專利名稱：一種聯(lián)產(chǎn)丁醇、異丙醇及乙醇的重組菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程領域，尤其涉及一種聯(lián)產(chǎn)丁醇、異丙醇及乙醇的重組菌及其應用。
背景技術：
隨著能源與環(huán)境危機的日益加重，迫使人們?nèi)ふ倚碌姆椒▉碇鸩綔p少對于化石資源的依賴。通過微生物利用可再生資源來生產(chǎn)化學品是重要的途徑之一。乙醇作為一種常見的化學品具有廣泛的用途，近年來燃料乙醇受到許多國家的關注，尤其是巴西，美國， 但是乙醇并不是一種理想的汽油替代品，因為乙醇的能量密度比汽油低而且不能與汽油任意比混合，同時乙醇具有吸濕性和腐蝕性，不利于儲存與運輸。而丁醇的熱值、辛烷值與汽油相當，含氧量與汽油中常用的甲基叔丁基醚相近，不會腐蝕管道，便于管道輸送；蒸汽壓低，安全性高，且能與汽油以任意比混合，是一種極具潛力的新型生物燃料。同時丁醇還是一種重要的化工原料，主要用于制造增塑劑、溶劑、萃取劑等，是一種高附加值化學品，全球年需求量超過140萬噸。異丙醇是一種重要的化工產(chǎn)品和化工原料，是石油化工發(fā)展史上從石油原料制得的第一個化工產(chǎn)品，主要用于制藥、化妝品、塑料、香料、涂料及電子工業(yè)上用作脫水劑及清洗劑。涂料和油墨是其主要應用領域，約占異丙醇總消費量的50%。另外， 異丙醇還可以作為汽油添加劑，相對于現(xiàn)在常用的燃料乙醇，異丙醇具有更高的能量密度， 而且其辛烷值比正丁醇還要高。異丙醇有特殊的香氣，是水果、蔬菜、乳制品和酒類等食品中的天然成分之一。歐美國家在飲料和糖果等產(chǎn)品中添加異丙醇。2004年日本制定了異丙醇作為香料添加劑的標準，指定異丙醇為食品用香料。目前世界異丙醇的總生產(chǎn)能力約為 230萬噸/年，美國是世界上異丙醇消費量最大的國家，近年我國異丙醇消費保持高速增長勢頭，價格一直在1萬元/噸波動，市場前景廣闊。1861年巴斯德首次發(fā)現(xiàn)細菌能夠產(chǎn)生丁醇，1912年魏茲曼(Weizmarm)發(fā)現(xiàn)了一種梭菌Clostridium acetobutylicum能夠?qū)⒌矸坜D化為丙酮、丁醇及乙醇。而研究發(fā)現(xiàn)拜氏梭菌(Clostridium bei jerinckii) NRRL B593和NESTE 255可以在細胞內(nèi)合成大約IOOmM的異丙醇，其合成機理是通過一種次級醇脫氫酶(secondary alcohol dehydregenase，sADH)將丙酮催化成異丙醇。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種重組菌。本發(fā)明提供的重組菌，為按照如下8種方法制備的8類重組菌中的任一種1)將次級醇脫氫酶編碼基因、輔酶A轉移酶編碼基因和乙酰乙酸脫羧酶編碼基因?qū)氤霭l(fā)菌B中，得到重組菌8;2)將次級醇脫氫酶編碼基因?qū)氤霭l(fā)菌A中，得到重組菌1 ；3)將次級醇脫氫酶編碼基因?qū)氤霭l(fā)菌B中，得到重組菌2 ；4)將次級醇脫氫酶編碼基因和輔酶A轉移酶編碼基因?qū)氤霭l(fā)菌A中，得到重組菌3 ；5)將次級醇脫氫酶編碼基因和輔酶A轉移酶編碼基因?qū)氤霭l(fā)菌B中，得到重組菌4 ；6)將次級醇脫氫酶編碼基因和乙酰乙酸脫羧酶編碼基因?qū)氤霭l(fā)菌A中，得到重組菌5 ；7)將次級醇脫氫酶編碼基因和乙酰乙酸脫羧酶編碼基因?qū)氤霭l(fā)菌B中，得到重組菌6 ；8)將次級醇脫氫酶編碼基因、輔酶A轉移酶編碼基因和乙酰乙酸脫羧酶編碼基因?qū)氤霭l(fā)菌A中，得到重組菌7;所述出發(fā)菌A為產(chǎn)丙酮丁醇的梭菌Onostridium)；所述出發(fā)菌B為buk基因敲除的產(chǎn)丙酮丁醇的梭菌(Clostridium)。所述次級醇脫氫酶的氨基酸序列為序列表中序列6 ；所述輔酶A轉移酶的氨基酸序列為序列表中序列7 ；所述乙酰乙酸脫羧酶的氨基酸序列為序列表中序列8。所述次級醇脫氫酶編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列1 ；所述輔酶A轉移酶編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列2 ；所述乙酰乙酸脫羧酶編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列3。所述次級醇脫氫酶編碼基因通過重組載體1導入出發(fā)菌A中；所述次級醇脫氫酶編碼基因通過重組載體1導入出發(fā)菌B中；所述次級醇脫氫酶編碼基因和輔酶A轉移酶編碼基因通過重組載體2導入出發(fā)菌 A中；所述次級醇脫氫酶編碼基因和輔酶A轉移酶編碼基因通過重組載體2導入出發(fā)菌 B中；所述次級醇脫氫酶編碼基因和乙酰乙酸脫羧酶編碼基因通過重組載體3導入出發(fā)菌A中；所述次級醇脫氫酶編碼基因和乙酰乙酸脫羧酶編碼基因通過重組載體3導入出發(fā)菌B中；所述次級醇脫氫酶編碼基因、輔酶A轉移酶編碼基因和乙酰乙酸脫羧酶編碼基因通過重組載體4導入出發(fā)菌A中；所述次級醇脫氫酶編碼基因、輔酶A轉移酶編碼基因和乙酰乙酸脫羧酶編碼基因通過重組載體4導入出發(fā)菌B中；所述重組載體1為將次級醇脫氫酶編碼基因插入pITF質(zhì)粒的BamH I和EcoR I 識別位點得到的載體；所述重組載體2為將輔酶A轉移酶編碼基因插入所述重組載體1的EcoR I和Nar I識別位點得到的載體；所述重組載體3為將乙酰乙酸脫羧酶編碼基因插入所述重組載體1的Cla I和 Bsm I識別位點得到的載體；所述重組載體4為將乙酰乙酸脫羧酶編碼基因插入所述重組載體2的Cla I和 Bsm I識別位點得到的載體。
