識(shí)別，第88-202位氨基酸用于二聚化，只有二聚化的LexA才能特異性結(jié)合相應(yīng)的反應(yīng)元件，單體LexA則不能。正常情況下細(xì)胞內(nèi)存在的LexA是二聚體形式，當(dāng)細(xì)胞受到內(nèi)部或外部SOS信號(hào)刺激時(shí)，二聚化的LexA被體內(nèi)某些酶切斷分開(kāi)并從DNA上解離，使得原來(lái)被LexA 阻遏的基因激活[Fogh，R.H.等,EMBO J, 1994. 13 (17)，3936-3944]。基于 LexA 的雙雜交系統(tǒng)也被用于研究基因表達(dá)與蛋白質(zhì)相互作用。例如，Clontech公司生產(chǎn)的酵母雙雜交系統(tǒng)(MATCHMAKER LexA Two-Hybrid System)就是基于此系統(tǒng)。Lac阻遏蛋白LacI能特異性識(shí)別/結(jié)合大腸桿菌乳糖系統(tǒng)操縱子而調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。LacI的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域是一種螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中第1-62位氨基酸用于DNA的特異性識(shí)別，其特異性識(shí)別/結(jié)合的DNA保守序列見(jiàn)序列69，只有二聚化或者四聚化的LacI才能與之結(jié)合，單體 LacI 蛋白幾乎不能結(jié)合[Lewis, M.等，Science, 1996. 271 (5253)，1247-1254]。 Cl蛋白是\噬菌體Cl基因編碼的一種轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白，它可以阻止\左、右兩個(gè)早期起動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致不能進(jìn)行復(fù)制及細(xì)胞分裂的蛋白。Cl蛋白含有236個(gè)氨基酸，其DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域一種螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，第1-102位氨基酸用于DNA特異性識(shí)別，第132-236位氨基酸用二聚化，只有二聚化的Cl才能特異性結(jié)合相應(yīng)的反應(yīng)元件。Cl蛋白同質(zhì)二聚體識(shí)別/結(jié)合匕和Pk兩個(gè)操縱子序列上，每個(gè)操縱子各含有Cl三個(gè)識(shí)別結(jié)合位點(diǎn)，分為Pl的OLU 0L2和0L3以及Pe的ORU 0R2和0R3。cl與ORl的結(jié)合能力相對(duì)強(qiáng)些，ORl的保守DNA序列見(jiàn)序列71,單體cl蛋白幾乎無(wú)這種結(jié)合能力[Burz, D. S. , Beckett, D.,Benson, N.，和 Ackers, G. K.，Biochemistry, 1994. 33 (28)，8399-8405, Hu, J. C. , 0' Shea,E. K.，Kim, P. S.和 Sauer, R. T.，Science, 1990. 250 (4986)，1400-1403]。四環(huán)素阻遏蛋白(TetR)是存在于很多革蘭陰性菌中的一種轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)結(jié)合特定DNA基序阻遏相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。TetR蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域是一種螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，單體TetR蛋白可形成同質(zhì)二聚體而識(shí)別/結(jié)合含有特定DNA序列(序列70)的操縱子上，單體TetR幾乎無(wú)結(jié)合能力[Wissmann, A 等 ，EMBO J, 1991. 10 (13)，4145-4152，Ramos, J. L.等 ，Microbiol Mol BiolRev,2005. 69(2),326-356] 在本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施方式中，第一多肽為Gal4蛋白DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(其核酸和蛋白質(zhì)序列分別為序列I和序列2)的1-65位氨基酸，即其DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的截短體，其單獨(dú)不能結(jié)合反應(yīng)元件。在本發(fā)明另一優(yōu)選實(shí)施方式中，第一多肽為L(zhǎng)exA蛋白DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(其核酸和蛋白質(zhì)序列分別為序列5和序列6)的1-87位氨基酸，即其DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的截短體，其單獨(dú)不能結(jié)合反應(yīng)元件。在本發(fā)明另一優(yōu)選實(shí)施方式中，第一多肽為L(zhǎng)acI蛋白DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(其核酸和蛋白質(zhì)序列分別為序列9和序列10)的1-62位氨基酸，即其DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的截短體，其單獨(dú)也不能結(jié)合反應(yīng)元件。在本發(fā)明另一優(yōu)選實(shí)施方式中，第一多肽為TetR蛋白DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(其核酸和蛋白質(zhì)序列分別為序列13和序列14)的1_63位氨基酸，即其DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的截短體，其單獨(dú)也不能結(jié)合反應(yīng)元件。在本發(fā)明另一優(yōu)選實(shí)施方式中，第一多肽為Cl蛋白DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(其核酸和蛋白質(zhì)序列分別為序列17和序列18)的1-102位氨基酸，即其DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的截短體，其單獨(dú)也不能結(jié)合反應(yīng)元件。本發(fā)明重組光敏轉(zhuǎn)錄因子融合蛋白中的第二多肽是光敏多肽，該多肽來(lái)自以黃素類(FMN或FAD)為生色團(tuán)的光敏結(jié)構(gòu)域。如含有光-氧-電壓(LOV)結(jié)構(gòu)域的光敏蛋白；類似光裂解酶的隱花色素(photolyase-like cryptochromes);利用？六0的藍(lán)光蛋白(bluelight using FAD,BLUF)。優(yōu)選含LOV結(jié)構(gòu)域的光敏蛋白，經(jīng)適當(dāng)波長(zhǎng)光照射后,第二多肽的二聚化能力發(fā)生改變，使轉(zhuǎn)錄因子的二聚化能力發(fā)生變化，二聚化的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合于相對(duì)應(yīng)的反應(yīng)元件，從而調(diào)節(jié)目的基因的表達(dá)水平。本發(fā)明包括但不限于以下所述的幾種優(yōu)選光敏蛋白或其功能活性截短體。本發(fā)明第一個(gè)優(yōu)選的第二多肽是粗糙鏈孢霉菌的VIVID蛋白的光敏結(jié)構(gòu)域及其突變體。VIVID是存在于粗糙鏈孢霉菌(Neurospora crassa)細(xì)胞內(nèi)參與藍(lán)光調(diào)控細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路的一種光敏蛋白質(zhì)。在藍(lán)光照射下它能與黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD，F(xiàn)lavinAdenine Dinucleotide)發(fā)生蛋白分子間反應(yīng)形成二聚體。全長(zhǎng)VIVID蛋白含有186個(gè)氨基酸，只含一個(gè)對(duì)光敏感的LOV結(jié)構(gòu)域。研究表明VIVID蛋白缺失了 N端36個(gè)氨基酸的截短體蛋白(VIVID-36)穩(wěn)定性比全長(zhǎng)蛋白更好，而藍(lán)光照射后形成的VIVID-36 二聚體不光照恢復(fù)其單體形式的半衰期為18000s，含點(diǎn)突變C71V的VIVID-36 二聚化能力更強(qiáng)。在本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施方式中，第二多肽是含一個(gè)點(diǎn)突變的刪除前1-36個(gè)氨基酸的 VIVID (C71V)、VIVID (N56K)、VIVID (Y50W)突變蛋白(核酸序列分別為23、25、29，氨基酸序列分別為24、26、30)。在本發(fā)明一個(gè)更優(yōu)選實(shí)施方式中，第二多肽是含二個(gè)點(diǎn)突變的刪除前1-36個(gè)氨基酸VIVID(N56K+C71V)突變蛋白(其核酸和蛋白質(zhì)序列分別為序列27和序列 28)。本發(fā)明第二個(gè)優(yōu)選的第二多肽是燕麥(Avena sativa)光敏色素I基因的L0V2結(jié)構(gòu)域(簡(jiǎn)寫為 AsL0V2) [Peter, E.，B. Dick, and S. A. Baeurle, Nat Commun, 2010. 1(8)122]。燕麥細(xì)胞光敏色素I的N端為L(zhǎng)OVl和L0V2光氧電壓(LOV)結(jié)構(gòu)域，在藍(lán)光照射下均能與黃素單核苷酸(flavin mononucleotide,FMN)結(jié)合生成一種加成產(chǎn)物。本發(fā)明將燕麥光敏色素I的L0V2結(jié)構(gòu)域連接于第一多肽，成功導(dǎo)致可用光照調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的第一多肽與對(duì)相應(yīng)的反應(yīng)元件的結(jié)合能力。本發(fā)明含有AsL0V2(其核酸和蛋白質(zhì)序列分別為序列41和序列42)第二多肽的轉(zhuǎn)錄因子GALP在黑暗時(shí)可以結(jié)合其對(duì)應(yīng)的反應(yīng)元件導(dǎo)致目的基因表達(dá)，而在光照下這種結(jié)合減弱導(dǎo)致目的基因表達(dá)水平下調(diào)。本發(fā)明第三個(gè)優(yōu)選的第二多肽是無(wú)隔藻(Stramenopile algae Vaucheriafrigida)金色素I (aureochromel)蛋白C端的LOV結(jié)構(gòu)域(簡(jiǎn)寫為AuLOV,其核酸和蛋白質(zhì)序列分別為序列45和序列46) [Takahashi, F.等，Proc Natl Acad Sci USA,2007. 104(49) :19625-19630]。本發(fā)明含有AuLOV第二多肽的重組轉(zhuǎn)錄因子GAAP光照后二聚化能力增強(qiáng)使目的基因的表達(dá)水平上調(diào)。以上所述的第二光敏多肽中，VIVID和AuLOV用適當(dāng)波長(zhǎng)光照射可使由其構(gòu)成的重組光敏轉(zhuǎn)錄因子二聚化增強(qiáng)，導(dǎo)致結(jié)合反應(yīng)元件而啟動(dòng)或上調(diào)轉(zhuǎn)錄；而AsL0V2構(gòu)成的重組光敏轉(zhuǎn)錄因子，在黑暗時(shí)二聚化而結(jié)合反應(yīng)元件，光照反使其解二聚成為單體減弱與反應(yīng)元件的結(jié)合或不再結(jié)合，從而阻遏或下調(diào)轉(zhuǎn)錄。對(duì)來(lái)自光敏蛋白的6種不同的LOV結(jié)構(gòu)域進(jìn)行用Accelry Discovery Studio 2.1進(jìn)行同源性分析，這幾種LOV結(jié)構(gòu)域分別來(lái)自VIVID (Nc_VVD)、白領(lǐng)-I (Nc_ffcl)、FKFl (At_FKFI)、金色素 I (Vf_Aureol_L0V)、燕麥向光素 I (As_phot_L0Vl 和 As_phot_L0V2)。結(jié)果顯示，這幾種蛋白完全相同的氨基酸約為15%，具有相似性的序列約為36% (圖47)。第一多肽和第二多肽可構(gòu)成一種光可控的DNA結(jié)合蛋白融合蛋白(簡(jiǎn)稱為DNA結(jié)合蛋白)。光可控的DNA結(jié)合蛋白可用于研究本發(fā)明各種重組光敏轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合能力，尤其是在體外研究重組光敏轉(zhuǎn)錄因子的第一多肽和第二多肽構(gòu)成的完整的具有DNA結(jié)合能力的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域及其結(jié)合特性的分析，例如結(jié)合常數(shù)、由二聚化恢復(fù)成單體的動(dòng)力學(xué)等，優(yōu)選出的DNA結(jié)合蛋白與第三多肽連接即可構(gòu)成轉(zhuǎn)錄因子。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，光可控的DNA結(jié)合蛋白的第一多肽是Gal4 (1-65)，第二多肽是野生型VIVID-36，組成的融合蛋白Gal4-VIVID (WT)(簡(jiǎn)稱為GAV (WT)，其核酸和氨基酸序列84和序列85)與VIVID蛋白的光譜性質(zhì)相似、且DNA結(jié)合能力受光調(diào)控，光照前后DNA結(jié)合水平具有明顯差異，即高濃度水平時(shí)黑暗狀態(tài)的融合蛋白能結(jié)合探針、但結(jié)合能力弱；光照后在所用到的蛋白濃度范圍內(nèi)對(duì)探針都具有結(jié)合能力。本發(fā)明的重組光敏轉(zhuǎn)錄因子含有第三多肽，該多肽是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，可以是轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)激活域(簡(jiǎn)寫為AD)或轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)阻遏域。可用作本發(fā)明第三多肽的轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)激活域或轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)阻遏域包括但不限于富含酸性氨基酸的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(如VP16和Gal4的AD)、富含脯氨酸的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(如CTF/NF1的氨基酸殘基399-499)、富含絲氨酸/蘇氨酸的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(如ITFl的氨基酸殘基1-427)和富含谷氨酰胺的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(Octl的氨基酸殘基175-269)，Seipel等公開(kāi)了它們的氨基酸序列和其他有 用的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域[Seipel, K.，Georgiev, 0.和 Schaffner, ff.，EMBO J, 1992. 11(13)，4961-4968(1992)]。還有已報(bào)導(dǎo)了的Kruppel相關(guān)盒(KRAB)轉(zhuǎn)錄阻遏結(jié)構(gòu)域[Peng，H.等，J Biol Chem, 2000. 275(24) :18000-18010]的序列。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，第三多肽為VP16轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(簡(jiǎn)寫為VP16，其核酸和蛋白質(zhì)序列分別為序列51和序列52)、Gal4轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(簡(jiǎn)寫為Gal4AD，其核酸和蛋白質(zhì)序列分別為序列53和序列54))、通用控制蛋白(Gcn4)的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(其核苷酸和蛋白質(zhì)序列分別為序列95和序列96)、NF- K B p65轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(簡(jiǎn)寫為p65AD，其核酸和蛋白質(zhì)序列分別為序列49和序列50))，或鋅指蛋白354A的KRAB轉(zhuǎn)錄阻遏結(jié)構(gòu)域(其核酸和蛋白質(zhì)序列分別為序列55和序列56)。NF-k B的二類亞基常形成同質(zhì)或異質(zhì)二聚體，最常見(jiàn)p65/p50或p65/p65 二聚體，p65亞基的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域已被廣泛應(yīng)用于構(gòu)建誘導(dǎo)基因表達(dá)的各種系統(tǒng)效果良好[Wang，Y.等，Gene Ther, 1997. 4 (5), 432-441] 0Gal4蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(AD)位于其C-末端768-881位，在這114個(gè)氨基酸中有很多酸性氨基酸，能招募釀酒酵母細(xì)胞中的其他轉(zhuǎn)錄輔助蛋白一起激活啟動(dòng)子導(dǎo)致相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[Shimizu-Sato, S.，Huq, E.，Tepperman, J. M.,和 Quail, P. H.，NatBiotechnol,2002. 20 (10)，1041-1044]。酵母Gcn4的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域主要位于Gcn4蛋白的N-末端第1-144位氨基酸，它可以招募釀酒酵母細(xì)胞中的其他轉(zhuǎn)錄輔助蛋白一起激活啟動(dòng)子導(dǎo)致相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[Drysdale,C. M.等.，Mol Cell Biol, 1995. 15(3) :1220-1233] VP16 為單純皰疹病毒HSV-I的UL48結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的含490個(gè)氨基酸殘基的病毒間層蛋白，其羧基端富含酸性氨基酸殘基為轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。VP16的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域已成功用于多種基因表達(dá)系統(tǒng)中效果良好[Gossen，M.和 H. Bujard 等，Proc Natl Acad Sci U S A, 1992. 89(12)5547-5551]。