所述產(chǎn)丙酮丁醇的梭菌(Clostridium)為丙酮丁醇梭菌(C. acetobutylicum)或拜氏梭菌(Clostridium beijorinckii)；所述丙酮丁醇梭菌(C. acetobutylicum)優(yōu)選為丙酮丁醇梭菌 (C. acetobutylicum) SMB009 或丙酮丁醇梭菌(C. acetobutylicum) ATCC824 ；所述拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)優(yōu)選為拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)NCIMB 8052 ；所述出發(fā)菌B按照如下方法制備將buk基因敲除載體轉入所述丙酮丁醇梭菌 (C. acetobutylicum) SMB009、所述丙酮丁醇梭菌 ATCC824 或所述拜氏梭菌(Clostridium bei jerinckii) NCIMB 8052 中得到的重組菌；所述buk基因敲除載體按照如下方法制備將buk基因特異性的II型內(nèi)含子的核苷酸插入PMTL009的HindIII和BsrGI識別位點間得到的載體；所述II型內(nèi)含子的核苷酸序列為序列表中的序列5。本發(fā)明的另一個目的是一種生產(chǎn)醇的方法。本發(fā)明體的方法，包括如下步驟發(fā)酵所述的重組菌，收集發(fā)酵產(chǎn)物，從所述發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到所述醇，所述醇為下述三種醇中的至少一種丁醇、異丙醇和乙醇。所述發(fā)酵溫度為35°C -40°C ；所述發(fā)酵溫度具體為35°C、37°C或40°C，所述發(fā)酵時間為55h_65h，所述發(fā)酵時間具體為5^i、60h或65h ；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為6. 5-6. 95，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH具體為6. 5,6. 75或 6. 95。所述發(fā)酵為厭氧發(fā)酵，是指在轉速150rpm以下，通氮氣，利用發(fā)酵罐進行發(fā)酵；靜置厭氧發(fā)酵是指不攪拌、不轉動，通氮氣，利用發(fā)酵罐或厭氧瓶進行發(fā)酵。每IL所述發(fā)酵采用的培養(yǎng)基按照如下方法制備(75g-85g)葡萄糖、(0. lg-0. 8g)硫酸鎂、(0. 005g-0. 015g)硫酸錳、 (0. 005g-0. 015g)硫酸亞鐵、(0. 5g-l. 5g)氯化鈉、(4. 5g_5. 5g)酵母粉、(1. 5g_2. 5g)硫酸銨、(0. 5-gl. 0g)磷酸二氫鉀、(0. 5g-l. 0g)磷酸氫二鉀、(1. 5g-2. 5g)天冬氨酸和水混合， 用水補至1L，得到的培養(yǎng)基；每IL所述發(fā)酵采用的培養(yǎng)基按照如下方法制備(75g、70g或85g)葡萄糖、(0. lg、0. 4g或0. 8g)硫酸鎂、(0. 005g、0. Olg或0. 015g) 硫酸錳、(0. 005g、0. Olg 或 0. 015g)硫酸亞鐵、(0. 5g、l. Og 或 1. 5g)氯化鈉、(4. 5g、5. Og 或 5. 5g)酵母粉、(1. 5g、2. Og 或 2. 5g)硫酸銨、(0. 5g、0. 75g 或 lg)磷酸二氫鉀、(0. 5g、0. 76g 或lg)磷酸氫二鉀、(1. 5g、2. Og或2. 5g)天冬氨酸和水混合，用水補至1L，得到的培養(yǎng)基。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明將拜氏梭菌NRRL B593的sADH基因單獨或與丙酮丁醇梭菌的ctfAB和/或adc基因一起插入到穿梭質(zhì)粒PITF中，并連接丙酮丁醇梭菌的自身啟動子，構建表達質(zhì)粒psADH、psADH-ctfAB、psADH-ADC或ρsADH_ctfAB-ADC，同時優(yōu)選電擊轉化的方法，將重組質(zhì)粒導入buk基因敲除或不敲除的梭菌細胞，使這三個基因能分別或同時在丙酮丁醇梭菌或拜氏梭菌中高效表達。


圖1為質(zhì)粒PITF和pIMPl的結構示意圖
圖2為基于II型內(nèi)含子的敲除質(zhì)粒PMTL009結構示意3為表達質(zhì)粒psADH圖4為表達質(zhì)粒psADH-ctfAB圖5為表達質(zhì)粒psADH-ADC圖 6 為表達質(zhì)粒 psADH-ctfAB-ADC (ρsADH-ctfAB-Ads)圖7為buk基因敲除質(zhì)粒pMTL009 (buk)
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1、丙酮丁醇梭菌中敲除buk基因并表達重組質(zhì)粒psADH-ctfAB-ADC獲得聯(lián)產(chǎn)丁醇、異丙醇及乙醇的重組菌1) buk基因敲除質(zhì)粒pMTL009 (buk)的構建對buk基因序列進行計算和分析，設計以下引物IBS :5’ -AAAAAAGCTTATAATTATCCTTAGAAATAGCAAAAGTGCGCCCAGATAGGGTG-3，EBSld 5' -CAGATTGTACAAATGTGGTGATAACAGATAAGTCGCAAAAGATAACTTACCTTTCTTTG T-3，EBS2 :5’ -TGAACGCAAGTTTCTAATTTCGGTTATTTCTCGATAGAGGAAAGTGTCT-3’EBS Universal :5’ -CGAAATTAGAAACTTGCGTTCAGTAAAC-3，以 pMTL009 質(zhì)粒(Dong, H. ,Y. Zhang, et al. “ Engineering Clostridium strain to accept unmethylated DNA. “ PLoS One 5(2) :e9038，公眾可從中國科學院微生物研究所獲得。圖2)為模板，分別以IBS和EBS Universal為一對引物，以EBSld和EBS2為另一對引物，采用全式金公司的Taq酶進行PCR擴增，其PCR擴增程序均為預變性94°C，2min30個循環(huán)94°C，30s55°C, 30s72°C, 30s最后延伸72°C，IOmin0將所得的PCR產(chǎn)物進行核酸電泳然后切膠回收，然后將兩段產(chǎn)物進行融合PCR(融合PCR的模板為兩段產(chǎn)物，引物為IBS和EBSld)，得到的350bp產(chǎn)物進行PCR產(chǎn)物回收，隨后用NEB公司的HindIII和BsrGI對純化的PCR產(chǎn)物和pMTL009質(zhì)粒進行混合酶切，37°C 靜置4h后，用DNA回收試劑盒純化消化的PCR產(chǎn)物，-20°C保存。取適量的經(jīng)過酶切的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒DNA(其含量比例大于5 1)用于T4DNA 連接酶反應，16°C連接4-他。取2 μ 1的連接產(chǎn)物，加入100 μ 1高效感受態(tài)細胞(E. coli JM109)中，混勻；冰浴放置30min后，42°C水浴熱激90s ；冰浴放置2min，加入800 μ 1新鮮 LB培養(yǎng)基，37°C，150rpm，放置45min ；吸取100 μ 1菌液涂布于含氯霉素的LB平板上。培養(yǎng) 20h-24h后，將克隆劃線分離，并取單菌落用于富集培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，送去測序，該質(zhì)粒含有的序列為序列5的核苷酸，該質(zhì)粒為將序列5插入到pMTL009的HindIII和BsrG I酶切位點間得到的載體，將該質(zhì)粒質(zhì)粒命名為pMTL009(buk)(圖7)。2) pMTL009 (buk)轉化梭菌及buk敲除菌的篩選和驗證丙酮丁醇梭菌電轉感受態(tài)細胞的制備厭氧環(huán)境下，取RCM培養(yǎng)基培養(yǎng)的對數(shù)中后期的丙酮丁醇梭菌(C. acetobutylicum) SMB009 (Dong, H.，Y. Zhang, et al. “ Engineering Clostridium strain to accept unmethylated DNA. " PLoS One 5(2) :e9038，2010，公眾可從中國科學院微生物研究所中獲得。)細胞液約48ml置于50ml 的可密封的離心管(Nalgene，菌液裝滿根離心管)中，冰浴放置lOmin。4°C，2000g離心 IOmin0厭氧環(huán)境下，去上清液，加入足量預冷的電轉緩沖液O70mM蔗糖，5mM NaH2PO4, pH7. 4)，洗滌兩次，并重新懸浮到1.5ml的電轉緩沖液，放置冰浴用于電轉化。丙酮丁醇梭菌的轉化取0. 4cm的電轉杯，放置在冰浴中冷卻，加入200 μ g質(zhì)粒 PMTL009 (buk)和20 μ 1新鮮配制的SMB009感受態(tài)細胞，冰浴放置^iiin。采用2. Okv脈沖電壓和25 μ F的電容進行電轉化；隨后將電轉液加到含10ml RCM培養(yǎng)基的厭氧瓶中靜置厭氧培養(yǎng)4h (37°C )。離心收集細胞，并將所得細胞涂布于3-5個含氯霉素抗性的RCM瓊脂培養(yǎng)基(氯霉素在培養(yǎng)基中的終濃度為30mg/l)中。培養(yǎng)對-3他后，挑取單菌落接入無抗性的RCM液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后吸取100 μ 1菌液放入900 μ 1 RCM液體培養(yǎng)基中進行梯度稀釋，吸取100μ 1 10_4稀釋液涂布到無抗性的RCM瓊脂培養(yǎng)基中，最后通過菌落PCR(引物為 EBSld 禾口 buk-1 :atgtatagattactaataatcaatcctggct),結果為 760bp 艮口為 buk 基因敲除的陽性克隆，記為 C. acetobutylicum SMB009 Abuk03)表達質(zhì)粒 psADH-ctfAB-ADC 的構建A.