在本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施方式中，第三多肽采用VP16的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明另一優(yōu)選實(shí)施方式中，第三多肽采用NF-k B p65轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明另一優(yōu)選實(shí)施方式中，第三多肽采用鋅指蛋白354A的KRAB轉(zhuǎn)錄阻遏結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明另一優(yōu)選實(shí)施方式中，第三多肽采用Gal4轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明另一優(yōu)選實(shí)施方式中，第三多肽采用Gcn4轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的重組光敏轉(zhuǎn)錄因子融合蛋白還可包括第四多肽，該多肽是核定位信號(hào)肽用以促進(jìn)融合蛋白向細(xì)胞核運(yùn)輸。如果第一、第二和第三多肽不含核定位信號(hào)(NLS)時(shí)，可融合加入第四多肽。核定位信號(hào)肽典型地包括一段堿性氨基酸。本發(fā)明優(yōu)選的核定位信號(hào)肽為猿猴空泡病毒40核定位信號(hào)肽(SV40NLS) [Fanara, P.，等.，J Biol Chem,2000. 275(28) :21218-21223.]。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組光敏轉(zhuǎn)錄因子第一多肽為含有核定位信號(hào)的Gal4蛋白，故融合蛋白不含第四多肽。在另一個(gè)具體的方案中，第四多肽與第一、第二、第三多肽直接或通過(guò)接頭相連。如上面所述，本發(fā)明的重組光敏轉(zhuǎn)錄因子所含的三種或四種多肽各自可以有多種選擇，將三種或四種多肽連接成融合蛋白又可以有多種組合選擇，本發(fā)明優(yōu)選具有良好活性的各多肽的功能結(jié)構(gòu)域片段制備重組光敏轉(zhuǎn)錄因子融合蛋白，通過(guò)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞和酵母細(xì)胞中表達(dá)優(yōu)選的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)能力強(qiáng)的，即光照和黑暗時(shí)導(dǎo)致目的基因表達(dá)量差異大的該重組光敏轉(zhuǎn)錄因子，用于調(diào)節(jié)待轉(zhuǎn)錄核酸序列的表達(dá)，但不論如何何種選擇與組合，只要能實(shí)現(xiàn)本發(fā)明所設(shè)想的光調(diào)控基因表達(dá)性能的的重組光敏轉(zhuǎn)錄因子各種組合都屬于本發(fā)明的范圍。本發(fā)明基于光敏多肽的、光可控基因表達(dá)系統(tǒng)的第二部分是由轉(zhuǎn)錄因子特異性識(shí)別/結(jié)合的反應(yīng)元件-啟動(dòng)子-待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列組成的祀轉(zhuǎn)錄單元(核苷酸序列)，具體來(lái)說(shuō)，其中反應(yīng)元件的核苷酸基序視本發(fā)明不同實(shí)施方式所選的重組光敏轉(zhuǎn)錄因子融合蛋白的第一多肽不同而不同。換句語(yǔ)說(shuō)，反應(yīng)元件是第一多肽的特異性反應(yīng)元件，必須根據(jù)所選擇的第一多肽來(lái)選擇與其相對(duì)應(yīng)的反應(yīng)元件。例如，第一多肽為Gal4蛋白的DNA識(shí)別/結(jié)合結(jié)構(gòu)域時(shí)，其相對(duì)應(yīng)的反應(yīng)元件應(yīng)為“序列67”基序；第一多肽為L(zhǎng)exA蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域時(shí)，其相對(duì)應(yīng)的反應(yīng)元件應(yīng)為“序列68”基序；第一多肽為L(zhǎng)acI蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域時(shí)，其相對(duì)應(yīng)的反應(yīng)元件應(yīng)為“序列69”基序；第一多肽為TetR蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域時(shí)，其相對(duì)應(yīng)的反應(yīng)元件應(yīng)為“序列70”基序；第一多肽為Cl蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域時(shí)，其相對(duì)應(yīng)的反應(yīng)元件應(yīng)為“序列71”基序。祀轉(zhuǎn)錄單元中的反應(yīng)元件至少為一個(gè)或可以有多個(gè)，在具體的實(shí)施方式中，反應(yīng)元件為1、2、3、4或5個(gè)，如果需要或多個(gè)效果更好的話優(yōu)選多個(gè)。與反應(yīng)元件操作性相連的通常是是最小啟動(dòng)子，此最小啟動(dòng)子本身不足以有效地起啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄，必須和其上游的反應(yīng)元件一起與轉(zhuǎn)錄因子諸成員相互作用后方能激活或上調(diào)下游目的基因轉(zhuǎn)錄。分析相關(guān)文獻(xiàn)，可用作本發(fā)明最小啟動(dòng)子的包括但不限于腺病毒主要晚期啟動(dòng)子(核酸序列為序列72)、巨細(xì)胞病毒CMV最小啟動(dòng)子(核酸序列為序列75)、酵母Gall基因的啟動(dòng)子(核酸序列為序列74)，在本發(fā)明具體的實(shí)施方式中，最小啟動(dòng)子是腺病毒晚期啟動(dòng)子、酵母Gall啟動(dòng)子，但也可采用其它最小啟動(dòng)子。與反應(yīng)元件操作性相連的啟動(dòng)子也可以是完整的啟動(dòng)子，這類啟動(dòng)子本身具有啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的能力，當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合在反應(yīng)元件后，可增強(qiáng)或阻遏下游待轉(zhuǎn)錄核酸的表達(dá)，在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，啟動(dòng)子為SV40啟動(dòng)子(核酸序列為序列73)。在本發(fā)明的本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，所謂“操作性相連指反應(yīng)元件與啟動(dòng)子之間或多個(gè)反應(yīng)元件之間不是直接相連而可以隔開(kāi)若干個(gè)核苷酸，只要仍能協(xié)同作用即可。
本發(fā)明靶轉(zhuǎn)錄單元啟動(dòng)子下游是待轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列，可以是編碼目的蛋白或功能性RNA的核苷酸序列。如上面所述，目的蛋白可以是任何有用的蛋白。為了驗(yàn)證本發(fā)明系統(tǒng)的效果和便于檢測(cè)，在本發(fā)明的實(shí)施例中，采用了示范性的報(bào)告蛋白螢火蟲(chóng)熒光素酶(Fluc，其核酸和氨基酸序列分別為序列76和序列77)、高斯熒光素酶(Gluc，其核酸和氨基酸序列分別為序列78和序列79)、紅色熒光蛋白mCherry (其核酸和氨基酸序列分別為序列80和序列81)、綠色熒光蛋白(hrGFP，其核酸和氨基酸序列分別為序列82和序列83)、黃色熒光蛋白(EYFP，其核酸和氨基酸序列分別為序列91和序列92)、P -半乳糖苷酶(LacZ，其核酸和氨基酸序列分別為序列93和序列94)作為目的蛋白，但本發(fā)明的目的蛋白不限于這些報(bào)告蛋白。待轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列也可以編碼功能性RNA分子，例反義RNA分子。在宿主細(xì)胞或動(dòng)物中表達(dá)這種功能性RNA分子可調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞內(nèi)的一些活動(dòng)，例如，通過(guò)抑制編碼蛋白的mRNA的翻譯，阻止目的蛋白的表達(dá)?？捎脴?biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)將本發(fā)明光可誘導(dǎo)的目的蛋白基因表達(dá)系統(tǒng)的第一部分和第二部分構(gòu)建在一個(gè)真核表達(dá)載體中或分別構(gòu)建在二個(gè)真核表達(dá)載體中?？捎脴?biāo)準(zhǔn)技術(shù)將這種表達(dá)載體引入各種真核宿主細(xì)胞群中表達(dá)所需目的蛋白；或引入各種真核宿主細(xì)胞群中，例如動(dòng)物胚胎細(xì)胞或植物生殖細(xì)胞，進(jìn)一步選擇產(chǎn)生有用的轉(zhuǎn)基因生物，如轉(zhuǎn)基因的 山羊、綿羊、豬、牛或其它家畜，或轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明基于光敏多肽的、光可控基因表達(dá)系統(tǒng)可用于在真核細(xì)胞中表達(dá)內(nèi)源蛋白或外源蛋白，用于基因治療和利用轉(zhuǎn)基因或同源重組生物體(例如動(dòng)物或植物)內(nèi)基因的表達(dá)。本發(fā)明提供由三種或四種多肽組成的多種重組光敏轉(zhuǎn)錄因子融合蛋白的氨基酸序列、其編碼核酸和其真核表達(dá)載體。在本發(fā)明的一實(shí)施方式中，提供重組光敏轉(zhuǎn)錄因子Gal4-VIVID-VP16(簡(jiǎn)寫為GAVV(WT))的編碼核酸(序列3)、氨基酸序列(序列4)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體PGAVV(WT)。在本發(fā)明另一實(shí)施方式中，提供重組光敏轉(zhuǎn)錄因子Gal4-VIVID-p65(簡(jiǎn)寫為GAVP)的編碼核酸(序列31)、氨基酸序列(序列32)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體PGAVP(WT)。在本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施方式中，提供其中VIVID含有點(diǎn)突變的三種重組光敏轉(zhuǎn)錄因子Gal4-VIVID-p65的編碼核酸(序列33、35、39)，氨基酸序列(序列34、36、40)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體pGAVP(C71V)、pGAVP (N56K)和pGAVP (Y50W)，其中括弧中為VIVID中的突變位點(diǎn)。在本發(fā)明另一更優(yōu)選的實(shí)施方式中，提供其中VIVID含有雙突變的重組光敏轉(zhuǎn)錄因子Gal4-VIVID-p65的編碼核酸(序列37)、氨基酸序列(序列38)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體pGAVP(N56K+C71V)。在本發(fā)明另一實(shí)施方式中，提供重組光敏轉(zhuǎn)錄因子Gal4-AsL0V2-p65(簡(jiǎn)寫為GALP)的編碼核酸(序列43)，氨基酸序列(序列44)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體pGALP。在本發(fā)明另一實(shí)施方式中，提供重組光敏轉(zhuǎn)錄因子Gal4-AuL0V-p65(簡(jiǎn)寫為GAAP)的編碼核酸(序列47)，氨基酸序列(序列48)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體PGAAP。在本發(fā)明另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，提供第一與第二多肽用不同接頭肽連接的三種重組光敏轉(zhuǎn)錄因子Gal4-VIVID-p65的編碼核酸(序列59、61、63)，氨基酸序列(序列60、62、64)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞載體pGAVP-9、pGAVP-ll和pGAVP-12，其中9、11、12代表不同的接頭肽。在本發(fā)明另一實(shí)施方式中，提供重組光敏轉(zhuǎn)錄因子Gal4-VIVID-KRAB (C71V)(簡(jiǎn)寫為GAVK(C7IV)的編碼核酸(序列57)，氨基酸序列(序列58)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體pGAVK(C71V)。在本發(fā)明另一實(shí)施方式中，提供一組重組光敏轉(zhuǎn)錄因子Gal4-VIVID-Gal4AD-Ln(N56K+C71V)其中 n 為 1、2、3、4、5、6，簡(jiǎn)寫為 GVG-Ln(N56K+C71V))的編碼核酸(分別為序列97、99、101、103、105和107)，氨基酸序列(分別為序列98、100、102、104、106和108)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體pGPMA_GVG_Ln (N56KC71V)。在本發(fā)明另一實(shí)施方式中，提供重組光敏轉(zhuǎn)錄因子Gal4-VI VID-VP16 (N56K+C71V)(簡(jiǎn)寫為GVVP(N56K+C71V))的編碼核酸( 序列109)，氨基酸序列(序列110)和釀酒酵母菌表達(dá)載體pGPMA-GVVP (N56K+C71V)。在本發(fā)明另一實(shí)施方式中，提供重組光敏轉(zhuǎn)錄因子Gal4-VIVID-Gcn4(N56K+C71V)(簡(jiǎn)寫為 GVGc(N56K+C71V))的編碼核酸(序列 111)，氨基酸序列(序列112)和釀酒酵母菌表達(dá)載體pGPMA-GVGc(N56K+C71V)。在本發(fā)明另一實(shí)施方式中，提供一組其中VIVID含有點(diǎn)突變的重組光敏轉(zhuǎn)錄因子Gal4-VIVID-Gal4AD的編碼核酸(分別為序列113、115、117)，氨基酸序列(分別為序列114、116、118)和釀酒酵母菌表達(dá)載體 pGPMA-GVG(WT)、pGPMA-GVG(C71V)和 pGPMA_GVG(Y50W)。在本發(fā)明另一實(shí)施方式中，提供重組光敏轉(zhuǎn)錄因子Gal4-AsLOV2-Gal4AD(簡(jiǎn)寫為GLG)的編碼核酸(序列119)，氨基酸序列(序列120)和釀酒酵母菌表達(dá)載體pGPMA-GLG。在本發(fā)明另一實(shí)施方式中，提供含有第四多肽的重組光敏轉(zhuǎn)錄因子NLS-LexA-VIVID-Gal4AD(N56K+C71V)(簡(jiǎn)寫為NLVG(N56K+C71V))的編碼核酸(序列7)，氨基酸序列(序列8)和釀酒酵母菌表達(dá)載體pGPMA-NLVG(N56K+C71V)。在本發(fā)明另一實(shí)施方式中，提供含有第四多肽重組光敏轉(zhuǎn)錄因子NLS-cI-VIVID-Gal4AD (N56K+C71V)(簡(jiǎn)寫為 NCVG (N56K+C71V))的編碼核酸(序列 19)，氨基酸序列(序列20)和釀酒酵母菌表達(dá)載體pGPMA-NCVG(N56K+C71V)。在本發(fā)明另一實(shí)施方式中，提供含有第四多肽重組光敏轉(zhuǎn)錄因子NLS-LacI-VIVID-Gal4AD(N56K+C71V)(簡(jiǎn)寫為NLcVG(N56K+C71V))的編碼核酸(序列11)，氨基酸序列(序列12)和釀酒酵母菌表達(dá)載體pGPMA-NLcVG(N56K+C71V)。在本發(fā)明另一實(shí)施方式中，提供含有第四多肽重組光敏轉(zhuǎn)錄因子 NLS-TetR-VIVID-Gal4AD(N56K+C71V)(簡(jiǎn)寫為 NTVG(N56K+C71V))的編碼核酸(序列15)，氨基酸序列(序列16)和釀酒酵母菌表達(dá)載體pGPMA-NTVG(N56K+C71V)。本領(lǐng)域眾所周知，氨基酸的密碼子核苷酸有簡(jiǎn)并性(即某些氨基酸可有二個(gè)、或三個(gè)、或四個(gè)密碼子，它們稱為該氨基酸的簡(jiǎn)并密碼子)，上述的各種重組光敏轉(zhuǎn)錄因子的編碼核酸，本發(fā)明包括它們各自的所有簡(jiǎn)并核苷酸序列。上述的各種重組光敏轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列，本發(fā)明包括它們各自的所有含保守性缺失、添加、置換修飾但仍保留了其原有功能活性的氨基酸序列類似物。本發(fā)明也提供含有反應(yīng)元件-啟動(dòng)子,但待轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列空缺的祀轉(zhuǎn)錄單元的真核表達(dá)載體，待轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列空缺是讓用戶可以自行選擇所需的待轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列，例如目的蛋白的編碼基因，用標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)將其插入本發(fā)明的這種表達(dá)載體中，與上面所述含本發(fā)明重組光敏轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，來(lái)調(diào)節(jié)待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列(基因)的表達(dá)。本發(fā)明也提供分別轉(zhuǎn)染了本發(fā)明各種重組光敏轉(zhuǎn)錄因子基因的真核表達(dá)載體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，同時(shí)提供含有相應(yīng)的反應(yīng)元件-啟動(dòng)子-待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列空缺的祀轉(zhuǎn)錄單元的真核表達(dá)載體。用戶可用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)將自行選擇的待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列(目的蛋白基因)插入該表達(dá)載體中，然后用該重新構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)染已轉(zhuǎn)染了本發(fā)明重組光敏轉(zhuǎn)錄因子基因的真核表達(dá)載體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，并培養(yǎng)這種細(xì)胞表達(dá)他們所需的目的基因，或供他們研究如何調(diào)節(jié)目的基因的表達(dá)。本發(fā)明還提供裝有本發(fā)明基因表達(dá)調(diào)節(jié)系統(tǒng)兩部分的表達(dá)載體或已轉(zhuǎn)染了這種載體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的試劑盒。在一個(gè)實(shí)施方式中，該試劑盒中一些容器分別裝有含本發(fā)明一種或多種重組光敏轉(zhuǎn)錄因子基因的真核表達(dá)載體。在另一個(gè)實(shí)施方式中，該試劑盒中的一些容器分別裝有含本發(fā)明一種或多種重組光敏轉(zhuǎn)錄因子基因的真核表達(dá)載體，另一些容器分別裝有含相應(yīng)反應(yīng)元件-啟動(dòng)子-待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列空缺的靶轉(zhuǎn)錄單元的真核表達(dá)載體。在還有一個(gè)實(shí)施方式中，該試劑盒中一些容器裝有已轉(zhuǎn)染了本發(fā)明重組光敏轉(zhuǎn)錄因子基因的真核表達(dá)載體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，另一些容器裝有含相應(yīng)反應(yīng)元件-啟動(dòng)子-待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列空缺的靶轉(zhuǎn)錄單元的真核表達(dá)載體。本發(fā)明的試劑盒還可以包括相應(yīng)的光照控制設(shè)備，例如LED燈及其調(diào)控裝置。