構建表達sADH基因的psADH質(zhì)粒采用細菌基因組提取試劑盒提取拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii) NRRLB593(購自ARS(NRRL)Culture Collection)的染色體DNA，以此為模板，用以下引物進行PCR擴增B593-1 :5’ -CGCGGATCCATGAAAGGTTTTGCAATGCTAGGTATTAATAA-3’B593-2 :5’ -CCGGAATTCTTATAATATAACTACTGCTTTAATTAAGTC-3’采用TaKaRa公司的高效保真酶I^rimerstart進行PCR擴增，其PCR擴增程序為預變性98°C，2min30 個循環(huán)98 °C，30s55°C, 30s72°C, Imin最后延伸72°C，IOmin將所得的PCR產(chǎn)物采用PCR產(chǎn)物回收試劑盒純化，送去測序，結果為該PCR產(chǎn)物具有序列表中序列表1所示的核苷酸，該PCR產(chǎn)物的基因為sADHteenBank數(shù)據(jù)庫中的登錄號是AF157307. 2的從2351到3406之間的1056bp序列)。隨后用NEB公司的BamHI-HF (-HF表示高保真，以下同)和EcoRI-HF對純化的PCR 產(chǎn)物進行雙酶切，37°C靜置4h后，用DNA回收試劑盒純化酶切后的PCR產(chǎn)物，-20°C保存。采用質(zhì)粒小提試劑盒提取E. coli中含有的pITF質(zhì)粒(Wang, S. , Y. Zhang, et al. “ Formic Acid Triggers the " Acid Crash " of Acetone-Butanol-Ethanol Fermentation of Clostridium acetobutylicum. " Appl Environ Microbiol,2011,77(5) :1674-1680。公眾可從中國科學院微生物研究所獲得。)(由pIMPl衍生而得，含有硫解酶啟動子的質(zhì)粒，硫解酶啟動子序列見序列表4)，其大小約為4. 51Λ。取適量的質(zhì)粒， 同樣用NEB公司的BamHI-HF和EcoRI-HF對其雙酶切，隨后用DNA回收試劑盒純化回收酶切后的質(zhì)粒DNA，-20°C保存。取適量的經(jīng)過雙酶切的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒DNA (其含量比例大于5 1)用T4DNA連接酶反應，16°C保存4-他。取5μ 1的連接產(chǎn)物，加入100 μ 1的高效感受態(tài)細胞(E. coli JM109)中，混勻；冰浴放置30min后，42°C水浴熱激90s ；冰浴放置2min，加入800 μ 1新鮮 LB培養(yǎng)基，37°C，150rpm，放置45min ；取100 μ 1菌液涂布于含氨芐青霉素的LB平板上。培養(yǎng)20-24h后，挑取單菌落少量細胞，用于菌落PCR驗證陽性克隆子。將陽性克隆子劃線分離，并取單菌落用于富集培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，送去測序，結果為該質(zhì)粒為將序列表中的序列1 插入pITF質(zhì)粒的BamHI和EcoRI酶切位點間得到的載體，將該質(zhì)粒命名為psADH(圖3)。B.構建表達CtfAB基因的pctfAB質(zhì)粒用同樣的方法提取對數(shù)后期的丙酮丁醇梭菌SMB009的染色體DNA，以此為模板， 用以下引物進行PCR擴增c tfAB-Ι :5’ -CGCGGATCCATGAACTCTAAAATAATTAGATTTG-3’c tfAB-2 :5’ -CCGGAATTCCTAAACAGCCATGGGTCTAAGTTCA-3’將PCR產(chǎn)物送去測序，結果為該PCR產(chǎn)物具有序列表中序列2所示的核苷酸，為 ctfAB基因(GenBank數(shù)據(jù)庫中登錄號為AY187686的從沈13到3936之間的13Mbp序列)。將該PCR產(chǎn)物經(jīng)過BamHI和EcoRI酶切，與經(jīng)過同樣酶切的pITF質(zhì)粒連接，連接產(chǎn)物轉入大腸桿菌，得到轉化子，提取質(zhì)粒，送去測序，結果該質(zhì)粒為將序列表中的序列2插入pITF的BamHI和EcoRI酶切位點間得到的載體，該質(zhì)粒命名為pctfAB。用同樣的方法提取對數(shù)后期的丙酮丁醇梭菌SMB009的染色體DNA，以此為模板， 用以下引物進行PCR擴增adc-Ι :5，-CGCGGATCCTGAAGTAATTAAACAAATTAGCACGCCATT-3，adc-2 :5’ -CCGGAATTCTTTTCGCATTTATAAGCTCACATATTCTAG-3’將該PCR產(chǎn)物送去測序，結果為該PCR產(chǎn)物具有序列表中序列3所示的核苷酸， 為adc基因(GenBank數(shù)據(jù)庫中登錄號為AE001438. 3的從179848到180582之間735bp序列)。將該PCR產(chǎn)物經(jīng)過BamHI和EcoRI酶切，與經(jīng)過同樣酶切的pITF質(zhì)粒連接，連接產(chǎn)物轉入大腸桿菌，得到轉化子，提取質(zhì)粒，送去測序，結果該質(zhì)粒為將序列表中的序列3插入pITF的BamHI和EcoRI酶切位點間得到的載體，該質(zhì)粒命名為pADC。C.構建共表達 sADH、ctfAB、adc 基因的 psADH-ctfAB-ADC 質(zhì)粒以pctfAB質(zhì)粒為模板，用以下引物進行PCR擴增pthl-ctfAB-1 :5，-CCGGAATTCTATATTGATAAAAATAATAATAGTGGG-3，pthl-ctfAB-2 :5， -TACGGGCGCCCTAAACAGCCATGGGTCTAAGTTCA-3，將得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)過EcoRI和NarI酶切，與經(jīng)過同樣酶切的psADH連接，得到的連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌，得到轉化子，提取轉化子的質(zhì)粒，將該質(zhì)粒送去測序，結果為該質(zhì)粒為將序列表中的序列2插入psADH的EcoRI和NarI得到的載體，命名為psADH-ctfAB， 為sADH和ctfAB共表達的質(zhì)粒，見圖4。
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以pADC質(zhì)粒為模板，用以下引物進行PCR擴增pthl-adc-Ι 5’ -CCATCGATTATATTGATAAAAATAATAATAGTGGGTATAATTAAGTTG-3’pthl-adc-2 5’ -CTGGAATGCGTTACTTAAGATAATCATATATAACTTCAGCTCTAGGCAA-3’將得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)過Cla I和Bsm I酶切，分別與經(jīng)過同樣酶切的psADH和 psADH-ctfAB連接，得到的連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌，分別得到2種轉化子，提取2種轉化子的質(zhì)粒，將1種質(zhì)粒送去測序，結果為該質(zhì)粒為將序列表中的序列3插入psADH的Cla I和 Bsm I得到的載體，命名為psADH-ADC，為sADH和adc共表達的質(zhì)粒見，圖5 ；另一種質(zhì)粒送去測序，結果為該質(zhì)粒為將序列表中的序列3插入psADH-ctfAB的Cla I和Bsm I得到的載體,命名為psADH-ctfAB-ADC，為sADH、ctfAB和adc共表達的質(zhì)粒，見圖6。4)多種重組菌的獲得采用步驟2)的方法進行如下操作將psADH-ctfAB-ADC 轉入 C. acetobutylicum SMB009 Δ buk 中，得到重組菌， 提取質(zhì)粒送去測序，該質(zhì)粒為psADH-ctfAB-ADC，該重組菌命名為C. acetobutylicum SMB009Abuk-004。將表達質(zhì)粒psADH轉化buk基因敲除菌株C. acetobutylicum SMB009Abuk中， 得到重組菌，提取質(zhì)粒送去測序，該質(zhì)粒為psADH，將重組菌命名為C. acetobutylicum SMB009 Abuk-OOl ；將表達質(zhì)粒psADH轉化C. acetobutylicum SMB009中，得到重組菌，提取質(zhì)粒送去測序，該質(zhì)粒為psADH，將重組菌命名為C. acetobutylicum SMB009-001 ；將psADH-ctfAB 轉化 buk 基因敲除菌株 C. acetobutylicum SMB009 Δ buk 中，得到重組菌，提取質(zhì)粒送去測序，該質(zhì)粒為psADH-ctfAB，將重組菌命名為C. acetobutylicum SMB009Δbuk-002 ；將psADH-ctfAB轉化C. acetobutylicum SMB009中，得到重組菌，提取質(zhì)粒送去測序，該質(zhì)粒為 psADH-ctfAB，將重組菌命名為 C. acetobutylicum SMB009-002 ；將psADH-ADC 轉化 buk 基因敲除菌株 C. acetobutylicum SMB009 Δ buk 中，得到重組菌，提取質(zhì)粒送去測序，該質(zhì)粒為psADH-ADC，將重組菌命名為C. acetobutylicum SMB009Δbuk-003 ；將psADH-ADC轉化C. acetobutylicum SMB009中，得到重組菌，提取質(zhì)粒送去測序，該質(zhì)粒為 psADH-ADC，將重組菌命名為 C. acetobutylicum SMB009-003 ；將psADH-ctfAB-ADC轉化 c. acetobutylicum SMB009 中，得到重組菌，提取質(zhì)粒送去測序，該質(zhì)粒為 psADH-ctfAB-ADC，將重組菌命名為 C. acetobutylicum SMB009-004。采用同樣的方法將空載體pIMP I (pIMP I的結構示意圖如圖1所示，與pITF的區(qū)別在于含有硫解酶啟動子和甲酸脫氫酶基因的質(zhì)粒，硫解酶啟動子序列見序列表4，該質(zhì)粒記載在 Wang, S. , Y. Zhang, et al. “ Formic Acid Triggers the" Acid Crash" of Acetone-Butanol-Ethanol Fermentation of Clostridium acetobutylicum. " Appl Environ Microbiol, 2011, 77 (5) :1674-1680.公眾可從中國科學院微生物研究所獲得。) 分別轉入 C. acetobutylicum SMB009 和 C. acetobutylicum SMB009 Δ buk 中得到轉空載體 c. acetobutylicum SMB009 和轉空載體 C. acetobutylicum SMB009 Abuk0 經(jīng)過直接涂布紅霉素抗性平板，長出的菌落即是陽性克隆。