本發(fā)明的所有試劑盒都裝有相應(yīng)的說(shuō)明書(shū)，以說(shuō)明盒中的各成分、使用目的和使用方法，并提供有關(guān)的參考文獻(xiàn)目錄。本發(fā)明還包括光可控基因表達(dá)系統(tǒng)在宿主細(xì)胞中調(diào)控基因表達(dá)的方法，包括步驟a)將所述光可控基因表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建在真核質(zhì)粒表達(dá)載體中；b)引入含被調(diào)控基因的宿主細(xì)胞；和c)光照誘導(dǎo)所述宿主細(xì)胞，使所述宿主細(xì)胞中的被調(diào)控的核苷酸進(jìn)行表達(dá)。光照誘導(dǎo)宿主細(xì)胞的方法包括光源的選擇和光源的使用。光源非限制地包括LED燈、白熾燈、熒光燈、激光。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，光源選用藍(lán)色LED(460-470nm)。光照方法包括光照量、光照強(qiáng)度、光照時(shí)間、光照頻率以及用掃描、投影、光模具等方法在空間上控制目的基因的表達(dá)也包含在本發(fā)明范圍中。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，光照強(qiáng)度為0-0. 8ff/m2不等；在本發(fā)明另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，光照總量不同，即相同的光照強(qiáng)度和光照總時(shí)間，分別每30s光照Is、每60s光照Is、每120s光照Is的光照頻率進(jìn)行光照誘導(dǎo)；在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，用打印的投影片作為光模具，在空間上調(diào)節(jié)不同位置的細(xì)胞的目的基因的表達(dá)水平；在另一個(gè)的在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式中，用中性灰度片作為光模具，在空間上調(diào)節(jié)不同位置的細(xì)胞的目的基因的表達(dá)水平。附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明圖I是重疊PCR的示意圖；圖2是同源重組連接示意圖；圖3為反向PCR的原理；圖4為含有光敏轉(zhuǎn)錄因子的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體的構(gòu)建示意圖。上方為各光敏轉(zhuǎn)錄因子融合蛋白的示意圖；下方為環(huán)狀的表達(dá)載體的示意圖，表達(dá)載體的骨架為pEGFP-Nl，原有的EGFP基因被光敏轉(zhuǎn)錄因子融合蛋白基因取代。*號(hào)表示兩個(gè)多肽處的接頭肽不同；圖5為含有靶轉(zhuǎn)錄單元的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體的構(gòu)建示意圖。上方為各靶轉(zhuǎn)錄單元的示意圖，下方為環(huán)狀的表達(dá)載體的示意圖，表達(dá)載體的骨架為pcDNA3. 1(+)-hygro,原CMV啟動(dòng)子區(qū)和多克隆位點(diǎn)區(qū)被靶轉(zhuǎn)錄單元取代；圖6為含有光敏轉(zhuǎn)錄因子的釀酒酵母細(xì)胞表達(dá)載體的構(gòu)建不意圖。上方為各光敏轉(zhuǎn)錄因子融合蛋白的示意圖，下方為環(huán)狀的表達(dá)載體的示意圖，表達(dá)載體的骨架為PGADI7，原Gal4AD基因被和多克隆位點(diǎn)區(qū)被光敏轉(zhuǎn)錄因子融合蛋白取代。*號(hào)表示兩個(gè)多肽處的接頭肽不同；圖7為含有靶轉(zhuǎn)錄單元的釀酒酵母細(xì)胞表達(dá)載體的構(gòu)建示意圖。上方為各靶轉(zhuǎn)錄單元的示意圖；下方為環(huán)狀的表達(dá)載體的示意圖，表達(dá)載體的骨架為PYES2. I TOPO ；圖8為將Gal4、VIVID(WT)、VP16搭橋PCR的核酸電泳圖。左邊箭頭指的是搭橋、PCR產(chǎn)物的目的條帶，右邊泳道為分子量標(biāo)準(zhǔn)。目的條帶在750bp和IOOObp之間；圖9為PCR擴(kuò)增p65AD的核酸電泳圖。左邊箭頭指的是PCR產(chǎn)物的目的條帶，右邊泳道為分子量標(biāo)準(zhǔn)。目的條帶在500bp和IOOObp之間；

圖10為PCR擴(kuò)增AsL0V2的核酸電泳圖。右邊箭頭指的是PCR產(chǎn)物的目的條帶，左邊泳道為分子量標(biāo)準(zhǔn)。目的條帶在500bp和250bp之間；圖11為PCR擴(kuò)增AuLOV的核酸電泳圖。右邊箭頭指的是PCR產(chǎn)物的目的條帶，左邊泳道為分子量標(biāo)準(zhǔn)。目的條帶 在500bp和250bp之間；圖12為PCR擴(kuò)增LexA(1-87)的核酸電泳圖。右邊箭頭指的是PCR產(chǎn)物的目的條帶，左邊泳道為分子量標(biāo)準(zhǔn)。目的條帶在500bp和250bp之間；圖13為PCR擴(kuò)增LacI (1-62)的核酸電泳圖。右邊箭頭指的是PCR產(chǎn)物的目的條帶，左邊泳道為分子量標(biāo)準(zhǔn)。目的條帶在250bp和IOObp之間；圖14為PCR擴(kuò)增Cl (1-102)的核酸電泳圖。右邊箭頭指的是PCR產(chǎn)物的目的條帶，左邊泳道為分子量標(biāo)準(zhǔn)。目的條帶在500bp和250bp之間；圖15為PCR擴(kuò)增TetR(l_63)的核酸電泳圖。左邊箭頭指的是PCR產(chǎn)物的目的條帶，右邊泳道為分子量標(biāo)準(zhǔn)。目的條帶在250bp和IOObp之間；圖16為PCR擴(kuò)增Gcn4 (1-144)的核酸電泳圖。右邊箭頭指的是PCR產(chǎn)物的目的條帶，左邊泳道為分子量標(biāo)準(zhǔn)。目的條帶在500bp和250bp之間；圖17為在表達(dá)幾種不同轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域?yàn)榈谌嚯牡霓D(zhuǎn)錄因子的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，光照對(duì)Fluc的表達(dá)水平的調(diào)節(jié)。橫軸為共轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒名稱，縱軸為Fluc的活性水平；圖18為在表達(dá)以幾種VIVID突變體的第二多肽的轉(zhuǎn)錄因子的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，光照對(duì)Fluc的表達(dá)水平的調(diào)節(jié)。橫軸為共轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒名稱，縱軸為Fluc的活性水平；圖19為在表達(dá)重組光敏轉(zhuǎn)錄因子GAVP(N56K+C71V)的NIH3T3細(xì)胞中，光照對(duì)Fluc的表達(dá)水平的調(diào)節(jié)。橫軸為共轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒名稱，縱軸為Fluc的活性水平；圖20為在表達(dá)重組光敏轉(zhuǎn)錄因子GAVP (N56K+C71V)的C0S-7細(xì)胞中，光照對(duì)Fluc的表達(dá)水平的調(diào)節(jié)。橫軸為共轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒名稱，縱軸為Fluc的活性水平；圖21為在表達(dá)第一與第二多肽用不同接頭肽連接的重組光敏轉(zhuǎn)錄因子GAVP(WT)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，光照對(duì)Fluc的表達(dá)水平的調(diào)節(jié)。橫軸為共轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒名稱，縱軸為Fluc的活性水平；圖22為在表達(dá)以AsL0V2為第二多肽的轉(zhuǎn)錄因子的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，光照后對(duì)Fluc的表達(dá)水平的調(diào)節(jié)。橫軸為共轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒名稱，縱軸為Fluc的活性水平；圖23為在表達(dá)以AuLOV為第二多肽的轉(zhuǎn)錄因子的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，光照后對(duì)Fluc的表達(dá)水平的調(diào)節(jié)。橫軸為共轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒名稱，縱軸為Fluc的活性水平；圖24為在表達(dá)以KRAB為第三多肽的轉(zhuǎn)錄因子的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，光照對(duì)Fluc的表達(dá)水平的調(diào)節(jié)。橫軸為共轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒名稱，縱軸為Fluc的活性水平；圖25為表達(dá)重組光敏光誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子GAVP (C71V)的HEK293單克隆細(xì)胞篩選。橫軸為單細(xì)胞克隆的編號(hào)，縱軸為Fluc的活性水平；圖26為在表達(dá)重組光敏轉(zhuǎn)錄因子GVG(N56K+C71V)的釀酒酵母AH109細(xì)胞中，光照對(duì)EYFP的表達(dá)水平的調(diào)節(jié)。橫軸為共轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒名稱，縱軸為EYFP的熒光強(qiáng)度；圖27為在表達(dá)重組光敏轉(zhuǎn)錄因子GVVP(N56K+C71V)的釀酒酵母AH109細(xì)胞中，光照對(duì)EYFP的表達(dá)水平的調(diào)節(jié)。橫軸為共轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒名稱，縱軸為EYFP的熒光強(qiáng)度；圖28為在表達(dá)重組光敏轉(zhuǎn)錄因子GVGc(N56K+C71V)的釀酒酵母AH109細(xì)胞中，光照對(duì)LacZ的表達(dá)水平的調(diào)節(jié)。橫軸為共轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒名稱，縱軸為EYFP的熒光強(qiáng)度；圖29為在表達(dá)第二與第三多肽用不同接頭肽連接的重組光敏轉(zhuǎn)錄因子GVG (N56K+C71V)的釀酒酵母AH109細(xì)胞中，光照對(duì)LacZ基因的表達(dá)水平的調(diào)節(jié)；圖30為在表達(dá)重組光敏轉(zhuǎn)錄因子Gal4-VIVID_Gal4AD的釀酒酵母細(xì)胞中，檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平不同時(shí)對(duì)目的基因表達(dá)的調(diào)節(jié)。橫軸為共轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒名稱，縱軸為EYFP的熒光強(qiáng)度；