實施例2、丙酮丁醇梭菌ATCC8M表達重組質(zhì)粒獲得聯(lián)產(chǎn)丁醇、異丙醇及乙醇的重組菌1、質(zhì)粒甲基化將實施例1中的表達質(zhì)粒psADH和psADH-ctfAB-ADC分別轉入含DNA甲基化酶的質(zhì)粒的 E. coli (pANl) (MermeIstein, L. D. and Ε. Τ. Papoutsakis. “ In vivo methylation in Escherichia coli by the Bacillus subtilis phage phi 3T I methyltransferase to protect plasmids from restriction upon transformation of Clostridium acetobutylicum ATCC 824." Appl Environ Microbiol, 1993,59(4) :1077_1081，公眾可從中國科學院微生物研究所中獲得。)中，將轉化后細胞涂布于含有氨芐青霉素和氯霉素的雙抗LB平板上，挑取單菌落并富集培養(yǎng)，分別用B593-1和B593-2引物對、ctfAB-Ι和 ctfAB-2引物對進行菌落PCR驗證，得到1056bp為質(zhì)粒psADH甲基化的陽性克隆，得到 1324bp為質(zhì)粒psADH-ctfAB-ADC甲基化的陽性克隆。提取質(zhì)粒psADH甲基化的陽性克隆的質(zhì)粒，轉入丙酮丁醇梭菌 (C. acetobutylicum) ATCC824中，得到重組菌，提取重組菌的質(zhì)粒，送去測序，結果為該質(zhì)粒為psADH，將該重組菌命名為重組菌C. acetobutylicum ATCC824-001 ；提取質(zhì)粒psADH-ctfAB-ADC甲基化的陽性克隆的質(zhì)粒，轉入丙酮丁醇梭菌 (C. acetobutylicum) ATCC824中，得到重組菌，提取重組菌的質(zhì)粒，送去測序，結果為該質(zhì)粒為 psADH-ctfAB-ADC，將該重組菌命名為重組菌 C. acetobutylicum ATCC824-002 ；將空載體pIMP 1(采用上述方法進行甲基化)轉入丙酮丁醇梭菌 (C. acetobutylicum) ATCC824中，經(jīng)過直接涂布紅霉素抗性平板，長出的菌落即是陽性克隆，將陽性菌命名為轉空載體C. acetobutylicum ATCC擬4。實施例3、拜氏梭菌NCIMB 8052表達重組質(zhì)粒獲得聯(lián)產(chǎn)丁醇、異丙醇及乙醇的重組菌將實施例1得到的表達質(zhì)粒psADH轉入拜氏梭菌(Clos tridium bei jerinckii) NCIMB 8052中，得到重組菌，提取重組菌的質(zhì)粒，送去測序，結果為該質(zhì)粒為psADH，將該重組菌命名為重組菌 Clostridium beijerinckii NCIMB 8052-001 ；采用同樣的方法將空載體pIMP I (不需要甲基化)，經(jīng)過直接涂布紅霉素抗性平板，長出的菌落即是陽性克隆，將陽性菌命名為轉空載體Clostridium beijerinckii NCIMB 8052ο實施例4、重組菌的發(fā)酵分析方法一分別將實施例1 得到的重組菌 C. acetobutylicum SMB009 Δ buk-001、 C. acetobutylicum SMB009-00UC. acetobutylicum SMB009 Δ buk-002> C. acetobutylicum SMB009-002、 C. acetobutylicum SMB009 Δ buk—003、 C. acetobutylicum SMB009—003、 C. acetobutylicum SMB009 Δ buk_004、C. acetobutylicum SMB009-004,實施實例 2得到的重組菌 C. acetobutylicum ATCC824-00UC. acetobutylicumATCC824-002,實施實例 3 得到重組菌 Clostridium beijerinckii NCIMB 8052-001 進行厭氧發(fā)酵(在轉速 150rpm 以下， 通氮氣，利用發(fā)酵罐進行發(fā)酵)60h ；發(fā)酵培養(yǎng)基為RCM培養(yǎng)基，按照如下方法制備酵母粉(0X0ID，1112852-02) :3g/L ；胰蛋白胨(0X0ID，955927) :10g/L;牛肉浸膏(北京化學試劑公司，69004494) :10g/L ； Cys-HCl (國藥集團化學試劑有限公司，62007534) :0. 5g/L ；無水乙酸鈉(國藥集團化學試劑有限公司，10018892) :3g/L ；氯化鈉10g/L ；葡萄糖5g/L ；可溶性淀粉5g/L(這三個為 北京現(xiàn)代東方精細化學品有限公司)，發(fā)酵培養(yǎng)到對數(shù)中期，以5% -10%的接種量接種到含CGM培養(yǎng)基(葡萄糖70g/L ；硫酸鎂0. 