圖31為在表達(dá)以幾種VIVID突變體的第二多肽的轉(zhuǎn)錄因子的釀酒酵母AH109細(xì)胞中，光照對(duì)EYFP基因的表達(dá)水平的調(diào)節(jié)。橫軸為共轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒名稱，縱軸為EYFP的熒光強(qiáng)度；圖32為以AsL0V2為第二多肽的轉(zhuǎn)錄因子的釀酒酵母AH109細(xì)胞中，光照后對(duì)EYFP基因的表達(dá)水平的調(diào)節(jié)。橫軸為共轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒名稱，縱軸為EYFP的熒光強(qiáng)度；圖33為重組光敏轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)含不同個(gè)數(shù)Gal4反應(yīng)元件的靶轉(zhuǎn)錄單元中EYFP基因表達(dá)的差異。橫軸為共轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒名稱，縱軸為EYFP的熒光強(qiáng)度；圖34為在表達(dá)LexA、LacI, cl和TetR分別為第一多肽的重組光敏轉(zhuǎn)錄因子的釀酒酵母AH109細(xì)胞中，光照對(duì)EYFP的表達(dá)水平的調(diào)節(jié)。橫軸為共轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒名稱，縱軸為EYFP的熒光強(qiáng)度；圖35為在表達(dá)重組光敏轉(zhuǎn)錄因子GAVP (N56K+C71V)的細(xì)胞中，光照誘導(dǎo)的目的基因表達(dá)的時(shí)間動(dòng)力學(xué)過(guò)程和可逆性過(guò)程。橫軸為光照時(shí)間，開(kāi)始光照的時(shí)刻對(duì)應(yīng)為0小時(shí)，縱軸為Fluc的活性水平；圖36為在表達(dá)重組光敏轉(zhuǎn)錄因子GAVP(N56K+C71V)的細(xì)胞中，不同的光照強(qiáng)度對(duì)目的基因表達(dá)水平的調(diào)節(jié)。橫軸為光照強(qiáng)度，縱軸為Fluc的活性水平；圖37為在表達(dá)重組光敏轉(zhuǎn)錄因子GAVP(N56K+C71V)的細(xì)胞中，不同的光照總量(光照頻率)對(duì)目的基因表達(dá)水平的調(diào)節(jié)。橫軸為光照降低倍數(shù)，縱軸為Fluc的活性水平，不同曲線的光照總量(光照頻率)不同；圖38為在表達(dá)重組光敏轉(zhuǎn)錄因子GAVP(N56K+C71V)的細(xì)胞中，光照調(diào)節(jié)mCherry (紅色熒光蛋白)基因表達(dá)的顯微呈像。上圖為相差圖像，下圖為熒光圖像；圖39為在表達(dá)重組光敏轉(zhuǎn)錄因子GAVP(N56K+C71V)的細(xì)胞中，光照調(diào)節(jié)hrGFP(綠色熒光蛋白)基因表達(dá)的顯微呈像。上面為相差圖像，下圖為熒光圖像；圖40為非還原聚丙烯酰胺電泳(15%)檢測(cè)熒光蛋白的表達(dá)。上圖目的條帶為hrGFP (綠色突光蛋白)，下圖目的條帶為mCherry (紅色突光蛋白)；圖41為RT-PCR鑒定光照/黑暗條件下目的基因Fluc的表達(dá)；圖42在表達(dá)重組光敏轉(zhuǎn)錄因子GAVP(N56K+C71V)的細(xì)胞中，用中性灰度片在空間上調(diào)控96孔板中培養(yǎng)的細(xì)胞的熒光蛋白的表達(dá)；圖43為用打印圖案投影片給表達(dá)重組光敏轉(zhuǎn)錄因子GAVP(N56K+C71V)細(xì)胞“拍照”得到的ECUST圖案。左圖為貼有投影片的培養(yǎng)皿的照片，右圖為細(xì)胞的熒光圖像；圖44為純化后光可控DNA結(jié)合蛋白GAV(WT)的純度。箭頭指的是目的條帶；圖45為光可控DNA結(jié)合蛋白GAV(WT)的光譜性質(zhì)；
圖46為光可控DNA結(jié)合蛋白GAV(WT)的凝膠遷移實(shí)驗(yàn)。左右二圖泳道從左至右GAV(WT)蛋白濃度分別為 5. 5iiM、2. 8iiM、l. 4iiM、0. 7iiM、0. 35 y M ;探針濃度均為 125nM ；圖47為6種來(lái)自光敏蛋白的不同LOV結(jié)構(gòu)域的同源性分析，其中黑色表示100%相同的氨基酸序列，深灰色表相似性較高的序列，淺灰色表示相似性中等的序列。
具體實(shí)施例方式以下用實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述。這些實(shí)施例僅僅用于舉例說(shuō)明本發(fā)明，而不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。實(shí)施例中主要采用常規(guī)的基因工程分子生物學(xué)克隆方法，這些方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的，例如簡(jiǎn) 羅斯凱姆斯等的《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)參考手冊(cè)》和J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾著，黃培堂等譯《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三 版，2002年8月，科學(xué)出版社出版，北京)；J E.科林根等著，李慎濤等譯《精編蛋白質(zhì)科學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》(科學(xué)出版社，背景)中的有關(guān)章節(jié)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員按照以下實(shí)施例，不難根據(jù)具體情況略作修改和變換而成功實(shí)施本發(fā)明，這些修改和變換均落在本申請(qǐng)權(quán)利要求的范圍內(nèi)。實(shí)施例中所用的pEGFP-Nl、pGADT7、pGBKT7質(zhì)粒載體購(gòu)自Clontech公司，pcDNA3. I (+) -hygro、pYES2. I TOPO 質(zhì)粒載體購(gòu)自 Invitrogen 公司。pG51uc、pBIND、pACT載體購(gòu)自Promega公司，均為真核表達(dá)載體。pcDNA3. I (+) -hygro和pEGFP-Nl用于構(gòu)建用于哺乳細(xì)胞內(nèi)表達(dá)目的蛋白的真核表達(dá)載體，二者均有CMV啟動(dòng)子，前者具有潮霉素抗性基因，后者具有新霉素抗性基因。PGADI7含有Gal4轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域基因，pBIND含有酵母菌Gal4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域基因，pACT含有VP16轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域基因。pG51uc含有Gal4操縱子、TATA最小啟動(dòng)子元件和螢火蟲(chóng)熒光素酶Fluc基因。pIRES-hrGFP購(gòu)自Stratagene公司，含有hrGFP基因。pGluc-basic購(gòu)自NEB公司，含有Gluc基因。pTRIPZ質(zhì)粒購(gòu)自O(shè)penbiosystem公司，含有SV40啟動(dòng)子序列。pO)FDuetl質(zhì)粒購(gòu)自Novagen公司，含有LacI基因。所有用于PCR的引物均由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成、純化和經(jīng)質(zhì)譜法鑒定正確。本發(fā)明實(shí)實(shí)例中構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒都經(jīng)過(guò)序列測(cè)定，序列測(cè)定由華大基因公司完成。本發(fā)明實(shí)施例所用的Taq DNA聚合酶購(gòu)自東盛生物，pfu DNA聚合酶購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司，PrimeSTAR DNA聚合酶購(gòu)自TaKaRa公司，三種聚合酶購(gòu)買時(shí)都附帶贈(zèng)送對(duì)應(yīng)聚合酶緩沖液和dNTP。BsrGI、Eco47II I、Bgl II、Pst I、Hindi 11、BamHI等限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、T4磷酸化酶(T4PNK)購(gòu)自Fermentas公司，購(gòu)買時(shí)附帶有10 X Tango 緩沖液等。