4g/L ；硫酸錳0. 01g/L ；硫酸亞鐵0. 01g/L ；氯化鈉lg/L ；酵母粉5g/L(0X0ID，1112852-02)；硫酸銨2g/L ；磷酸二氫鉀0. 75g/L ；磷酸氫二鉀 0. 75g/L ；天冬氨酸2g/l ；溶劑為水；115°C條件下滅菌20分鐘，pH為6. 75)的發(fā)酵罐中，低轉速(轉速150rpm)培養(yǎng)，發(fā)酵溫度為37°C。方法二與方法一基本相同，不同的是發(fā)酵溫度為35°C，發(fā)酵時間為5 ；發(fā)酵培養(yǎng)基的 PH 為 6. 5 ；每IL發(fā)酵采用的培養(yǎng)基CGM培養(yǎng)基按照如下方法制備75g葡萄糖、0. Ig硫酸鎂、0. 005g硫酸錳、0. 005g硫酸亞鐵、0. 5g氯化鈉、4. 5g酵母粉、1. 5g硫酸銨、0. 5g磷酸二氫鉀、0. 5g磷酸氫二鉀、1. 5g天冬氨酸和水混合，用水補至 1L，得到的培養(yǎng)基。方法三與方法一基本相同，不同的是發(fā)酵溫度為40°C，發(fā)酵時間為6 ；發(fā)酵培養(yǎng)基的 pH 為 6. 95 ；每IL發(fā)酵采用的培養(yǎng)基按照如下方法制備85g葡萄糖、0. 8g硫酸鎂、0. 015g硫酸錳、0. 015g硫酸亞鐵、1. 5g氯化鈉、5. 5g酵母粉、2. 5g硫酸銨、Ig磷酸二氫鉀、Ig磷酸氫二鉀、2. 5g天冬氨酸和水混合，用水補至1L，得到的培養(yǎng)基。分別取方法一得到的各發(fā)酵液離心后的上清液進行高效液相色譜(HPLC) 分析，Agilent 1200液相色譜儀，示差檢測器；BioRad Aminex HPX-87H有機酸柱 (300*7. 8mm)，柱溫 15°C ；上樣量 10 μ 1 ；流動相為 0. 05mM H2SO4 溶液，流速 0. 5ml/min。以 C. acetobutylicum SMB009、C. acetobutylicum SMB009 Δ buk、轉空載體 C. acetobutylicum SMB009 Abuk、轉空載體 C. acetobutylicum SMB009、C. acetobutylicum ATCC824、轉空載體 C. acetobutylicum ATCC824、Clostridium beijerinckii NCIMB 805 和轉空載體 C. beijerinckii NCIMB 8052 為對照。標準品為丁醇、異丙醇、丙酮、乙醇，標準品保留時間各為40分鐘、M分鐘、27分鐘、23分鐘，而樣品在相應時間也有出峰，因此說明樣品中含有丁醇、異丙醇、丙酮、乙醇。結果如下表1所示表1為各重組菌的構建方法及醇產(chǎn)量
1權利要求
1.重組菌，為按照如下8種方法制備的8類重組菌中的任一種1)將次級醇脫氫酶編碼基因、輔酶A轉移酶編碼基因和乙酰乙酸脫羧酶編碼基因?qū)氤霭l(fā)菌B中，得到重組菌8;2)將次級醇脫氫酶編碼基因?qū)氤霭l(fā)菌A中，得到重組菌1；3)將次級醇脫氫酶編碼基因?qū)氤霭l(fā)菌B中，得到重組菌2；4)將次級醇脫氫酶編碼基因和輔酶A轉移酶編碼基因?qū)氤霭l(fā)菌A中，得到重組菌3；5)將次級醇脫氫酶編碼基因和輔酶A轉移酶編碼基因?qū)氤霭l(fā)菌B中，得到重組菌4；6)將次級醇脫氫酶編碼基因和乙酰乙酸脫羧酶編碼基因?qū)氤霭l(fā)菌A中，得到重組菌5；7)將次級醇脫氫酶編碼基因和乙酰乙酸脫羧酶編碼基因?qū)氤霭l(fā)菌B中，得到重組菌6；8)將次級醇脫氫酶編碼基因、輔酶A轉移酶編碼基因和乙酰乙酸脫羧酶編碼基因?qū)氤霭l(fā)菌A中，得到重組菌7;所述出發(fā)菌A為產(chǎn)丙酮丁醇的梭菌(Clostridium)；所述出發(fā)菌B為buk基因敲除的產(chǎn)丙酮丁醇的梭菌(Clostridium)。
2.根據(jù)權利要求1所述的重組菌，其特征在于 所述次級醇脫氫酶的氨基酸序列為序列表中序列6 ； 所述輔酶A轉移酶的氨基酸序列為序列表中序列7 ； 所述乙酰乙酸脫羧酶的氨基酸序列為序列表中序列8。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的重組菌，其特征在于所述次級醇脫氫酶編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列1 ； 所述輔酶A轉移酶編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列2 ； 所述乙酰乙酸脫羧酶編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列3。
4.根據(jù)權利要求1-3中任一所述的重組菌，其特征在于 所述次級醇脫氫酶編碼基因通過重組載體1導入出發(fā)菌A中； 所述次級醇脫氫酶編碼基因通過重組載體1導入出發(fā)菌B中；所述次級醇脫氫酶編碼基因和輔酶A轉移酶編碼基因通過重組載體2導入出發(fā)菌A中；所述次級醇脫氫酶編碼基因和輔酶A轉移酶編碼基因通過重組載體2導入出發(fā)菌B中；所述次級醇脫氫酶編碼基因和乙酰乙酸脫羧酶編碼基因通過重組載體3導入出發(fā)菌A中；所述次級醇脫氫酶編碼基因和乙酰乙酸脫羧酶編碼基因通過重組載體3導入出發(fā)菌B中；所述次級醇脫氫酶編碼基因、輔酶A轉移酶編碼基因和乙酰乙酸脫羧酶編碼基因通過重組載體4導入出發(fā)菌A中；所述次級醇脫氫酶編碼基因、輔酶A轉移酶編碼基因和乙酰乙酸脫羧酶編碼基因通過重組載體4導入出發(fā)菌B中；所述重組載體1為將次級醇脫氫酶編碼基因插入PlTF質(zhì)粒的多克隆識別位點得到的載體；所述重組載體2為將輔酶A轉移酶編碼基因插入所述重組載體1的多克隆識別位點得到的載體；所述重組載體3為將乙酰乙酸脫羧酶編碼基因插入所述重組載體1的多克隆識別位點得到的載體；所述重組載體4為將乙酰乙酸脫羧酶編碼基因插入所述重組載體2的多克隆識別位點得到的載體。