實(shí)施例中所用的CloneEZ PCR克隆試劑盒(含同源重組酶)購(gòu)自南京金斯瑞生物科技有限公司(原金思特科技(南京)有限公司)。除非特別聲明，無(wú)機(jī)鹽類化學(xué)試劑均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司?？敲顾?Kanamycin)、氨節(jié)青霉素(Amp)、PNPG和二硫蘇糖醇(DTT)購(gòu)自Ameresco公司；黃素腺苷酸二核苷酸磷酸(FAD)、ATP、咪唑(Imidazole)購(gòu)自Alfa公司；Gluc檢測(cè)試劑盒購(gòu)自NEB公司；D_熒光素鉀鹽購(gòu)自Synchem公司；EGTA購(gòu)自BBI公司；Trizol 試劑、胰蛋白酶(Trpsin-EDTA)、特級(jí)胎牛血清(FBS)、Lipofectamine2000、L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉、Opti-mem培養(yǎng)基、青霉素/鏈霉素雙抗購(gòu)自Invitrogen公司；各種氨基酸購(gòu)自上海生工生物有限公司；0NPG購(gòu)自Sigma公司DMEM高糖培養(yǎng)基(無(wú)酚紅/有酚紅)購(gòu)自Hyclone公司。除特別指出外，細(xì)胞培養(yǎng)器皿(如IOOmm直徑細(xì)胞培養(yǎng)皿、48孔板等)、移液管等細(xì)胞培養(yǎng)一次性器材購(gòu)自Corning公司。20_直徑玻璃底細(xì)胞培養(yǎng)皿購(gòu)自NEST公司。384孔發(fā)光檢測(cè)白板、384孔熒光檢測(cè)黑板購(gòu)自Grenier公司。96方孔細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自GE healthcare公司。本發(fā)明實(shí)施例中所用的DNA純化試劑盒購(gòu)自BBI公司(加拿大)，普通質(zhì)粒小抽試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；轉(zhuǎn)染級(jí)質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司；RNA抽提試劑盒購(gòu)自Tiangen公司；ImpromII反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Promega公司；DC蛋白定量試劑盒購(gòu)自Bio-rad公司。大腸桿菌Machl購(gòu)自Invitrogen公司；大腸桿菌JM109購(gòu)自Promega公司；大腸桿菌BL21(DE3)購(gòu)自Novagen公司；細(xì)胞系HEK293、C0S_7、NIH3T3購(gòu)白ATCC (美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所);粗糙鏈孢霉菌(Neurospora crassa)由廣西師范大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)系諶斌老師慷慨贈(zèng)送；釀酒酵母AH109購(gòu)自Clontech公司；BY4741購(gòu)自O(shè)penbiosystem公司。本發(fā)明實(shí)施例中用到的主要儀器Biotek Synergy 2多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek公司),X-15R高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司),Microfuge22R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司)，PCR擴(kuò)增儀(德國(guó)Biometra公司)，活體成像系統(tǒng)(美國(guó)Kodak公司)。光度計(jì)購(gòu)自日本和光(Sanwa)公司，核酸電泳儀(上海申能博彩公司)，Ti系列倒置熒光顯微鏡(日本Nikon公司)，四用紫外分析儀(上海嘉鵬公司)。本文中的縮寫詞含義如下h =小時(shí)，min =分鐘，s =秒，d =天，ii L =微升，mL=毫升，L =升，bp =堿基對(duì)，mM =毫摩爾，y M =微摩爾。本發(fā)明實(shí)施例中所用的一部分基因序列通過(guò)計(jì)算機(jī)從NCBI (美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心)檢索網(wǎng)站或從購(gòu)買攜帶相應(yīng)基因的商業(yè)化質(zhì)粒的公司的官方網(wǎng)站獲得。檢索各蛋白編碼基因的具體網(wǎng)站如下Gluc (高斯突光素酶)(http://www. ncbi. nlm. nih. Rov/protein/AAG54095. I)hrGFP (人源化綠色突光蛋白)(http: //www. ncbi. nlm. nih. Rov/nuccore/AY613996. I)Fluc (螢火蟲(chóng)突光素酶)(http: //www. promeRa. com/vectors/pG51uc. txt)Gal4 (http://www.ncbi.nlm.nih.Rov/nuccore/NC 001148 report =Renbank&from = 79711&to = 82356&strand = true)VP16 (單純皰疫病毒顆粒蛋白 16) (http://www. promeRa. com/vectors/pACT.txt)NF- K B p65 (http://www.ncbi.nlm.nih.Rov/nuccore/23958349 report =GenBank)VIVID (http: //www. ncbi. nlm. nih. Rov/nuccore/AF338412. I)Phototropinl (向光素 I) : (http : // www.ncbi.nlm.nih.rov/nucleotide/2754822 report = Renbank&loR$ = nucltop&blast rank = l&RID =P49RPCAR01S)Aureochromel (金色素 I) (http : //www. ncbi. nlm. nih. Rov/nuccore/AB252504. I)
Gcn4 (酵母通用控制蛋白 4) (http://www. ncbi. nlm. nih. Rov/nuccore/NC 001137 report = Renbank&from = 138918&to = 139763&strand = true)
LacI (乳糖操縱子阻遏蛋白)(http: //www. ncbi. nlm. nih. gov/nuccore/NC 000913 report = genbank&from = 365652&to = 366734&strand = true)LexA (http: //biocyc. org/ecoli/seguence type = GENE&ob iect = EG10533)EYFP (增強(qiáng)型黃色突光蛋白)(http: / / www. ncbi. nlm. nih. gov/protein/37551795)本發(fā)明實(shí)施例中所用的另一部分基因序列均通過(guò)計(jì)算機(jī)從NCBI (美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心)或Uniprot (全球蛋白資源數(shù)據(jù)庫(kù))檢索網(wǎng)站查詢其氨基酸序列后，利用DNA design 2. 0軟件將氨基酸序列按照宿主細(xì)胞種屬密碼子偏好性轉(zhuǎn)換成核苷酸序列。檢索各蛋白編碼基因的具體網(wǎng)站如下cl (入操縱子阻遏蛋白)(http: //www. uniprot. org/uniprot/P03034)TetR(Tnl0B class,四環(huán)素阻遏物)(http: //www. uniprot. org/uniprot/P04483)mCherry (http: //www. ncbi. nlm. nih. gov/nuccore/AY678264. I)實(shí)施例所用方法(一 )聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)1.目的片段擴(kuò)增PCR:
權(quán)利要求
1.一種光可控基因表達(dá)系統(tǒng)，包括a)重組光敏轉(zhuǎn)錄因子編碼基因，所述重組光敏轉(zhuǎn)錄因子包括作為DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的第一多肽、作為光敏結(jié)構(gòu)域的第二多肽和作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域的第三多肽；b)靶轉(zhuǎn)錄單元，包括被所述第一多肽識(shí)別/結(jié)合的至少一個(gè)反應(yīng)元件、被第三多肽調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子和待轉(zhuǎn)錄核酸序列。
2.如權(quán)利要求I所述的光可控基因表達(dá)系統(tǒng)，其中所述第一多肽、第二多肽和第三多肽之間可操作性連接，和/或其中反應(yīng)元件、啟動(dòng)子和待轉(zhuǎn)錄核酸序列之間可操作性連接。
3.如權(quán)利要求I所述的光可控基因表達(dá)系統(tǒng)，其中所述第一多肽選自螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、鋅指基序或鋅簇DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、亮氨酸拉鏈DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、翼狀螺旋DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、翼狀螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、螺旋-環(huán)-螺旋DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、高遷移率族DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、B3DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