5.根據(jù)權利要求1-4中任一所述的重組菌，其特征在于所述產(chǎn)丙酮丁醇的梭菌(Clostridium)為丙酮丁醇梭菌(C. acetobutylicum)或拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)；所述丙酮丁醇梭菌(C. acetobutylicum)優(yōu)選為丙酮丁醇梭菌(C. acetobutylicum) SMB009 或丙酮丁醇梭菌(C. acetobutylicum) ATCC824 ；所述拜氏梭菌(Clostridium bei jerinckii)優(yōu)選為拜氏梭菌(Clostridium bei jerinckii) NCIMB 8052 ；所述出發(fā)菌B按照如下方法制備將buk基因敲除載體轉入所述丙酮丁醇梭菌 (C. acetobutylicum) SMB009、所述丙酮丁醇梭菌 ATCC824 或所述拜氏梭菌(Clostridium bei jerinckii) NCIMB 8052 中得到的重組菌；所述buk基因敲除載體按照如下方法制備將buk基因特異性的II型內(nèi)含子的核苷酸插入PMTL009的多克隆位點間得到的載體；所述II型內(nèi)含子的核苷酸序列為序列表中的序列5。
6.一種生產(chǎn)醇的方法，包括如下步驟發(fā)酵權利要求1-5中任一所述的重組菌，收集發(fā)酵產(chǎn)物，從所述發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到所述醇，所述醇為下述三種醇中的至少一種丁醇、異丙醇和乙醇。
7.根據(jù)權利要求6所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵溫度為35°C -40°C;所述發(fā)酵溫度具體為35°C、37°C或40°C，所述發(fā)酵時間為 55h-65h，所述發(fā)酵時間具體為5^i、60h或65h ；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的PH為6. 5-6. 95，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH具體為6. 5,6. 75或6. 95 ； 所述發(fā)酵為厭氧發(fā)酵。
8.根據(jù)權利要求6或7所述的方法，其特征在于 每IL所述發(fā)酵采用的培養(yǎng)基按照如下方法制備(75g-85g)葡萄糖、(0. lg-0. 8g)硫酸鎂、(0. 005g-0. 015g)硫酸錳、(0. 005g-0. 015g) 硫酸亞鐵、(0. 5g-l. 5g)氯化鈉、(4. 5g-5. 5g)酵母粉、(1. 5g_2. 5g)硫酸銨、(0. 5-gl. 0g) 磷酸二氫鉀、(0. 5g-l. 0g)磷酸氫二鉀、(1. 5g-2. 5g)天冬氨酸和水混合，用水補至1L，得到的培養(yǎng)基；每IL所述發(fā)酵采用的培養(yǎng)基按照如下方法制備(75g、70g 或 85g)葡萄糖、(0. lg、0· 4g 或 0. 8g)硫酸鎂、(0. 005g、0. Olg 或 0. 015g)硫酸錳、(0. 005g、0. Olg 或 0. 015g)硫酸亞鐵、(0. 5g、l. Og 或 1. 5g)氯化鈉、(4. 5g、5. Og 或 5. 5g)酵母粉、(1. 5g、2. Og 或 2. 5g)硫酸銨、(0. 5g、0. 75g 或 lg)磷酸二氫鉀、(0. 5g、0. 75g 或lg)磷酸氫二鉀、(1. 5g、2. Og或2. 5g)天冬氨酸和水混合，用水補至1L，得到的培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種聯(lián)產(chǎn)丁醇、異丙醇及乙醇的重組菌及其應用。本發(fā)明提供的重組菌，為按照如下8種方法制備的8類重組菌1)將次級醇脫氫酶編碼基因、輔酶A轉移酶編碼基因和乙酰乙酸脫羧酶編碼基因?qū)氤霭l(fā)菌B中，得到重組菌8；2)將次級醇脫氫酶編碼基因?qū)氤霭l(fā)菌A中，得到重組菌1；3)將次級醇脫氫酶編碼基因?qū)氤霭l(fā)菌B中，得到重組菌2。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明構建表達質(zhì)粒psADH、psADH-ctfAB、psADH-ADC或psADH-ctfAB-ADC，同時優(yōu)選電擊轉化的方法，使這三個基因能分別或同時在產(chǎn)丙酮丁醇的梭菌中高效表達。
文檔編號C12P7/04GK102161979SQ20111005000
公開日2011年8月24日 申請日期2011年3月2日 優(yōu)先權日2011年3月2日
發(fā)明者張延平, 戴宗杰, 李寅, 董紅軍 申請人:中國科學院微生物研究所