4.如權(quán)利要求3所述的光可控基因表達(dá)系統(tǒng)，其中所述第一多肽選自酵母Gal4DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、大腸桿菌LexA DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、Lac阻遏蛋白LacI的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、\噬菌體Cl阻遏蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、四環(huán)素組合蛋白TetR的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
5.如權(quán)利要求3所述的光可控基因表達(dá)系統(tǒng)，其中所述第一多肽選自酵母Gal4DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、大腸桿菌LexA DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、Lac阻遏蛋白LacI的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、\噬菌體Cl阻遏蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和四環(huán)素組合蛋白TetR的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，及其截短體或/和氨基酸序列同源性80% -99%的突變體。
6.如權(quán)利要求I所述的光可控基因表達(dá)系統(tǒng)，其中所述第二多肽選自含黃素類生色團(tuán)的光敏蛋白的光敏結(jié)構(gòu)域。
7.如權(quán)力要求6所述的光可控基因表達(dá)系統(tǒng),其中所述第二多肽選自含LOV結(jié)構(gòu)域的光敏蛋白的光敏結(jié)構(gòu)域。
8.如權(quán)利要求7所述的光可控基因表達(dá)系統(tǒng)，其中所述第二多肽選自粗糙鏈孢霉菌的VIVID的L0V2結(jié)構(gòu)域、燕麥光敏色素I基因的L0V2結(jié)構(gòu)域AsL0V2和無(wú)隔藻金色素蛋白I的LOV結(jié)構(gòu)域AuLOV，及其截短體或氨基酸序列15% -99%相同或氨基酸序列36% -99%相似的突變體。
9.如權(quán)利要求I所述的光可控基因表達(dá)系統(tǒng)，其中所述第三多肽選自富含酸性氨基酸的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域、富含脯氨酸的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域、富含絲氨酸/蘇氨酸的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域和富含谷氨酰胺的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，Kruppel相關(guān)盒轉(zhuǎn)錄阻遏結(jié)構(gòu)域。
10.如權(quán)利要求9所述的光可控基因表達(dá)系統(tǒng)，其中所述第三多肽選自單純皰疹病毒顆粒蛋白VP16轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域、酵母Gal4轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域、NF-kB p65亞基轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域、酵母通用控制蛋白4的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域和鋅指蛋白354A的Kruppel相關(guān)盒轉(zhuǎn)錄阻遏結(jié)構(gòu)域。
11.如權(quán)利要求I所述的光可控基因表達(dá)系統(tǒng)，其中還包含促進(jìn)所述重組光敏轉(zhuǎn)錄因子向細(xì)胞核運(yùn)輸?shù)暮硕ㄎ恍盘?hào)肽第四多肽，所述第四多肽與第一、第二、第三多肽直接或通過(guò)接頭肽相連。
12.如權(quán)利要求I所述的光可控基因表達(dá)系統(tǒng)，其中所述反應(yīng)元件為可被所述第一多肽特異性識(shí)別和結(jié)合的DNA基序。
13.如權(quán)利要求12所述的光可控基因表達(dá)系統(tǒng)，其中所述反應(yīng)元件選自Gal4結(jié)合元件、LexA結(jié)合元件、TetR結(jié)合元件、LacI結(jié)合元件和cl結(jié)合元件。
14.如權(quán)利要求I所述的光可控基因表達(dá)系統(tǒng)，其中所述啟動(dòng)子選自腺病毒晚期啟動(dòng)子、巨細(xì)胞病毒CMV最小啟動(dòng)子、酵母Gall基因的啟動(dòng)子和SV40啟動(dòng)子。
15.如權(quán)利要求I所述的光可控基因表達(dá)系統(tǒng)，其中所述第一多肽和第二多肽構(gòu)成一種光可控DNA結(jié)合蛋白。
16.含有權(quán)利要求1-14之一所述光可控基因表達(dá)系統(tǒng)的真核表達(dá)載體。
17.如權(quán)利要求16所述的真核表達(dá)載體，所述表達(dá)載體含有所述重組光敏轉(zhuǎn)錄因子編碼基因，和/或所述祀轉(zhuǎn)錄單元，所述祀轉(zhuǎn)錄單元中含有反應(yīng)元件-啟動(dòng)子但待轉(zhuǎn)錄核酸序列空缺。
18.如權(quán)利要求16所述的真核表達(dá)載體，其中所述重組光敏轉(zhuǎn)錄因子的核苷酸序列選自序列 3、7、11、15、19、31、33、35、37、39、43、47、57、59、61、63、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119 ;氨基酸序列選自序列 4、8、12、16、20、32、34、36、38、40、44、48、58、60、62、64、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120。
19.用權(quán)利要求1-14之一所述光可控基因表達(dá)系統(tǒng)在宿主細(xì)胞中調(diào)控基因表達(dá)的方法，包括步驟 a)將所述光可控基因表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建在真核質(zhì)粒表達(dá)載體中； b)引入含被調(diào)控基因的宿主細(xì)胞；和 c)光照誘導(dǎo)所述宿主細(xì)胞，使所述宿主細(xì)胞中的被調(diào)控的核苷酸進(jìn)行表達(dá)。
20.如權(quán)利要求19所述的調(diào)控基因表達(dá)的方法，其中所述宿主細(xì)胞包括細(xì)菌細(xì)胞、真菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、植物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
21.如權(quán)利要求19所述的調(diào)控基因表達(dá)的方法，其中還包括光源的選擇和照射方法的選擇，所述光源包括LED燈、熒光燈、激光和白熾燈，所述照射方法是持續(xù)的光照或不連續(xù)的光照。
22.如權(quán)利要求21所述的調(diào)控基因表達(dá)的方法，包括用光掃描、投影、光模具在空間上控制不同位置的細(xì)胞的基因表達(dá)水平。
23.如權(quán)利要求21所述的調(diào)控基因表達(dá)的方法，所述方法還包括用打印的投影膠片、中性灰度片在空間上控制不同位置的細(xì)胞的基因表達(dá)水平。
24.一種試劑盒，裝有權(quán)利要求16所述真核表達(dá)載體或/和轉(zhuǎn)染了含有所述轉(zhuǎn)錄因子的真核表達(dá)載體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，及相應(yīng)的說(shuō)明書(shū)。
25.如權(quán)利要求24所述的試劑盒，其中還裝有含反應(yīng)元件-啟動(dòng)子但待轉(zhuǎn)錄核酸序列空缺的靶轉(zhuǎn)錄單元的真核表達(dá)載體。
全文摘要
本發(fā)明提供一種光可控基因表達(dá)系統(tǒng)，包括a)重組光敏轉(zhuǎn)錄因子編碼基因，所述重組光敏轉(zhuǎn)錄因子包括作為DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的第一多肽、作為光敏結(jié)構(gòu)域的第二多肽和作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域的第三多肽；b)靶轉(zhuǎn)錄單元，包括被所述第一多肽識(shí)別/結(jié)合的至少一個(gè)反應(yīng)元件、被第三多肽調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子和待轉(zhuǎn)錄核酸序列。本發(fā)明還提供包含這種光可控基因表達(dá)系統(tǒng)的真核表達(dá)載體，及用這種光可控基因表達(dá)系統(tǒng)在宿主細(xì)胞中調(diào)控基因表達(dá)的方法。本發(fā)明還提供裝有所述光可控基因表達(dá)系統(tǒng)各組分的試劑盒。本發(fā)明的光可控基因表達(dá)系統(tǒng)誘導(dǎo)快速、高效且強(qiáng)，比其他誘導(dǎo)劑安全，毒性小或無(wú)毒性；它可以在時(shí)間和空間上控制基因的表達(dá)。
文檔編號(hào)C12N15/79GK102643852SQ20111004814
公開(kāi)日2012年8月22日 申請(qǐng)日期2011年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月28日
發(fā)明者楊弋, 王雪, 陳顯軍 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)